El microorganismo y los medios de cultivo

Gluconobacter oxydans es una bacteria Gram negativa perteneciente a la familia Acetobacteraceae, aerobio obligado, usa el oxígeno como aceptor de electrones en su metabolismo respiratorio (^{Hekmat et al., 2007}). La cepa G. oxydans se compró a la Colección Española de Cultivos Tipo - Universidad de Valencia, identificada como CECT 360 y se seleccionó por su capacidad oxidativa frente a sustratos como el glicerol. Se conservó a 4 °C tanto en cajas Petri como en agar inclinado, con repiques bimensuales. Se activó en un medio sólido para bacterias ácido acéticas, rico en fuente de carbono: glucosa, 100 g; extracto de levadura, 10 g; CaCO₃20 g y agar 15 g, disueltos en un litro de agua destilada. Como medio de adaptación se empleó glicerina 20 g/l; extracto de levadura, 10 g/l y agar 20 g/l. En ambos medios el pH se ajustó a 6.0 con tres días de incubación a 30 °C. El medio de producción se preparó con: glicerol 50 y 100 g/l, extracto de levadura 2.5 g/l, NH₄SO₄ 2 g/l, K₂HPO₄ 0.11 g/l, KH₂PO₄ 0.9 g/l, sorbitol 10 g/l, CaCl₂ 1.5 g/l (^{Cardeño et al., 2011}). Se midió el pH inicial hasta alcanzar un valor de 5.3 ± 0.01. Todos los medios se esterilizaron en autoclave por 20 minutos a 121 °C.

Preparación del inóculo

El inóculo se preparó con los reactivos utilizados en el medio de fermentación para un volumen de 40 ml de agua destilada con pH 5.3. Posteriormente se esterilizó en autoclave por 20 minutos. Después se hizo el pasaje celular de la cepa activada y por último se procedió a la incubación en un Shaker (Modelo: IN-666. GEMMYCO), a 30 °C, con 150 rpm de agitación durante 24 h.

Cultivo por lote en matraz Erlenmeyer

Se realizó en 10 matraces Erlenmeyer con capacidad de 100 ml, se utilizó un volumen de 25 ml y un matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio de fermentación para hacer peso seco. Antes de inocularlos se ajustó el pH a 5.3 ± 0.01 y se esterilizaron a 121 °C, 15 min y a la presión normal. Luego a cada matraz Erlenmeyer se le agregaron 0.8 ml de inóculo (^{Claret et al., 1992}), exceptuando el matraz Erlenmeyer de 250 ml, al cual se le agregaron 3.2 ml de inóculo. Posteriormente, se colocaron en el agitador orbital para mantener las condiciones del proceso, temperatura 30 °C y agitación 150 rpm durante un tiempo de 72 h. La toma de muestras se realizó por duplicado, con un lapso de tiempo de 12 h.

Descripción del equipo

El reactor aireado donde se realizaron los ensayos se basó en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con desprendimiento lateral para salida de aire y alimentación del medio rico en sustrato, dos reguladores de flujo, uno para el suministro de oxígeno al medio, y otro para la toma de muestras. Una bomba se usó con flujo de oxígeno máximo de 34.2 l/h, con un flujo de oxígeno suministrado de 25.6 l/h. Este reactor se instaló dentro de un Shaker, que garantizó la estabilidad del proceso fermentativo, manteniendo la temperatura constante y una agitación adecuada.

Cultivo fed-batch

El volumen inicial del cultivo fed-batch fue de 300 ml y se hizo el pasaje celular con un inóculo cultivado durante 24 h. Las condiciones del proceso fermentativo fueron: agitación de 150 rpm, flujo de aireación 1.66 vvm, pH de producción 5.3 ± 0.01, temperatura 30 °C durante 72 horas, y con alimentación constante de 30 ml del medio hasta alcanzar un volumen final de 450 ml cada 12 horas. Se determinó la cantidad de DHA obtenida en cada experimento por duplicado, estableciendo el rendimiento producto/sustrato (^{Cardeño et al., 2011}).

Métodos analíticos

El consumo de glicerol y la producción de DHA se analizaron por cromatografía de gases (GC), en el equipo (AGILENT 4890DGC), inicialmente se realizaron las curvas de calibración de glicerol y DHA para concentraciones de 0-100 g/l. Estas curvas y las lecturas del cromatógrafo de gases, proporcionaron los datos del consumo de glicerol y la formación de producto (DHA) (^{Lijuan et al., 2010}).

La biomasa celular en (g/l) se estimó por densidad óptica a 578 nm en una celda de 2 ml, usando un espectrofotómetro (UV-VIS Scanning Spectrophotometer. Model: Spectro UV-2650. Marca: LABOMED. INC). Con estos datos se generó una curva de calibración de biomasa para la G. oxydans, relacionando la absorbancia con la concentración. La cinética de crecimiento de la bacteria se realizó por el método de peso seco (^{Hekmat et al., 2003}). También, la dihidroxiacetona se determinó por colorimetría en el espectrofotómetro UV-VIS a una longitud de onda de 550 nm, con solución de DNS (3.5 ácido dinitrosalicílico) (^{Claret et al., 1992}). La presencia de DHA se detectó por el color anaranjado presente en las muestras al reaccionar con la solución de ácido dinitrosalicílico (^{Priscilla et al., 2009}).

La separación de DHA del medio líquido se realizó agregando alcohol etílico al medio líquido, donde se suspendió la dihidroxiacetona en el medio y se separó por centrifugación a 2500 rpm por 30 min; el producto obtenido mostró una apariencia pastosa y color blanco hueso. Además se caracterizó de manera cualitativa en un espectrofotómetro UV-VIS y de forma cuantitativa en un cromatógrafo de gases (GC) (AGILENT 4890DGC) y mediante un análisis de FTIR se identificaron los diferentes grupos funcionales característicos de la dihidroxiacetona patrón (Da ^{Silva et al, 2009}) y la obtenida en la presente investigación. El rendimiento producto/sustrato se determinó con los resultados iniciales y finales obtenidos de DHA y el consumo de glicerol por parte de la bacteria.

Cinética de crecimiento

La cinética de crecimiento de la cepa G. oxydans se determinó por densidad óptica en un espectrofotómetro UV-VIS. Estos resultados proporcionaron el tiempo de alimentación para pasar de un proceso discontinuo a un proceso semicontinuo. En la Figura 1 se aprecia cómo la curva de crecimiento de la bacteria para una concentración de glicerol de 50 g/l se pronunció más en comparación con la curva de crecimiento para una concentración de glicerol de 100 g/l, donde la máxima concentración de biomasa que se alcanzó fue de 8.32 y 4.61 g/l, respectivamente.

Figura 1 Curva de crecimiento de biomasa para concentraciones de 50 y 100 g/l de un proceso batch 

En la Figura 1 se observa el lapso de tiempo que duró la fase exponencial, la cual estuvo entre las primeras horas de la fermentación, para las concentraciones de glicerol de 50 y 100 g/l. La fase exponencial se presentó desde las 0 hasta las 22 h, debido a la inoculación previa, el tiempo óptimo para la alimentación se determinó entre las 12 y 15 h por ser la parte más pronunciada de las curvas para ambas concentraciones; por tanto, el tiempo de alimentación elegido fue de 12 h.

Cultivo fed-batch

El cultivo fed-batch se llevó a cabo bajo las mismas condiciones del proceso batch, con alimentación continua de medio fresco rico en glicerol y el oxígeno transferido al medio de cultivo mediante una bomba de aire (Elite 802), suministrando un flujo de 25.65 l/h. Se escogió un tiempo de alimentación de 12 horas, basado en la Figura 1, y tiempo de fermentación por 72 horas.

Crecimiento celular y parámetros cinéticos

En la Figura 2, se observa la curva de crecimiento de biomasa para una concentración de glicerol de 50 g/l y 100 g/l. La concentración de biomasa se duplicó para la primera alimentación en 4.5 g/l a las 12 horas de fermentación, porque hubo mayor asimilación del sustrato. Sin embargo, disminuyó a la mitad con la segunda alimentación a 2.0 g/l. Durante las primeras 24 h, el consumo de glicerol por parte de la cepa alcanzó 72% para una concentración inicial de glicerol de 50 g/l, y se redujo casi a la mitad (42%) para una concentración inicial de 100 g/l; por consiguiente, a altas concentraciones de glicerol la bacteria disminuye su velocidad de consumo debido al efecto inhibitorio del sustrato (^{Acevedo et al., 2015}), ya que altas concentraciones de sustrato dificultan la permeabilidad de la membrana, lo cual limita la entrada de nutrientes (^{Bories et al., 1991}).

Figura 2 Crecimiento de biomasa y consumo de glicerol, para una concentración inicial de sustrato de 50 g/l y 100 g/l 

Concentración de DHA y rendimiento producto / sustrato

Para comprobar que las concentraciones determinadas por el espectrofotómetro UV-VIS se consideren concentraciones reales de DHA, se analizaron las muestras en un cromatógrafo de gases (GC), lo cual confirmó la formación del producto de interés, DHA. La Figura 3 muestra que la bacteria desde las primeras 12 h fue capaz de producir DHA con las concentraciones iniciales de glicerol de 50 y 100 g/l, obteniendo valores de 8 y 6.5 g/l, respectivamente. La generación del producto presentó altos y bajos entre las 48 y 72 h para ambas curvas, debido a que la alimentación del medio fresco aumentó el volumen del caldo de fermentación y la dilución de la dihidroxiacetona en el medio de cultivo. La mayor concentración de DHA alcanzó valores de 47.93 y 42.40 g/l para concentraciones iniciales de glicerol de 50 y 100 g/l, respectivamente. Asimismo, el consumo de sustrato después de transcurridas las 72 h fue de 72 y 57%. Por consiguiente, la producción de DHA al igual que la concentración de biomasa fue inversamente proporcional a la concentración de sustrato, debido al desajuste entre el crecimiento y la producción de DHA, es decir, cuando las células permanecen por mucho tiempo en presencia de altas concentraciones de DHA, la células pierden la habilidad para crecer (^{Bories et al.,1991}).

Figura 3 Concentración de DHA y consumo de glicerol para una concentración inicial de glicerol de 50 y 100 g/l. UV-VIS 

Las Figuras 3 y 4 indican los métodos aplicados para la determinación de la producción de DHA y el consumo de glicerol. En la Figura 3 para la concentración inicial de glicerol de 50 g/l, el sustrato disminuyó rápidamente en la primera alimentación respecto a la concentración inicial de glicerol de 100 g/l. Además, se observa que a mayor consumo de sustrato las concentraciones de DHA aumentaron de forma rápida en el transcurso de las primeras 36 horas, aunque la velocidad de formación del producto fue casi constante para ambas concentraciones de sustrato alimentado

Figura 4 Concentración de DHA y consumo de glicerol para una concentración inicial de glicerol de 50 y 100 g/l. GC 

En la Figura 4 los cromatogramas de las muestras por GC tomadas a las 60 horas, para concentraciones iniciales de glicerol de 50 y 100 g/l, alcanzaron valores muy cercanos de 56.8 y 58.09 g/l de DHA, pero la conversión de glicerol a DHA se detuvo en 9.3 y 42.68 g/l de sustrato residual, respectivamente. Por lo tanto, la concentración de DHA tuvo mayor impacto sobre el crecimiento, que sobre la formación del producto a partir de glicerol (^{Bories et al., 1991}). Además las altas concentraciones de sustrato son inhibitorias para las funciones celulares, debido a la reducción en la actividad del agua y el aumento en la viscosidad del caldo de fermentación, que limitan el crecimiento y la actividad de la enzima glicerol deshidrogenasa (GDH) (^{Lijuan et al., 2010}; ^{Rock et al.,2014}).

Comparando ambos métodos UV-VIS y GC para la determinación de la dihidroxiacetona, los resultados se acercaron con pequeñas diferencias en las muestras tomadas a las 48 y 72 horas. Para una concentración inicial de glicerol de 50 g/l ambos métodos alcanzaron concentraciones de 45.71 y 47.58 g/l de DHA, sin embargo para una concentración inicial de glicerol de 100 g/l, las concentraciones fueron de 46.08 y 57.35 g/l, respectivamente. Los resultados obtenidos son satisfactorios, utilizando el proceso fed-batch con aireación.

En la Tabla 1 se presentan los parámetros de crecimiento de biomasa y producción de DHA, calculados a partir de las curvas de crecimiento de biomasa, consumo de glicerol y producción de DHA reportados en las Figuras 2, 3 y 4. Se calcularon los parámetros cinéticos, como: velocidad específica de crecimiento, rendimiento biomasa/sustrato, velocidad de crecimiento, tiempo de duplicación, rendimiento producto/ sustrato y productividad.

Tabla 1 Parámetros cinéticos obtenidos en el proceso fed-batch 

De la Tabla 1, cuando la concentración inicial de glicerol fue de 50 g/l, hubo un aumento en el rendimiento producto/sustrato de 91%, por otro lado, para una concentración alimentada de 100 g/l fue de 80%, debido a que altas concentraciones iniciales de glicerol reducen la actividad metabólica de la bacteria; por tanto, una mayor concentración de sustrato afecta el rendimiento y la velocidad de producción de DHA. Este resultado es similar a lo reportado por Claret y colaboradores, quienes emplearon diferentes concentraciones de glicerol (51-129 g/l), y obtuvieron un rendimiento producto/sustrato de 92-82%), respectivamente, debido a que el rendimiento varió de forma inversa al contenido de sustrato alimentado. Este fenómeno se atribuyó a una inhibición del crecimiento por aumento en la concentración de sustrato (^{Claret et al., 1992}; ^{Bauer et al., 2005}). Además, altas concentraciones de glicerol (100 g/l) modifican todos los parámetros cinéticos, como la velocidad específica de crecimiento, los rendimientos y las productividades, debido a que la acción del sustrato sobre la actividad biológica no es selectiva (^{Bories et al., 1991}). Estos resultados demuestran el efecto inhibitorio del sustrato durante el transcurso de la fermentación fed-batch. El aumento en la velocidad específica de crecimiento para una concentración de sustrato de 100 g/l, se debe a que las bacterias tuvieron menor tiempo de duplicación y crecieron con mayor facilidad por el aumento en la actividad enzimática. ^{Claret y colaboradores (1992)} indicaron que a mayores concentraciones de glicerol, la máxima velocidad de consumo de sustrato se alcanza en un menor tiempo, y luego permanece constante.

La productividad de DHA aumentó para una concentración de glicerol de 100 g/l, por la gran cantidad de sustrato disponible a degradar por parte de la bacteria logrando una velocidad específica de crecimiento mayor. Esto significó una rápida duplicación celular, pero la cantidad de biomasa fue mayor cuando se utilizó una concentración de glicerol de 50 g/l, en contraste, la fase exponencial se alcanzó a las 36 h para ambas concentraciones. Esto confirma la mayor productividad de G. oxydans en la producción de DHA aplicando otros procesos de fermentación (^{Bories et al., 1991}; ^{Claret et al., 1992}; ^{Hekmat et al., 2007}; ^{Lijuan et al., 2010}; ^{Zhong et al., 2011}).

La Tabla 1 muestra que la mejor producción de DHA se obtuvo a una concentración inicial de glicerol de 50 g/l, debido a que los parámetros cinéticos μ_max 0.07 h-1; Yx/s = 25.55 g/g; Yp/s = 90.54 g/g; Q_x 0.15 g de biomasa/lh; Q_p 0.66 g de producto/lh, son mejores para esta concentración de sustrato alimentado, por la mayor bioconversión de glicerol a DHA y el alto consumo de sustrato por parte de la bacteria.

Comportamiento del pH

La Figura 5 muestra el comportamiento del pH durante las 72 horas de fermentación. El pH inicial se ajustó a 5.3, pero la acidez aumentó con la producción de DHA. El pH se acidificó debido al aumento en la concentración de DHA durante las primeras 36 h, pero después se observó que el pH se mantuvo entre 3.1 y 2.9 unidades, para 50 y 100 g/l de glicerol, respectivamente. Este comportamiento del pH manejando altas concentraciones de sustrato fue similar a la caída del pH para un proceso batch, según lo reportado por ^{Acevedo et al. (2014)}, debido a que la oxidación incompleta del sustrato se favoreció con altas concentraciones de sustrato. Además, el pH es un parámetro importante en procesos industriales, ya que influye en el metabolismo celular y en la permeabilidad de la membrana. ^{Hekmat et al. (2003)} informaron que un pH bajo favorece la producción de DHA y aumenta el rendimiento producto/sustrato para la fermentación con G. oxydans.

Figura 5 Comportamiento del pH para concentraciones iniciales de glicerol de 50 y 100 g/l 

Inhibición por producto (DHA) y sustrato (glicerol)

En la Figura 3 se observa que durante las primeras 60 horas, para los 50 g/l alimentados la concentración de DHA aumentó y permaneció constante hasta terminada la fermentación. Para la segunda alimentación de 100 g/l, la producción de DHA fue menor y después disminuyó. Este comportamiento se debió a que las bacterias dejaron de producir DHA, porque parte del producto se degradó en CO₂ y H₂O, debido a la baja concentración de biomasa en el medio, dando inicio a la fase de muerte de las bacterias en el proceso fermentativo.

Se descartó la disponibilidad de glicerol para degradarse como una explicación para la inactividad metabólica, debido a que la última alimentación de sustrato se realizó a las 60 h; por tanto, quedó glicerol disponible para seguir produciendo DHA. La razón para detener la producción de DHA fue la disminución en el número de bacterias presentes; esto se verificó en las curvas de biomasa para ambas corridas; en la Figura 2 esta pausa del crecimiento bacteriano se presentó en ambos ensayos para concentraciones de DHA entre los 45 y 50 g/l y fue provocado por la alta concentración alcanzada de DHA. A este fenómeno se le llama inhibición por producto. La inhibición se presentó debido a que el DHA juega un papel importante en el crecimiento lento de la bacteria, atribuido a la degeneración morfológica de la célula por la pérdida de estabilidad de la enzima glicerol-deshidrogenasa y al bloqueo continuo en la conversión del glicerol (^{Bories et al., 1991}).

Se observa en las Figuras 2 y 4 que el perfil de concentración para sintetizar DHA concuerda con las curvas de biomasa, este empezó a disminuir luego de las 60 h de fermentación y la pendiente de la curva de concentración de DHA decayó, es decir, la velocidad de producción de DHA se limitó por la muerte de las bacterias en ese lapso de tiempo. La fase estacionaria para la curva de crecimiento de la biomasa comenzó a las 36 h para ambas concentraciones iniciales de glicerol, y la velocidad de crecimiento aumentó a 0.1005 h -1 para 100 g/l en comparación con la de 50 g/l que fue de 0.0732 h-1. La concentración de biomasa para una alimentación inicial de glicerol de 50 g/l alcanzó un valor de 10.6 g/l mientras que para 100 g/l disminuyó a 5.98 g/l. Estos datos indicaron que a mayor concentración de glicerol se presenta el fenómeno de inhibición por sustrato.

Análisis FTIR de la muestra patrón y de la muestra obtenida de DHA

Esta prueba se hizo con el propósito de comparar no sólo el espectro de una muestra patrón de DHA y la muestra obtenida en la presente investigación, sino también la identificación y confirmación de la presencia de dihidroxiacetona. En la Figura 6 se muestran los resultados arrojados por el espectrofotómetro infrarrojo FTIR, con el que se realizó la identificación de los grupos funcionales presentes en la muestra patrón de DHA y la obtenida en la presente investigación.

Figura 6 Análisis FTIR de absorbancia para la muestra patrón de DHA y la obtenida por el proceso fed-batch 

Al comparar la muestra patrón con la muestra obtenida se observan las bandas de frecuencia más representativas de DHA, confirmándose así su presencia. Por otro lado, el análisis reveló que en la muestra se presentaron bandas menores de sustancias ajenas a la DHA. Tales sustancias son residuos de la separación incompleta de la DHA del caldo de fermentación, posiblemente biomasa, nutrientes del medio de cultivo y etanol.

Comparación de parámetros cinéticos con otros estudios

(^{Claret et al., 1992}) reportaron un rendimiento biomasa/sustrato de 3.9% para las siguientes condiciones de operación: agitación 800 rpm, temperatura 28 °C, pH de 6, aireación de 1 vvm y un tiempo de fermentación 20 horas. En esta investigación se alcanzó un rendimiento de 27.54%, con temperatura de 30 °C, pH 5.3, tiempo de fermentación 72 h y la velocidad de agitación y el flujo de aire se controlaron a 150 rpm y 1.66 vvm. ^{Ohrem y Harald (1995)} analizaron que la cantidad de oxigeno consumido por la bacteria es directamente proporcional a la tasa de oxidación de glicerol y a la velocidad de formación de producto. Por tanto, a mayor producción de biomasa mayor será el rendimiento biomasa/sustrato. El aumento en el rendimiento, se atribuyó al modo de operación fed-batch, el cual tuvo mayor flujo de aireación y tiempo de fermentación (Tabla 2).

Tabla 2 Parámetros cinéticos de diferentes investigaciones 

^{Zhong et al. (2011)} reportaron un rendimiento biomasa/sustrato de 3.11%, con las siguientes condiciones de fermentación: agitación 400 rpm, temperatura 30 °C, pH 5, aireación de 1.5 vvm y 72 h de fermentación alcanzando un rendimiento biomasa/sustrato de 24.44%, aunque las condiciones en las que se realizó la fermentación fueron muy parecidas, exceptuando la agitación que fue casi el triple de la manejada en el proceso fed-batch. La disminución en el rendimiento se debió a la presencia de glicerol disponible para la degradación y la baja concentración de biomasa alcanzada en el proceso fermentativo. Como resultado alcanzaron una concentración de DHA de 156 g/l, a una concentración inicial de glicerol de 180 g/l y un rendimiento producto/sustrato de 89.8%, solo 1.2% por debajo del obtenido en la presente investigación (Tabla 2).

^{Bories et al. (1991)} y ^{Lijuan et al. (2010)} manejaron condiciones experimentales idénticas respecto al pH 6 y temperatura de 28 °C, pero variaron agitación y aireación a 800 rpm y 1vvm; 500 rpm y 6 vvm para una cepa mutante, respectivamente. Existe mayor conversión del glicerol a DHA cuando se aumenta la cantidad de oxígeno disuelto en el medio de cultivo, lo cual favoreció las necesidades de oxígeno de la bacteria. El rendimiento producto/sustrato que se logró en la investigación fue de 91%, el cual coincide con Lijuan y colaboradores (2010).

Aunque la cantidad de DHA producida se determinó por cromatografía de gases, su productividad fue baja comparada con los resultados reportados por (^{Claret et al., 1992}; ^{Zhong et al., 2011}), el rendimiento biomasa/sustrato y producto/sustrato se mejoró, debido a los factores físico-químicos utilizados: medio de cultivo, aireación, pH, agitación y temperatura que favorecieron el crecimiento de la célula y la síntesis de producto.