Contenido de humedad de la semilla

El contenido de humedad se determinó en dos muestras de semilla con un peso inicial entre 3 y 4 g, las cuales se colocaron en cajas de aluminio con tapa y se introdujeron en una estufa de secado Riossa^® a 130 °C por 1 h (^{ISTA, 1999}). La semilla se pesó en una balanza analítica marca Edam^® PW124, con aproximación a 0.1 mg. El contenido de humedad se calculó con la fórmula siguiente (^{Kolotelo et al., 2001}; ^{Bonner et al., 1994}):

Grosor de testa

El grosor de testa se midió en cuatro repeticiones de 25 semillas por lote. Las semillas se quebraron con una prensa troqueladora C-Clamp, marca Truper, modelo 17666 PTR-2. Cada semilla se colocó de forma vertical en la prensa con el micrópilo hacia abajo y se ejerció presión moderada hasta fracturar de manera longitudinal la testa de la semilla. La medición se hizo en el trozo mayor de testa. La medición del grosor se realizó en dos extremos opuestos de la testa, a una distancia de 5 mm por encima del micrópilo cerca de la parte media de la testa con un vernier digital marca Mitutoyo, modelo CD-6CS, se obtuvo el grosor promedio.

Imbibición de la semilla

La curva de imbibición de la semilla de los 18 lotes se realizó a través del monitoreo de la ganancia de peso de semillas. Cuatro repeticiones de 15 semillas por lote se colocaron en 100 mL agua destilada a temperatura ambiente en vasos de precipitados. El peso inicial se midió, se monitoreó cada 2 h por 24 h, y después cada 4 h por 20 h adicionales. El peso se cuantificó en una balanza analítica marca Edam^® PW124. El agua de cada muestra se cambió cada 12 h; el porcentaje de absorción obtenido fue el peso acumulado de la semilla por unidad de tiempo con respecto al peso inicial de la semilla.

Viabilidad de la semilla

Cuatro repeticiones de 25 semillas se utilizaron de cada lote. La testa se eliminó, y los embriones y megagametofito se remojaron por 12 h en agua destilada. En el megagametofito se realizó un corte longitudinal con un bisturí #4 para saturar el embrión en una solución al 1 % de 2, 3, 5 cloruro de tetrazolio (TZ), en cajas de Petri de vidrio. Las cajas con las muestras se colocaron por 24 h en la obscuridad en bolsas aluminizadas que evitan el paso de la luz a temperatura ambiente. Las semillas se clasificaron como viables cuando el megagametofito y embrión se tiñeron en tono rojo intenso (^{Kolotelo et al., 2001}).

Germinación

Previo a la prueba de germinación, la semilla se desinfectó en una solución de hipoclorito de sodio (0.25 %), con cloro comercial Cloralex^® con una inmersión de 5 min más un lavado abundante con agua corriente. La testa se escarificó con peróxido de hidrógeno al 3 % (v:v) por 2 min y la semilla se remojó en agua destilada por 12 h previo a la prueba de germinación. Las semillas se colocaron sobre tela de algodón dentro de cajas de plástico rígido transparente de 20 x 27 x 12 cm con tapa de cierre hermético; se instalaron separadores plásticos entre tratamientos y se agregaron 75 mL de agua destilada, y se asperjó una solución fungicida de Captán al 0.2 %. Las cajas con la semilla se colocaron en una cámara con temperatura diurna de 24 a 26 °C y nocturna de 22 a 24 °C.

Las semillas germinadas se registraron cada día por 35 d. Cuando el tamaño de la raíz fue similar a la longitud de la semilla se consideró germinada. Las variables calculadas fueron la capacidad de germinación (CG), valor pico (VP), día que se alcanzó el valor pico (DVP), y tiempo en lograr el 50 % de la germinación total (GERM50) con las fórmulas siguientes:

CG (%) = (semillas germinadas/semillas totales)^*100

VP = MAX Σ Germinación/días (^{Kolotelo et al., 2001}).

DVP (día) = día de la prueba en que la germinación acumulada dividida entre los días transcurridos fue el máximo (^{Kolotelo et al., 2001}).

GERM50 (días) = número de días en alcanzar el 50 % de la capacidad germinativa.

Diseño experimental y análisis estadístico

En la prueba de germinación se usó un diseño completamente al azar con 20 repeticiones conformadas por diez semillas cada una de cada tratamiento (Cuadro 2). Previo a los análisis estadísticos los datos de capacidad germinativa y viabilidad se estandarizaron, por ser información expresada en porcentaje, y los datos de porcentaje se transformaron con la función arcoseno de la raíz cuadrada de p (θ=arcoseno √p, donde θ es el dato transformado y p es el valor de capacidad germinativa o viabilidad). Esta transformación se aplica a datos entre 0 y 1 para mejorar su distribución normal (^{Sokal y Rohlf, 1981}). Todos los análisis estadísticos se realizaron con el procedimiento Mixto (^{SAS Institute, 2003}). No hubo diferencias en ninguna variable entre años y este factor no se consideró en los modelos estadísticos usados; así, algunas combinaciones color-especie, o procedencias-especie tuvieron más repeticiones.

Los modelos usados para el análisis para probar diferencias entre especies y procedencias fueron:

donde Y_ijkl es el valor observado del l-ésimo lote de cierto color de testa de la k-ésima procedencia de la j-ésima especie en la i-ésima repetición, µ es la media general, R_i es el efecto aleatorio de la i-ésima repetición, E_j es el efecto fijo de la j-ésima especie, RE_ij es el efecto aleatorio de la interacción de la i-ésima repetición con la j-ésima especie, P_k(j) es el efecto fijo de k-ésima procedencia dentro de la j-ésima especie, RP_ijk es el efecto aleatorio de la interacción del i-ésima repetición con la k-ésima procedencia dentro de la j-ésima especie, y E_ijkl es el error experimental.

Para probar diferencias entre colores de la testa, el análisis se realizó por especie con el modelo:

donde Y_ijk es el valor observado del k-ésimo lote de cierta procedencia del j-ésimo color de testa de la semilla en la i-ésima repetición, m es la media general, C_j es el efecto fijo del j-ésimo color de testa de la semilla, RC_ij es el efecto aleatorio de la interacción de la i-ésima repetición con el j-ésimo color de testa, y E_ijk es el error experimental.

Contenido de humedad y grosor de testa

Entre especies, procedencia y color de testa no se encontraron diferencias significativas. El contenido de humedad para P. cembroides fue 0.33 % mayor que en P. orizabensis (Cuadro 3). Los valores medios del contenido de humedad de semillas con diferente color de testa variaron de 7.24 a 9.64 %. Las semillas del género Pinus son ortodoxas ya que toleran contenidos bajos de humedad (5-8 %) y conservan su viabilidad por periodos prolongados de almacenamiento con temperatura controlada y embalaje adecuado (^{Bonner et al., 1994}).

Las diferencias en el grosor de testa de semilla fueron significativas (p≤0.01) entre especies, procedencias y color de testa. El grosor de la testa fue mayor en semillas de P. cembroides y esto pudo influir en la menor absorción de agua, al dificultar la imbibición (Cuadro 3). El grosor de la testa de las semillas negras fue menor en ambas especies por lo que probablemente absorbieron agua con mayor facilidad. ^{Farjon y Styles (1997)} reportan un mayor intervalo de grosor de testa en P. orizabensis, de 0.7 a 1.1 mm, que en P. cembroides de 0.6 a 1.0 mm.

Imbibición de la semilla

Las semillas absorbieron agua de forma rápida, P. cembroides alcanzó 10 % de su peso inicial y 12.7 % las de P. orizabensis en las primeras dos horas. Después, la tasa de absorción disminuyó, pero fue mayor en las de P. orizabensis. La absorción de agua fue 25 % a las 24 h en las semillas de P. cembroides, y a las 16 h en las de P. orizabensis. Al final de la prueba (44 h), las semillas de P. cembroides y P. orizabensis alcanzaron 32.4 % y 37.6 % de absorción, respectivamente (Figura 1). La absorción mayor con velocidad más alta de la semilla de P. orizabensis se puede deber a que el grosor de su testa fue 0.1 mm más delgada que la de P. cembroides.

Figura 1 Imbibición acumulada de semillas de Pinus cembroides y P. orizabensis. 

El contenido de humedad inicial puede influir en el periodo de imbibición de la semilla (^{Mápula et al., 2008}); en nuestro estudio fue 7.8 % para P. cembroides y 7.4 % en P. orizabensis y, por lo tanto, la absorción fue mayor en P. orizabensis cuya semilla era menos húmeda. Un remojo en agua corriente por 24 a 48 h es adecuado para promover la imbibición total de las semillas y este periodo varía entre especies de coníferas, pero las semillas de algunas especies pueden sufrir daños por un remojo prolongado (^{Landis et al., 2014}). En los viveros de México, la semilla se sumerge 12 o hasta 18 h antes de la siembra. Nuestros resultados indicaron que el periodo de imbibición debió incrementarse en estas semillas, y se cuidó que la sobreexposición a la inmersión no tuviera un efecto adverso en las semillas como la aparición de patógenos y la falta de oxigenación (^{Landis et al., 2014}). La germinación mejoró cuando las semillas se remojan en agua corriente por 48 h en las semillas de P. edulis Engelman (^{Ronco, 1990}).

Las semillas negras de P. cembroides absorbieron agua con mayor rapidez: 25 % de absorción en 22 h, y 28 h para las semillas pardas (Figura 2). Las semillas negras de P. orizabensis llegaron a 25 % en 14 h, y para las pardas y bicolores 16 h y 20 h, respectivamente (Figura 3).

Figura 2 Imbibición acumulada de semillas de Pinus cembroides con testa de color diferente. 

Figura 3 Imbibición acumulada de semillas de Pinus orizabensis con testa de color diferente. 

Viabilidad de la semilla

Las diferencias para viabilidad de las semillas no fueron significativas (p>0.05) entre especies, procedencias o color de la testa. La viabilidad fue alta en semillas de ambas especies: 93.5 % en P. cembroides y 90.8 % en P. orizabensis (Cuadro 4). Los valores máximo y mínimo de viabilidad entre procedencias se registraron en semillas de P. cembroides recolectadas en Cadereyta (98 %) y Colón (89 %). Los valores de viabilidad fueron altos para semilla recién recolectada y en aquellas almacenadas en refrigeración por un año.

Germinación y vigor de la semilla

Entre especies hubo diferencias significativas para la capacidad germinativa (CG), valor pico (VP) y en los días para alcanzar el 50 % de germinación (GERM50), pero no para los días necesarios para alcanzar el valor pico (DVP). Sin embargo, las diferencias fueron significativas entre procedencias para las cuatro variables (Cuadro 5).

La capacidad germinativa de semillas de P. cembroides fue mayor que la de P. orizabensis (Figura 4, Cuadro 6), y la germinación de la semilla de P. cembroides fue más rápida según el menor número de días para lograr el 50 % de germinación. El valor pico muestra que las semillas de P. cembroides tienen mayor vigor, pero los días para alcanzar el valor pico indicaron una velocidad similar (Cuadro 6).

Figura 4 Germinación de semillas de Pinus cembroides y P. orizabensis. 

En P. cembroides, la semilla recolectada en Cadereyta germinó entre 8 y 13 % más que las de Santiago de Anaya y Colón (Figura 5). Sin embargo, la velocidad de germinación fue mayor en Colón, 1.4 d y 3.4 d de antelación para alcanzar el 50 % de germinación, en comparación con las otras dos localidades. El valor pico muestra mayor vigor en las semillas de Colón y Cadereyta, y la semilla de Santiago de Anaya es la de menor vigor.

Figura 5 Germinación de semillas de diferentes procedencias de Pinus cembroides. 

En P. orizabensis la germinación en promedio fue más homogénea y la diferencia entre los valores extremos de CG fue 5 %. La de El Carmen tuvo la germinación mayor (Figura 6), pero fue más lenta en germinar y con menor vigor, alrededor de 1 d de diferencia para alcanzar el 50 % del total germinado. Altzayanca mostró más vigor de acuerdo con el valor pico, pero Tepeyahualco presentó mayor rapidez en alcanzar el valor pico.

Figura 6 Germinación de semillas de diferentes procedencias de Pinus orizabensis. 

La capacidad germinativa de P. cembroides fue mayor en nuestro estudio que el valor reportado para semilla de la misma especie recolectada en el Ejido la Amapola en San Luis Potosí, donde alcanzó 81 % (^{Sandoval et al., 2000}). También la capacidad germinativa de la semilla de P. orizabensis en nuestra prueba fue superior al de la misma especie (48 %) recolectada en Altzayanca Tlaxcala (^{Sánchez et al., 2005}); además, ellos señalan que la germinación inició 30 d después de instalado el experimento en invernadero en agrolita, a diferencia de nuestro estudio en el cual se inició desde el sexto día.

En ambos pinos hubo diferencias significativas en la capacidad de germinación entre los colores de testa (Cuadro 7). Las semillas de color pardo tuvieron 5.5 % más germinación que las negras en P. cembroides y 8.4 % más en P. orizabensis, en esta especie la germinación es similar para las de testa bicolor y las negras (Cuadro 8; Figura 7). Sin embargo, sólo en P. cembroides hubo diferencias en los días para alcanzar 50 % de germinación y en el número de días para el valor pico (Cuadro 7). Las semillas con testa de color pardo tienen mayor germinación, pero las de color negro germinan más rápido en P. cembroides, con menos días para el 50 % de germinación y alcanzar el valor pico, lo cual no ocurrió en P. orizabensis (Cuadro 8; Figura 8).

Figura 7 Curva de germinación de semillas cembroides con testa de color diferente. 

Figura 8 Curva de germinación de semillas de Pinus orizabensis con testa de color diferente. 

^{Martínez et al. (1987)} observaron que semillas de P. johannis con diferente color de testa no presentaron diferencias significativas en viabilidad, pero la germinación de semilla moteada fue 36.5 %. Este valor es un tercio del registrado en P. cembroides y P. orizabensis, con semilla de tono pardo parda o moteada (más de 90 % en ambas especies). Los mismos autores indican que las semillas con testa clara y negra tuvieron una germinación de 84 y 79 %. Para el estudio de P. cembroides y P. orizabensis la semilla de testa color negro fue la de menor capacidad germinativa, 87 y 81 %, respectivamente. En P. sylvestris L. no se reportan diferencias en la germinación según el color de la semilla y cada árbol produce diferentes colores de testa (^{Kaliniewicz et al., 2013}).

Las semillas de P. cembroides presentaron un grosor mayor de testa y una tasa menor de absorción de agua, y, contrario a lo esperado, germinaron en mayor cuantía y con mayor velocidad de germinación que las semillas de P. orizabensis. Una predicción podría ser que las semillas que absorben agua con mayor rapidez como las de P. orizabensis, germinen más rápido, pero es posible que algún mecanismo fisiológico esté involucrado en la rápida germinación de P. cembroides, y esta característica de respuesta fisiológica pudiera ser de carácter adaptativo oportunista. Lo anterior confirma la existencia de diferencias morfológicas y adaptativas que merecen la distinción y manejo como taxa diferentes, en particular en la repoblación que se efectúan en el país.

Los resultados de viabilidad y germinación indicaron ausencia de latencia en la semilla de ambas especies a pesar del grosor de la testa, que se compone principalmente de células muertas y actúa como una cubierta protectora para los tejidos vivos interiores (^{Kolotelo et al., 2001}). Las semillas sólo presentaron quiescencia, y germinan cuando las condiciones ambientales son adecuadas (^{Baskin y Baskin, 2004}).