Material Vegetal

Se recolectaron frutos de color amarillo considerados como frutos maduros, de las especies silvestres de B. pinguin y B. karatas en Santiago Ixcuintla, Nayarit, México. Las características fisicoquímicas de la pulpa de B. pinguin y B. karatas fueron las siguientes: pH, 3.57 ± 0.04 y 3.11 ± 0.04; sólidos solubles, 12.35 ± 0.12 y 16.64 ± 0.14 ºBx; Acidez titulable, 2.45 ± 0.02% y 3.33 ± 0.35%; proteína total, 8.14 ± 0.05% y 7.22 ± 0.03%, respectivamente. Se eliminó la cáscara y semillas del fruto y la pulpa se almacenó a -80 °C (Forma Scientific modelo 926, Ohaio, USA.) hasta su uso. Los concentrados de proteína de soya y leche fueron obtenidos de Nestlé S.A. de C.V.; mientras que la proteína de huevo (ovoalbúmina) fue adquirida en HYCEL de México S.A de C.V.

Extracción de proteasas

Para la extracción de proteasas de cada especie vegetal, se siguió la metodología descrita por ^{Meza-Espinoza et al. (2017)}. El extracto crudo enzimático (CE) de B. karatas se obtuvo con una solución amortiguadora de fosfato-cisteína (solución de fosfato 0.1 M, EDTA 5 mM y cisteína 5 mM ajustada a pH 6.1); mientras que el CE de B. pinguin se obtuvo con una solución amortiguadora de sulfuro de sodio (Na₂S 2 mM y H₂SO₄ 0.2 mM, ajustado a pH 6.1). Todas las soluciones de extracción se mantuvieron en refrigeración (4 °C). Se usaron 50 g de pulpa congelada (-80 °C) de cada especie vegetal; se agregaron 250 mL (1:5 p/v) de cada solución de extracción a temperatura ambiente y se dejó 10 min para descongelación completa. Las mezclas se homogeneizaron, se filtraron y luego se centrifugaron (Hermle Z306, Wehingen, Alemania) a 6,000 xg durante 15 min a 4 °C. Los sobrenadantes (CE) se precipitaron con acetona fría (-20 ° C) en una relación de 1:1 (v/v) añadiendo lentamente el disolvente. La mezcla se mantuvo durante 1 h a -20 °C. El primer precipitado proteínico se separaró por decantación y se eliminó. A cada sobrenadante se añadieron dos volúmenes de acetona fría, respecto al volumen del sobrenadante y se mantuvieron durante 1 h a -20 °C. Los precipitados se separaron por decantación y se centrifugaron a 6,000 xg durante 10 min a 4 °C. Los precipitados fueron considerados como proteasas parcialmente purificadas. Las proteasas obtenidas se liofilizaron usando liofilizador LABCONCO (Modelo 77522020, Kansas, USA) y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

Obtención de hidrolizados

Se usó la metodología propuesta por ^{Natalucci, Brullo, López, Hilal & Caffini (1996)}. Se prepararon soluciones de ovoalbúmina, leche y soya (10 g/L) con una solución amortiguadora de fosfato 0.1 M a pH 7.0 (SAF); luego se calentaron a 90 °C en un baño de agua durante 20 min y se centrifugaron a 12,000 xg durante 10 min. Los sobrenadantes se usaron como sustratos. La obtención de los hidrolizados se llevó a cabo con muestras de 250 mL de cada solución y 25 mL de proteasas liofilizadas (resuspendidas con amortiguador de fosfatos pH 7.0, para tener una concentración de 1.7 mg de proteasas liofilizadas/mL de solución). La mezcla se incubó a 60 °C durante 30, 60 y 120 min. La hidrólisis se detuvo colocando la mezcla de reacción a ebullición durante 10 min. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 16,000 xg a 4 °C durante 10 min. Los sobrenadantes se liofilizaron y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Separación de fracciones peptídicas

La separación de péptidos se llevó a cabo de hidrolizados obtenidos durante 60 min de hidrólisis, usando la metodología de ultrafiltración por membrans (^{Cho, Unklesbay, Hsieh & Clarke, 2004}). Se utilizó una unidad de ultrafiltración (Millipore mini system 8,050, Bedford, MA) con membranas de tamaño de corte de 30, 10, 5 y 1 kDa. El sistema de filtración se trabajó a 1,379 kPa de presión y 4 °C. Se obtuvieron cuatro fracciones peptídicas: ≤ 30 kDa, ≤ 10 kDa, ≤5 kDa y ≤ 1kDa. Las fracciones peptídicas se liofilizaron y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

Determinación de actividad proteolítica

La metodología propuesta por ^{Natalucci, Brullo, López, Hilal & Caffini (1996)} con algunas modificaciones de ^{Meza-Espinoza et al. (2017)} se siguieron para medir la actividad proteolítica de las proteasas parcialmente purificadas. Se utilizó 1 mL de solución de ovoalbúmina (10 mg/mL) como sustrato. Luego, se añadieron al sustrato 200 μL (2.6 mg de muestra liofilizada en 1.5 mL de tampón de fosfato a pH 7.0 o una concentración de 1.7 g/mL) de proteasa. La mezcla de reacción se incubó durante 20 minutos a 37 °C, luego se añadieron 1.8 mL de ácido tricloroacético (50 g/L) para detener la reacción. Las muestras se enfriaron y centrifugaron a 14,000 xg a 4 °C durante 10 min y se midió la absorbancia del sobrenadante a 280 nm. Se preparó un blanco añadiendo TCA a la mezcla de reacción antes de la incubación de la enzima con el sustrato. Una unidad de actividad (U) se definió como los milimoles de tirosina por minuto bajo las condiciones de ensayo anteriores. La actividad específica (EA) se calculó como U/mg de proteína. La proteína total se midió con el método de ^{Bradford (Bradford, 1976)}, mezclando 2.6 mg del liofilizado proteíco con 1.5 mL de tampón de fosfato (0.1 M, pH 7.0). Luego, a 200 μL de la mezcla se añadieron 600 μL del reactivo Bradford y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. La absorbancia se midió a 595 nm (Jenway 6705, Cole-Parmer Instrument Co., Felsted, Reino Unido) y para calular el contenido de proteína se realizó una curva estándar de albúmina de suero bovino.

Inhibición de hemólisis oxidativa (IHO)

El ensayo de IHO, se realizó como lo describe ^{Takebayashi, Chen & Tai (2010)}. Para la obtención de eritrocitos, se utilizaron 5 mL de sangre extraída de cada uno de tres individuos aparentemente sanos. La muestra de sangre se guardó en tubos BD vacutainer con EDTA K2 como anticoagulante. La sangre (2 mL) se centrifugó a 2,500 xg por 5 min a 4 ºC y el sobrenadante fue desechado. Las células sanguíneas aisladas (eritrocitos) fueron lavadas con SAF (1:1, v/v), y se centrifugó a 2,000 xg por 10 min a 4 ºC, nuevamente. Este proceso de lavado se repitió dos veces más. Los eritrocitos se diluyeron con SAF, 10 veces de su volumen original y de esta solución se obtuvo una dilución correspondiente al 1% del volumen original. Se mezclaron 150 µL de eritrocitos con 150 µL de muestra (0.15 mg/mL de hidrolizados o fracción peptídica), se incubó por 1 min a 37 °C y después se agregaron 150 µL de dihidrocloruro de 2,2'- azobis (2-amidinopropano) (AAPH, por sus siglas en inglés) a 400 mM. La mezcla se agitó suavemente, posteriormente se incubó por 2 h a 37°C y se centrifugó a 10,000 xg por 2 min y la absorbancia del sobrenadante fue registrada a 524 nm en un lector de microplacas (SpectraMax M3 Series Multi-Mode Microplate Readers, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Se usó un control positivo, el cual fue preparado mezclando 150 µL de eritrocitos, 150 µL de SAF y 150 µL de AAPH; mientras que el control negativo fue preparado con 150 µL de eritrocitos, 150 µL de SAF y 150 µL de muestra. La IHO se expresó en porcentaje de inhibición y se calculó con la ecuación (1):

En donde: Abs_m= Absorbancia de la muestra; Abs_cp= Absorbancia del control positivo; Abs_cn= Absorbancia del control negativo.

Actividad antimicrobiana

Las cepas utilizadas pertenencen al cepario del Laboratorio de Química y Biotecnología de Productos Lácteos, del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C., dichas cepas inlcuyen Escherichia coli ATCC25922, Salmonella Typhimurium ATCC14028, Salmonella entérica serotipo Choleraesuis ATCC10708, Staphylococcus aureus ATCC29213b y Listeria inoccua ATCC33090. Las bacterias fueron activadas y propagadas inoculando caldo de infusión de cerebro corazón (BHI, por sus siglas en inglés) e incubando a 37 °C por 10 h. Una vez transcurrido el periodo de incubación, las bacterias fueron recuperadas por centrifugación (5,000 xg por 10 min), lavadas 2 veces con 5 mL de SAF y resuspendidas en la misma solución hasta alcanzar una DO_600nm = 0.8 (No. Células 24x10⁸/mL).

Para la determinación de la actividad antimicrobiana de los hidrolizados y fracciones peptídicas se usó el método descrito por ^{Eloff (1998)}. Los hidrolizados y fracciones peptídicas liofilizadas se redisolvieron en SAF a una concentración de (0.15 mg/mL). Se usó un control negativo (80 µL de agua destilada estéril y 100 µL de BHI), un control positivo (40 µL de agua destilada estéril, 40 µL de solución bacteriana ajustada y 100 µL de BHI) y las muestras (40 µL de solución de hidrolizados o fracciones peptídicas con 40 µL de solución bacteriana y 100 µL de caldo BHI). Las mezclas se incubaron a 37 °C por 10 h y después de ese tiempo se midió la absorbancia a 600 nm. Se calculó el porcentaje de supervivencia (Ecuación 2) y después se calculó el porcentaje de inhibición (100 - % de supervivencia) (^{Aguilar-Toalá et al., 2017}).

DO_m = Densidad óptica de la muestra con hidrolizados o fracciones peptídicas; DO_cp = Densidad óptica del control positivo; DO_cn = Densidad óptica del control negativo

Análisis estadístico

Se detectaron efectos significativos (p<0.05) mediante el análisis de varianza (ANOVA) utilizando el software STATISTICA (v.10 StatSoft, Tulsa, Oklahoma, EE.UU.). Se realizaron comparaciones de medias con la prueba de Tukey´s (α=0.05). Cada determinación se realizó al menos tres veces. Los valores se expresaron como media ± desviación estándar.

Actividad proteolítica

La actividad enzimática de las proteasas de B. karatas y B. pinguin proteasas fue de 10.0 y 22.83 U/mg de proteína, respectivamente. Estos resultados confirmaron que las proteasas aisladas estaban activas, aunque las diferencias en las actividades catalíticas de las endopeptidasas dependen de su estructura y las diferencias genéticas de cada especie (^{Headon & Walsh, 1994}).

Inhibición de hemólisis oxidativa (IHO)

En la Tabla I se muestran los resultados de la capacidad de IHO de hidrolizados proteícos. Se encontró que la IHO de todos los hidrolizados fue dependiente del tiempo en el cual se obtuvieron y del tipo de proteasa usada para la hidrólisis de las proteínas evaluadas. La IOH fue alta (66.90-94.36%) en todos los hidrolizados obtenidos. El efecto del tiempo se debe a que las proteasas a 120 min, causaron seguramente un mayor porcentaje de hidrólisis proteíco. Se ha reportado que a mayor grado de hidrólisis, mayor es la variabilidad en tamaño de PB (^{Meza-Espinoza et al., 2017}); así, su funcionalidad o bioactividad puede aumentar debido a que se pueden presentar efectos sinérgicos en la eliminación de los radicales libres y por ende ocurra una mayor actividad de IHO (^{Klompong, Benjakul, Kantachote & Shahidi, 2007}). Las diferencias en la IHO dependiente de las proteasas extraídas por especie vegetal y sustratos usados (p<0.05), se atribuye a la especificidad de cada proteasa, por ende, cada una puede producir hidrolizados con diferentes tamaños de péptidos con diferente composición de aminoácidos (^{Vioque et al., 2006}). ^{Klompong, Benjakul, Kantachote & Shahidi (2007)}, mencionaron que el sustrato y tipo de proteasas utilizadas para la hidrólisis de proteínas juegan un papel muy importante en la determinación del poder biológico de los hidrolizados. Por su parte, ^{Wu, Chen & Shiau (2003)} concluyeron que las diferencias en la actividad biológica de los hidrolizados de proteínas se atribuyen a la composición específica de péptido/aminoácido. ^{Aguilar-Toalá et al. (2017)} reportaron que extractos crudos de péptidos de leche fermentada con especies Lactobacillus plantarum presentaron una actividad de IHO de 36.65-74.45%; lo cual evidencia que los hidrolizados obtenidos en este experimento presentaron mayor IHO.

La capacidad de IHO también se observó cuando se usaron fracciones peptídicas (Tabla II). La IHO fue estadísticamente mayor (p<0.05) cuando se usaron las fracciones ≤5 y ≤1 kDa (91.76 y 90.50%) obtenidas de la hidrólisis de proteína de leche u ovoalbúmina (95.04 y 98.19%) con proteasas de B. pinguin y B. karatas, respectivamente. ^{Aguilar-Toalá et al. (2017)}, reportaron que fracciones de péptidos obtenidos de leches fermentadas con tamaño <10 kDa mostraron una IHO de 40.68-58.84%, mientras que fracciones con tamaño <3 kDa tuvieron una IHO de 22.50-36.65%. ^{Zheng, Dong, Su, Zhao & Zhao (2016)} midieron un 90% de reducción de la hemólisis de eritrocitos humanos cuando se incrementó la concentración de 0.1 mM a 5 mM de dipéptidos. Los autores reportaron que los dipéptidos en el orden de: Trp-Gly > Tyr-Gly > Met-Gly > Cys-Gly, tuvieron un efecto protector en los eritrocitos, sugiriendo que los dipéptidos podrían protegerlos contra daño oxidativo inducido, principalmente por actuar como secuestradores de radicales libres. Esta evidencia sugiere que además del tamaño de los péptidos, la diferencia en la composición de aminoácidos y su concentración influyeron en la IHO. ^{Xiong (2010)} por su parte reportó que la actividad antioxidante se asocia principalmente a la presencia de aminoácidos como cisteína, metionina, tirosina, fenilalanina, triptófano, prolina, lisina entre otros; que permiten una buena acción antiradical y quelante, debido a que estos aminoácidos son capaces de donar electrones o formar complejos con iones metálicos. Esto significa que la actividad antioxidante encontrada en este experimento, dependió probablemente más de la estructura del péptido, que de su tamaño.

La descomposición del AAPH (compuesto usado para medir la IHO) genera radicales peroxilo que inician el proceso peroxidativo, generando a la vez otros radicales libres para inducir la oxidación de los ácidos grasos y proteínas, ocasionando un daño sobre la organización de los eritrocitos y conduciendo eventualmente a lisis de la membrana (^{Pannangpetch et al., 2007}). Actualmente no se conocen del todo los posibles mecanismos subyacentes a la IHO de los extractos y fracciones peptídicas solubles en agua, debido a que los estudios son escasos. Sin embargo, varios estudios han demostrado que aminoácidos, péptidos e hidrolizados crudos, exhiben protección biológica por mecanismos diferentes, como donación o aceptación de electrones y quelación de metales (^{Saidi, Deratani, Belleville & Amar, 2014}); por lo tanto, es posible que los péptidos bioactivos presentes en los hidrolizados y fracciones peptídicas evaluadas en este experimento, podrían ser responsables de la prevención de la hemólisis mediante la capacidad de neutralizar los radicales peroxilo generados en la reacción de medición y posiblemente, que los péptidos tienen la capacidad de inhibir la peroxidación lipídica (^{Abdel-Hamid, Otte, De Gobba, Osman & Hamad, 2017}; ^{Kumar, Chatli, Singh, Mehta & Kumar, 2016}; ^{Liu, Jin, Lin, Jones & Chen, 2015}); no obstante, se requieren mayores estudios para elucidar que la capacidad de IHO de los hidrolizados y cada fracción, está en función de la composición química de cada uno de ellos.

Actividad antimicrobiana

No se encontró inhibición de los patógenos evaluados cuando se trataron con los hidrolizados (Datos no mostrados). Sin embargo, algunas de las fracciones peptídicas tuvieron efecto significativo (p<0.05) contra E. coli, S. aureus, L. innocua, S. Typhimurium y S. Choleraesuis.

En la Tabla III se muestra la actividad antimicrobiana de las fracciones peptídicas obtenidas con proteasas de B. pinguin. Todas las fracciones peptídicas obtenidas de la hidrólisis del concentrado de soya, tuvieron mayor inhibición para S. Typhimurium; aunque la fracción de ≤5 kDa presentó la mayor inhibición (20.59%), las fracciones peptídicas de ovoalbúmina y leche práticamente no tuvieron inhibición contra este patógeno. Las fracciones peptídicas de ≤5, ≤10 y ≤30 kDa, provenientes de la hidrólisis de leche, tuvieron la mayor inhibición para S. Choleraesuis, E. coli, L. innocua y S. aureus; y el microorganismo mayormente inhibido fue L. innocua con 23.79% de inhibición con la fracción peptídica de ≤5 kDa, mientras que S. Choleraesuis tuvo la menor inhibición (4.32%) con la fracción de 30 kDa. ^{Aguilar-Toalá et al., (2017)} encontraron valores de supervivencia de 54.54-92.38% (7.62-45.46% de inhibición) en el mismo tipo de patógenos, que fueron tratados con fracciones peptídicas de <3 y <3-10 kDa obtenidas de leches fermentadas con Lactobacillus plantarum. Esos mismos autores encontraron una mayor inhibición de E. coli (45.50%) y L. innocua (31.44%); mientras que S. Choleraesuis fue la menos inhibida (7.62%). La actividad antimicrobiana está relacionada con el tamaño de los péptidos, algunos reportes mencionan que la presencia de péptidos con 5-7 kDa y <30 kDa tienen la mayor actividad inhibitoria de microorganismos (^{Sadredinamin, Mehrnejad, Hosseini & Doustdar, 2016}; ^{Dziuba & Dziuba, 2014}), el cual coincide con algunos de nuestros resultados.

Hubo una menor inhibición antimicrobiana de las fracciones peptídicas provenientes de la hidrólisis de los sustratos proteícos con B. karatas (Tabla IV). S. Thyphimurium no fue inhibida por la mayoría de las fracciones derivadas de los tres sustratos; sólo se obsevó una inhibición de 3.48% con la fracción peptídica de ≤30 kDa obtenida del hidrolizado de ovalbúmina. Así mismo, S. Choleraesuis, fue poco inhibida y solo las fracciones peptídicas obtenidas de la hidrólisis de leche presentaron una inhibición de 3.56 a 8.56%. Al patógeno E. coli ninguno de los tratamientos lo inhibió. Mientras que a L. innocua todas las fracciones peptídicas de leche y soya le causaron inhibición y la inhibición más alta (18.43%), se midió con la fracción peptídica de ≤1 kDa obtenida del hidrolizado de soya. Finalmente, la fracción peptídica de ≤1 kDa, separada del hidrolizado de ovalbúmina fue la que inhibió a S. aureus en una proporción de 11.46%.

Es conocido que las bacterias gram positivas poseen en su pared celular una capa gruesa de peptidoglucano y ácidos teicoicos con mayor resistencia intrínseca a ser inhibidas que las bacterias gram negativas (^{Chopra & Greenwood, 2001}. Sin embargo, en este experimento, la variabilidad en la actividad antimicrobiana encontrada se atribuye principalmente a los diferentes mecanismos de acción de los AMPs, que dependen de su tamaño, composición en aminoácidos, y características fisicoquímicas (^{Maria-Neto, de Almeida, Macedo & Franco, 2015}; ^{Ghosh & Haldar, 2015}; ^{Reinhardt & Neundorf, 2016}), ya que no hubo una inhibición concluyente entre microorganismos gram negativos o gram positivos. Se ha reportado la naturaleza catiónica de los AMPs, éstos son atraídos por las cargas negativas de la membrana debido a la presencia del ácido lipoteicoico y lipopolisacáridos de los microorganimos, ocurriendo una interacción altamente selectiva, generando poros que causan la liberación de compuestos intracelulares ocasionando la muerte celular (^{Scott, Gold & Hancock, 1999}). Sin embargo, la toxicidad de los AMPs contra células procariontes sigue siendo un tema importante y tiene que ser investigado debido a la diversidad de péptidos que se pueden generar, dependiendo de su origen y las diferentes estructuras microbianas en las que pueden actuar, como bacterias gram negativas o gram positivas (^{Wang et al., 2009}; ^{Huang et al., 2010}). Aunque para la mayoría de los AMPs se describen procesos de permeabilización de la membrana, también pueden actuar utilizando otros mecanismos. Después de entrar en las células patógenas, estos AMPs alcanzan moléculas intracelulares, lo que lleva a la inhibición de la síntesis de la pared celular (^{Brötz, Bierbaum, Leopold, Reynolds & Sahl, 1998}), la inactivación de enzimas (^{Kavanagh & Dowd, 2004}) o interferencia en la síntesis de DNA, RNA y síntesis de proteínas (^{Vineethkumar, Asha, Shyla & George, 2017}; ^{Zhang et al., 2017}).

Por otro lado, el efecto del tipo de proteasas usadas para obtener péptidos con acción antimicrobiana, se atribuye a diferencias en las actividades catalíticas de cada endopeptidasa por cada sustrato (^{Vioque et al., 2006}), como se mencionó anteriormente. Cada proteasa usada en este experimento posiblemente produjo péptidos con diferente tamaño y composición que a su vez tuvieron diferente acción antimicrobiana (^{Klompong, Benjakul, Kantachote & Shahidi, 2007}; ^{Wu, Chen & Shiau, 2003}). Así, se puede deducir que las proteasas de B. karatas son menos efectivas para producir AMPs que las proteasas de B. pinguin; aunque es importante continuar con más investigaciones para soportar esta hipótesis.