Preparación de la muestra

Se prepararon cuatro formulaciones de SM donde se utilizó jitomate, tomate, cebolla, ajo, cilantro y chile, que fueron adquiridos en un mercado local de Tepic, Nayarit, México. Los ingredientes fueron previamente lavados, desinfectados y divididos en cuatro grupos, dos de salsas rojas (SR); una de ellas cruda (SRCr) y otra cocinada (SRC) y, otros dos de salsas verdes (SV), una cruda (SVCr) y una cocinada (SVC). Para las salsas cocinadas (SRC y SVC), el jitomate y el tomate se sometieron a cocción (100 °C, 5 min) y posteriormente se adicionaron el resto de los ingredientes para ser homogenizados en conjunto en una licuadora (40s) sin la adición de agua. Así mismo, en las salsas SRCr y SVCr los ingredientes solamente fueron finamente picados y mezclados con una pala de madera. Para la preparación de las SM se siguieron las recetas culinarias de Escobedo-Avellaneda, Pérez-Pérez, Bárcenas-Pozoz, Guerrero-Beltrán & Welti-Chanes (2013) donde se utilizaron las cantidades que se presentan en la Tabla I. Finalmente, las cuatro formulaciones fueron congeladas (-80 °C) para ser liofilizadas (0.035 MBA, -57 °C, LABCONCO, Freezone, EE.UU.), homogenizadas (Nutribullet, NBR-0804B, EE.UU.), tamizadas (0.5 µm) y almacenadas en recipientes herméticos a -20 °C hasta su análisis.

Evaluación de la bioaccesibilidad (%BA) de compuestos fenólicos (CF) de las SM en un modelo de digestión in vitro

Las SM liofilizadas se sometieron a un modelo de digestión in vitro siguiendo la metodología propuesta por ^{Blancas-Benítez, Pérez-Jiménez, Montalvo-González, González-Aguilar & Sáyago-Ayerdi (2018)}. Las muestras se mezclaron con α-amilasa salival (A0521, Sigma Aldrich) a 37 °C durante 2 min. Luego, se adicionó pepsina (300 mg/mL, pH 1.5, P-7000, Sigma Aldrich) a 37 ºC por 1h; considerándolos como los CF presentes en la fracción gástrica (FG). Posteriormente, se llevó a cabo la digestión intestinal donde se adicionó pancreatina de páncreas porcino (5 mg/mL, pH 6.9, P-1750, Sigma Aldrich) durante 6 h y α-amilasa de páncreas porcino (120 mg/mL, pH 6.9, A-6255, Sigma Aldrich) durante 16 h a 37 °C, posterior a ese tiempo se evaluaron los CF presentes en la fracción intestinal (FInt). Después de las hidrólisis, las muestras se centrifugaron para obtener la fracción indigestible soluble (FIS, en el sobrenadante) e insolubles (FII, en el precipitado). El sobrenadante se dializó (D9652, 12-14 KDa, Sigma Aldrich) durante 48 h para simular el transporte pasivo del intestino. Posterior a la diálisis, se determinaron los CF asociados a la FIS, que fueron los que no pasaron a través de la membrana de diálisis. El precipitado se utilizó para determinar los CF asociados a la FII. Los CF de cada una de las etapas de la digestión se sometieron a una extracción de acuerdo a la metodología propuesta por ^{Pérez-Jiménez et al. (2008)} y posteriormente se cuantificaron los fenoles solubles totales (FST) como se describe en uno de los párrafos anteriores. A partir de los datos obtenidos, se determinó el porcentaje de BA (%BA) usando la Ecuación (1):

Donde: CF FInt= los CF liberados en la fracción intestinal; CF FIS= los CF asociados con la fracción indigestible soluble y CF FII= los compuestos asociados a la fracción indigestible insoluble.

Evaluación de la cinética de liberación in vitro de los CF en las SM

Para evaluar la cinética de liberación de los CF se siguió la siguiente metodología (^{Mercado-Mercado, Montalvo-González, González-Aguilar, Álvarez-Parrilla & Sáyago-Ayerdi, 2018}); las muestras liofilizadas de las SM (300 mg c/u) se mezclaron con 30 µL de la enzima α-amilasa salival (A0521, Sigma Aldrich) en 270 µL de tampón de fosfato (0.05 M, pH 6.9), se incubó 2 min a 37 °C. Posteriormente, esto se llevó a 37 °C durante 1 h con 10 mL de tampón de HCl-KCl (0.05 M, pH 1.5) y 0.2 mL de solución de pepsina (300 mg/ mL, P-7000, ≥ 250 unidades/mg, Sigma Aldrich). Después, se ajustó el pH a 6.9 y las muestras se transfirieron a bolsas de diálisis de celulosa (D9652, 12-14 KDa, Sigma Aldrich). Se añadió 1 mL de α-amilasa pancreática (120 mg/mL, A-6255, Sigma) y se ajustó el volumen a 30 mL. Las membranas se colocaron en un recipiente de vidrio con 200 mL de tampón de fosfato (0.05 M, pH 6.9) a 37 °C. Las muestras se incubaron durante 3 h con agitación continua. A intervalos de 30 min, se tomaron alícuotas de 1 mL del dializado a los que se les cuantificó los fenoles solubles totales (FST) y se identificaron los CF liberados por medio de HPLC-DAD-MS. Los parámetros cinéticos de la liberación de los CF durante la digestión in vitro, fueron determinados con la Ecuación (2):

Donde: ΔC= es la diferencia de la concentración del CF inicial y la concentración del CF final, ΔT= es la diferencia de tiempo específico con el tiempo inicial, V_f = es la tasa final de liberación de los CF durante la cinética de liberación (mg EAG/min).

Cuantificación de los fenoles solubles totales (FST) de las SM

El contenido de FST de los extractos de las fracciones digeridas y la cinética de liberación de los CF fue determinada por el método descrito por ^{Montreau (1972)}, con ligeras modificaciones (^{Álvarez-Parrilla, de la Rosa, Amarowicz & Shaidi, 2010}). La reacción se midió en un lector de microplacas de 96 pocillos (Bio-Tek®, Synergy HT, Winooski, VT, EE. UU.) a una longitud de onda de 750 nm, utilizando el software Gen5. El ácido gálico se utilizó como estándar (0.0125-0.2 mg/ml, R² ≥ 0.9997) y los resultados se expresaron en mg de equivalentes de ácido gálico (g EAG / 100 g bs).

Identificación de compuestos fenólicos (CF) por HPLC-DAD-MS de SM

La identificación de los CF se llevó a cabo por el método propuesto por ^{Blancas-Benítez, Montalvo-González, González-Aguilar & Sáyago-Ayerdi (2019)}. Se utilizó un sistema HPLC Agilent Serie 1260 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA., EE. UU.), equipado con un detector de matriz de diodos UV-Vis (DAD). Las muestras (SVC, SVCr, SRC y SRCr) se inyectaron (10 μL, velocidad de flujo 0.4 mL/min) en una columna Poroshell 120 EC-C18 (4.6 mm x 150 mm, tamaño de partícula 2.7 μm, Agilent Technologies). Los eluentes para la identificación de CF fueron ácido fórmico (0.1% v/v, eluente A) y acetonitrilo (100%, eluente B). La separación de los picos de los CF se realizó de la siguiente manera: 0 min, 5% de B; 10 min, 23% de B; 15 min, 50% de B; 20 min, 50% de B; 23 min, 100% de B; 25 min, 100% de B; 27 min, 5% de B y 30 min, 5% de B. La detección se realizó a 280-320 nm. Para el análisis de detección en el espectrofotómetro de masas (MS). Se utilizó un CL/ MS cuadrupolo Agilent 6120 equipado con una interfaz de ionización por electropulverización en modo de ionización negativa con las siguientes condiciones: flujo de gas de secado (N2), 13.0 l/min; presión del nebulizador, 40 psi; temperatura de secado del gas, 350 °C; y voltaje capilar, 3,500 V. El análisis de los datos se realizó usando el software OpenLab CDS ChemStation Edition (Agilent Technologies, Santa Clara, CA., EE. UU.).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el programa STATISTICA, versión 10. Las diferencias en las variables de respuesta se evaluaron mediante un análisis de varianza con un α = 0.05, seguida de una prueba de Fisher LSD para comparación de medias.

Digestión in vitro y %BA de los CF en SM

En la Tabla II se muestran los resultados de la BA in vitro de los CF en las SM. En esta Tabla se observa que los CF liberados durante la FG no presentaron diferencias estadísticas entre las distintas SM (p < 0.05). Dentro de los factores que afectan la liberación de los CF de la matriz del alimento se encuentran, la distribución y tamaño de la partícula, la morfología de la muestra y la estabilidad durante el almacenamiento (^{Zhong et al., 2019}). Además, los cambios de temperatura durante la cocción pueden modificar las paredes celulares de los vegetales, lo que facilita la liberación de los CF (^{Mercado-Mercado et al., 2015}). Así mismo, los movimientos peristálticos, el pH ácido y la acción de la pepsina son factores que favorecen la liberación de los CF (^{Bohn, 2014}). Estudios previos en manzanas han reportado datos de 0.86 g EAG/100gbs de CF en la fase gástrica. En las SM esta liberación fue mayor con valores de hasta 1.50 g EAG/100g bs en la FG (Tabla II). Esta rápida liberación de los CF en el estómago puede maximizar el potencial de absorción en el duodeno y aportar un beneficio a la salud (^{Bouayed, Hoffmann & Bohn, 2011}). Además, la α-amilasa salival puede favorecer la liberación de los CF (^{Fernández-García, Carvajal-Lérida & Pérez-Gálvez, 2009}).

Por otro lado, en la FInt se observaron diferencias significativas entre las SVCr y SRCr, sin embargo, las SVC y las SRC no presentaron diferencia entre sí (Tabla II). El contenido de FST en la FInt aumentó con respecto a la FG, esto se debe a la acción enzimática de la pancreatina y α-amilasa, las cuales actúan conjuntamente en la hidrólisis de los constituyentes en la matriz alimentaria (^{Bohn, 2014}; ^{Blancas-Benítez et al., 2019}). En ese sentido, la SRCr presentó una menor liberación de CF en comparación con la SVCr, esto puede deberse a que la pared celular del jitomate crudo no permite que los CF sean liberados fácilmente y es muy diferente a si está cocinado (^{Georgé et al., 2011}). De tal manera, que algunos CF se liberan más rápido en forma de agliconas que aquellos que están glucosilados y éstos pueden absorberse mejor en el intestino delgado por difusión pasiva y transporte facilitado (^{Bouayed, Deuber, Hoffmann & Bohn, 2012}). La FIS y la FII fueron analizadas para la cuantificación e identificación de los CF asociados a estas fracciones. En las cuatro SM el contenido de los CF asociados a las FIS y FII fue menor que los CF liberados en la FG y la FInt (Tabla II). En la FII se observó un valor más alto que en la FIS, donde la SVC obtuvo mayor contenido 0.65 g EAG/100g bs (Tabla II). Cabe resaltar que las interacciones entre los CF con los componentes de la pared celular de la planta (celulosa, hemicelulosa, pectinas) desempeñan un papel importante en el control de la liberación de los CF en el tracto gastrointestinal (^{Phan et al., 2015}). Los CF que se encuentran en ambas fracciones indigestibles (FIS y FII) se relacionan a los compuestos asociados a la matriz del alimento como son la FD, proteínas y minerales, los cuales, pueden llegar al colon y ser utilizados como sustrato de la microbiota (^{Bohn, 2014}).

Porcentaje de bioaccesibilidad (%BA) de los CF en SM

El %BA de los CF en las SM fue del 50 a 62% (Tabla II). Se han reportado para ingredientes aislados como el chile italiano un %BA entre 50-80% (^{Juániz et al., 2016}) y entre 70% a 80% en jitomate (^{Kamiloglu et al., 2014}). Al parecer el combinar los ingredientes entre sí, tuvo un efecto de disminución de este %BA. Para el caso de la SRC el cocinado promovió una mayor liberación de CF; por el contrario, en la SVC el cocinado promovió un menor %BA. El efecto del proceso de cocción del jitomate es un factor en la liberación de los CF, debido a que el procesamiento térmico altera las membranas y las paredes celulares, como se ha reportado en estudios con jitomates (^{Georgé et al., 2011}). ^{Kamiloglu, Boyacioglu & Capanoglu (2013)} reportaron un aumento de CF como el ácido clorogénico y la naringenina en jitomates cuando se sometieron a una cocción. En ese sentido, en estudios previos se han identificado más compuestos en jitomate que en tomate de cáscara, destacando el ácido gálico y vanílico, rutina y quercetina respectivamente. Además, los resultados para la SVC podrían atribuirse a la presencia de galocatequín galato. Estudios recientes han reportado que algunos CF liberados durante el proceso de digestión, pueden inhibir la actividad de la α-amilasa, lo que impide la hidrólisis de otros enlaces glucosídicos que mantienen los CF, lo que reduce como consecuencia el %BA (^{Wu et al., 2018}).

Identificación de los compuestos fenólicos liberados en cada etapa de la digestión in vitro de las SM

En el Tabla III se muestran los CF identificados en cada fase de la digestión in vitro de las SM. Se encontraron ciertas diferencias entre las etapas de la digestión. En la FG se identificaron ácido clorogénico y ácido gálico, sin embargo, durante la FInt ya no fueron identificados. Esto puede deberse a los cambios estructurales que presentan los CF por los cambios de pH en cada fase de la digestión (pH ácido en FG y pH alcalino en la FInt) y los procesos enzimáticos durante el proceso de digestión. Se ha reportado una absorción del ácido gálico y ácido clorogénico en el tracto gastrointestinal dentro de la primera y segunda hora después de su ingesta (^{Lafay & Gil-Izquierdo, 2008}). ^{Farrell, Dew, Poquet, Hanson & Williamson (2011)}, reportaron una propuesta de biotransformación del ácido clorogénico mediante una esterasa gástrica probablemente presente en la membrana apical, liberando así ácidos hidroxicinámicos, los cuales se difunden pasivamente a través de la superficie celular. Por otro lado, en la FInt se identificaron CF que no se identificaron en la FG (Tabla III), por lo tanto la acción de las enzimas intestinales podrían ser responsables de esta liberación (^{Blancas-Benítez et al. 2018}). Sin embargo, el ácido vanílico y sinápico fueron los únicos que se identificaron en la fracción no bioaccesible. La presencia de catequina, galocatequina y el ácido sinápico en la FInt se reportaron en estudios previos en cilantro y cebolla, los cuales pueden ser la fuente de estos CF (^{Oganesyan et al., 2007}, ^{Simin et al ., 2013}, ^{Liguori et al., 2017}). El ácido p-hidroxibenzoico, la galocatequín galato y el ácido protocatéquico sólo se identificaron en la SVC (Tabla III). Aunque existen pocos estudios sobre el perfil de los CF presentes en el tomate verde, estos compuestos ya habían sido reportados para este fruto (^{Berni, Romi, Parrotta, Cai & Cantini, 2018}; ^{Raffo et al., 2002}), donde aparentemente el cocinado pudo promover la liberación de los CF.

Por otro lado, la mezcla de los ingredientes que conforman las SM influye en el contenido de los FST, en el %BA y, en el perfil de los mismos compuestos, ya que pueden formar matrices complejas entre los CF y otros componentes (fibra dietética, alcaloides, carotenoides), (^{Liu, 2007}; ^{Tomas et al., 2018}). De tal manera, cuando el jitomate y el tomate son sometidos a cocción, algunos CF quedan parcialmente liberados. Notablemente, en nuestro estudio el %BA aumentó en la SRC (Tabla II) y el perfil de los CF identificados fue similar (Tabla III), esto puede atribuirse a que los CF se encuentran en la parte interna del jitomate y al ser cocinado se liberan de las interacciones con los alcaloides (α-tomatina), flavonoides (rutina, narigenina, chalcona) y carotenoides (licopeno, α -caroteno), (^{Tomas et al., 2018}). En cambio, el contenido de FST y el %BA disminuyeron (Tabla II), pero el perfil de los CF aumentó en la SVC (Tabla III). Estos fenómenos pueden deberse a:a) los CF presentes en la cáscara se degradan u oxidan durante el proceso de cocción y por la fuerza mecánica al ser licuados (^{Rodríguez-Arredondo, Maldonado-Garfias, Sosa-Morales & Cerón-García, 2018}), b) por el alto contenido de fibra dietética soluble e insoluble (^{Ostrzycka, Horrowicz, Dobrzanski, Jankiewicz & Bokkowski, 1988}), los CF están unidos por enlaces que hacen que se mantengan protegidos p.e. fibra dietética y, c) estos compuestos son mayormente liberados por la acción enzimática (Tabla III).

Cinética de liberación de los CF en las SM

En el estudio de BA se demostró que existe una cantidad importante de CF liberados de la matriz del alimento, por lo que surgió el interés de analizar la cinética de liberación de los CF de las SM. Los resultados de la determinación del contenido de FST durante la cinética de liberación de los CF se muestran en la Figura 1, donde se obtuvieron velocidades medias de liberación de hasta 3.70 mg de CF/min. El contenido de FST se incrementó con respecto al tiempo, para las SRCr y las SRC la liberación de los CF fue hasta 110 mg EAG/g bs en 180 minutos y 80 mg EAG/gbs para las SVCr y SVC en el mismo tiempo, en ese sentido las enzimas podrían estar liberando paulatinamente los CF de las SM, lo que indica que los CF podrían encontrarse potencialmente disponibles para ejercer un efecto benéfico para la salud (^{Tagliazucchi, Verzelloni, Bertolini & Conte, 2010}). Las SRC y SRCr mostraron una velocidad de liberación mayor que las SVC y SVCr (Figura 1), por lo tanto, la matriz del alimento más que el proceso de cocción, influyó en la velocidad de liberación de estos compuestos. En la Tabla IV se muestra la identificación de los CF durante los 180 min de la cinética de liberación. Algunos CF se liberan más rápido que otros como la galocatequina, el ácido p-hidroxibenzoico y el ácido sinápico. Estos tres CF coinciden con los identificados durante la digestión gastrointestinal en la BA in vitro (Tabla III). Además, las áreas relativas obtenidas de algunos CF van disminuyendo con respecto al tiempo y otros van aumentando con respecto al mismo. Durante los 180 min del estudio de liberación se identificaron tres compuestos para las SVC y SVCr, y cinco compuestos para las SRC y SRCr (Tabla IV).

Figura 1 Cinética de liberación in vitro de los fenoles solubles totales liberados en la salsa roja cocinada (SRC), salsa roja cruda (SRCr), en la salsa verde cocinada (SVC) y en la salsa verde cruda (SVCr).