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Introducción
Las concentraciones atmosféricas de gases de efecto invernadero (GEI) aumentaron con las actividades antropogénicas (IPCC, 2007), por lo que se consideran precursores del cambio climático (Smith et al., 2007; Kumar, 2012; Hill et al., 2016). La ganadería contribuye con 18 % de las emisiones globales de GEI, y el metano (CH4) entérico producido por los rumiantes representa 37 % de la producción antropogénica total (Steinfeld et al., 2006; Key y Tallard, 2012; Kumar et al., 2014). El CH4 se produce durante la fermentación ruminal de los alimentos y representa de 2 a 15 % de la energía consumida (Kumar et al., 2009; Eckard et al., 2010). La eficiencia de la energía consumida por el rumiante depende de la genética del animal, condiciones ambientales, calidad y cantidad de alimento suministrado (Shibata y Terada, 2010; Kumar et al., 2014).
El uso de semillas oleaginosas en la alimentación de rumiantes se debe al contenido de energía, proteína y ácidos grasos poliinsaturados (Matthäus y Luciana., 2003). Las semillas de oleaginosas, como las de girasol (Helianthus annuus), reducen 13 % la emisión de CH4 (Beauchemin et al., 2009), no afectan la digestibilidad, la fermentación ruminal (Soder et al., 2013; Vanegas et al., 2017), ni el contenido de ácidos grasos en leche de ovejas (Zhang et al., 2006). Chuntrakort et al. (2011) mostraron una reducción de 9 % de CH4 en bovinos al dar un suplemento con semilla de algodón, semilla de girasol y pulpa de coco.
El cambio climático y la pérdida de energía durante la fermentación ruminal de los alimentos aumenta el interés por encontrar diferentes alternativas biotecnológicas que minimicen la producción de CH4 entérico (Eckard et al., 2010; Patra 2012). Por lo anterior, el objetivo de nuestro estudio fue determinar in vitro la producción de CH4, CO2 y las características fermentativas en dietas para corderos con diferentes niveles de semilla de girasol.
Materiales y métodos
Localización del área de estudio
El estudio se realizó en los laboratorios de Nutrición Animal y Microbiología Ruminal y Genética Microbiana del Posgrado en Recursos Genéticos y Productividad - Ganadería, Campus Montecillo del Colegio de Postgraduados, Estado de México.
Tratamientos
Los tratamientos (Cuadro 1) se elaboraron con base en el National Research Council (NRC, 2007) para cubrir los requerimientos nutricionales de corderos en crecimiento. Los ingredientes antes de elaborar las dietas se molieron en un molino Thomas Wiley Mill (Thomas Scientific®, Swedesboro, NJ, USA) con malla de 1 mm.
Cuadro 1 Composición y análisis bromatológico de los tratamientos.
| Ingredientes | T1 | T2 | T3 | T4 |
| Composición (g kg-1 MS) | ||||
| Alfalfa | 100 | 80 | 80 | 80 |
| Maíz grano | 500 | 500 | 500 | 520 |
| Rastrojo de maíz | 160 | 150 | 150 | 120 |
| Pasta de soya | 60 | 30 | 30 | 0 |
| Semilla de girasol | 0 | 60 | 120 | 180 |
| Salvado de trigo | 160 | 160 | 100 | 80 |
| Premezcla mineral | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Composición química | ||||
| Materia seca, % | 93.81 | 93.25 | 93.48 | 93.95 |
| Proteína cruda, % | 14.23 | 14.15 | 14.47 | 14.27 |
| Extracto etéreo, % | 1.96 | 1.98 | 2.06 | 2.16 |
| Fibra detergente neutro, % | 35.65 | 33.63 | 34.23 | 37.82 |
| Fibra detergente ácida, % | 18.59 | 19.59 | 21.57 | 22.29 |
| Cenizas, % | 7.09 | 6.71 | 6.40 | 6.27 |
T1= 0 % de semilla de girasol; T2= 6 % de semilla de girasol; T3= 12 % de semilla de girasol; T4= 18 % de semilla de girasol
Análisis bromatológico
En las dietas experimentales se determinó materia seca (MS), proteína cruda (PC), cenizas (Ce) y extracto etéreo (EE) según AOAC (2005). La fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácida (FDA) se cuantificaron mediante un analizador ANKOM (200/220, USA) con base en el método de Van Soest et al. (1991).
Medio de cultivo
El medio de cultivo contenía 52.6 mL de agua destilada, 30 mL de líquido ruminal clarificado [filtrado con gasa, centrifugado a 20,817 xg por 15 min en una centrífuga (Eppendorf 5804, Alemania) y se esterilizó 15 min a 121 °C y 15 psi en una autoclave (Tuttnauer 2540, Israel)], 5mL de solución mineral I [6 g K2PO4 (Sigma) por 1000mL H2O destilada], 5mL de solución mineral II [6 g K2PO4; 6 g (NH4)2SO4 (Merck); 12 g NaCl (Sigma-Aldrich), 2.45 g MgSO4 (Sigma) y 1.6 g CaCl-2H20 (Sigma) por 1000 mL de H2O destilada], 5mL Na2CO3 (Merck) en solución 8 % [8 g Na2CO3 (Merck) en 100 mL H2O destilada], 2 mL solución de sulfito de cisteína [2.5 g L-cisteína (Sigma) disuelta en 15 mL NaOH (2N) y 2.5 g Na2S-9H2O (Meyer) en 100 mL H2O destilada], 0.1 mL resarzurina al 0.1 % [p/v; 0.1 g resarzurina (Sigma-Aldrich) en 100 mL H2O destilada], 0.2 g peptona de soya y 0.10 g extracto de levadura (Sánchez-Santillán y Cobos-Peralta, 2016; Ley-de Coss et al., 2016).
Trampas para captura de biogás
Los viales trampa se prepararon colocando una solución salina saturada [350 g NaCl (sal común) en 1 L H2O destilada y 5 mL naranja de metilo (Meyer) a 0.1 %] en viales serológicos (120mL). El pH de la solución salina saturada se ajustó con un potenciómetro (Thermo Scientific® Orion 720A) a pH 2 con HCl (2N). Las trampas se mantuvieron a temperatura ambiente hasta su uso.
Biodigestores
En viales serológicos (120 mL) se colocaron 0.5 g de muestra de un tratamiento y se esterilizaron 15 min a 121 °C y 15 psi. A cada vial se adicionaron 45 mL de medio de cultivo estéril según la metodología de Cobos y Yokoyama (1995), bajo flujo de CO2, para mantener condiciones de anaerobiosis. Los biodigestores se colocaron en una incubadora (Riosa® EC-7, México) 72 h a 39 °C, para comprobar esterilidad. Los biodigestores se inocularon con 5mL de líquido ruminal fresco (se filtró con tres capas de gasa y centrifugó 3 min a 1,257 xg) y se incubaron 72 h a 39 °C.
Los biodigestores se conectaron a un vial trampa mediante una manguera de Taygon® (2.38 mm Ø interno y 45 cm de longitud) con agujas hipodérmicas (20 G x 32 mm) en los extremos. En el vial trampa se colocó una aguja (20 G x 32 mm) de manera oblicua como válvula de escape y se colocó invertido sobre una probeta modificada de 50 mL.
Producción de biogás
La producción de biogás se midió como el desplazamiento de la solución salina saturada a 24, 48 y 72 h de incubación. La proporción de CH4 y CO2 se determinó del biogás producido a las 72 h contenido en el vial trampa por cromatografía de gases. Esta se hizo en un cromatógrafo (PerkinElmer® Claurus 500, EUA) equipado con un detector de conductividad térmica y una columna empacada Porapak®. Las condiciones de análisis fueron: temperatura de horno, detector y columna de 80, 130 y 170 °C; helio como gas acarreador (22.3 mL min-1) y volumen de inyección de 300 µL. Los tiempos de retención fueron 0.73 y 1.05 min para CH4 y CO2. La concentración molar de CH4 y CO2 se estimó sustituyendo los mL de gas producidos en la ecuación general de gases ideales (Posadas y Noguera, 2005).
Características fermentativas
La degradación in vitro de la MS (DEGMS) a las 72 h de incubación se obtuvo al filtrar el contenido de los biodigestores en bolsas ANKOM® (F57). Las bolsas con la materia no degradada se secaron 48 h a 60 °C en una estufa (RIOSSA® HCF-41, México). La DEGMS se calculó por diferencia de peso. Las bolsas ANKOM® se sellaron por calor y se colocaron en un analizador de fibras con base en el método de Van Soest et al. (1991) para estimar FDN y FDA. El porcentaje de degradación de la FDN (DEGFDN) se calculó con la fórmula DEGFDN = (FDN inicial - FDN residual / FDN inicial)* (100). En la degradación de FDA (DEGFDA) se usó una fórmula similar a la de DEGFDN (Hernández-Morales et al., 2018).
El conteo total de bacterias se obtuvo al colocar 1mL de la parte líquida del biodigestor con 72 h de incubación en tubos de ensaye (Pyrex®) 13x150 mm con 0.25 mL de formaldehido (Sigma Aldrich) al 10 %. Este se realizó con la técnica de conteo directo en una cámara Petroff-Hausser® (Hausser #39000, Electron Microscopy Sciences, EUA) y un microscopio (Olympus® EX51, EUA), a una magnificación de 1000X. El conteo total de bacterias se calculó con la ecuación: conteo total de bacterias = (promedio) (factor de dilución; 2x107) (Sánchez-Santillán et al., 2016; Sánchez-Santillán y Cobos-Peralta, 2016).
Una alícuota de 1mL de la parte líquida del biodigestor se tomó a las 72 h de incubación y se colocó en tubos para microcentrífuga (Eppendorf) con 0.25mL de ácido metafosfórico (Meyer) al 25 % (relación 4:1). Los tubos se centrifugaron a 20,817 xg en una centrífuga (lletich zentrifuguen® EBA-21, Alemania) y el sobrenadante se transfirió a viales para cromatografía (1.5 mL, Perkin Elmer®, EUA). El análisis de ácidos grasos volátiles (AGV) se realizó en un cromatógrafo (PerkinElmer® Claurus 500, EUA) equipado con un detector de ionización de flama (FID). Las condiciones de análisis fueron: 1µL de volumen de inyección; columna 15 m de longitud x 0.32 mm de diámetro interno, espesor de la película de 0.25µm, límites de temperatura de 40 a 250 ° C (Elite FFAP PerkinElmer®, EUA); temperatura de 80, 250 y 140 °C en horno, inyector y columna; nitrógeno como gas acarreador (flujo 8 mL min-1); H2 y O2 como gases para generar flama (flujo 45 y 450 mL min-1). Los tiempos de retención fueron 1.26, 1.50 y 2.09 min para acetato, propionato y butirato (Cobos et al., 2011).
Análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar (ocho repeticiones independientes). Los datos se analizaron con el procedimiento GLM de SAS® (2011). Los valores medios se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05) y se analizaron mediante polinomios ortogonales para efecto lineal y cuadrático.
Resultados y discusión
Las concentraciones de CH4 y CO2 (Cuadro 2) no presentaron diferencias entre tratamientos (p>0.05). Mao et al. (2010) mencionaron que la producción de metano entérico en dietas que incluyen semilla de girasol aumenta rápidamente después de la alimentación y disminuye lentamente hasta la siguiente alimentación. Lo anterior justifica los resultados de nuestro estudio porque se midió el CH4 a las 72 h de incubación, lo que ocasionó una cuantificación baja de CH4 y sin diferencias entre tratamientos (p>0.05). Además, la síntesis de acetato y butirato en el rumen incrementa la producción de H2 y, como consecuencia, las arqueas metanogénicas aumentan la producción de CH4 al utilizar el H2 y el CO2 como fuente de energía (Widiawati y Thalib, 2007; Kim et al., 2012; Chuntakort et al., 2014).
Cuadro 2 Producción de CH4 y CO2 in vitro (mM g-1) a las 72 h en dietas integrales para corderos que incluye cuatro niveles de semilla de girasol.
| Tratamiento | CH4 | CO2 |
| T1 | 0.82 | 7.32 |
| T2 | 0.94 | 7.65 |
| T3 | 0.78 | 6.87 |
| T4 | 0.70 | 6.96 |
| EEM | 0.06 | 0.39 |
| Lineal | 0.07 | 0.30 |
| Cuadrático | 0.12 | 0.76 |
a,b,c,d, Valores promedio con distinta letra en una columna son estadísticamente diferentes (p≤0.05)
T1= 0 % de semilla de girasol; T2= 6 % de semilla de girasol; T3= 12 % de semilla de girasol y T4= 18 % de semilla de girasol. EEM: Error estándar de la media; CH4: metano; CO2: dióxido de carbono
La DEGMS a las 72 h de incubación (Cuadro 3) presentó diferencias entre tratamientos (p≤0.05). T2, T3 y T4 disminuyeron (p≤0.05) 3, 5.4 y 8 % la DEGMS respecto a T1 por el efecto lineal entre tratamientos (Cuadro 3), lo que pudo estar relacionado directamente con el contenido de fibra de la semilla y su contenido de grasa. Estos resultados son similares a los de Beauchemin et al. (2009), quienes reportaron una disminución en la digestibilidad de la MS y materia orgánica de 8 a 20 % al usar semillas de colza (9 %) y girasol (10 %) trituradas o grasa protegida con sales de calcio en dietas para vacas.
Cuadro 3 Características fermentativas en dietas integrales para corderos que incluye cuatro niveles de semilla de girasol a 72 h de incubación.
| Tratamiento | DEGMS, % | DEGFDN, % | DEGFDA, % | [Bacterias] |
| T1 | 88.80a | 79.24a | 69.70a | 7.5 x 109 |
| T2 | 86.18b | 73.07b | 62.44b | 6.8 x 109 |
| T3 | 84.01c | 68.45c | 57.13c | 6.5 x 109 |
| T4 | 81.86d | 63.96d | 53.67d | 7.0 x 109 |
| EEM | 0.31 | 0.56 | 0.80 | 0.27 |
| Lineal | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.50 |
| Cuadrático | 0.46 | 0.15 | 0.29 | 0.36 |
a,b,c,d Valores promedio con distinta letra en una columna son estadísticamente diferentes (p≤0.05)
T1= 0 % de semilla de girasol; T2= 6 % de semilla de girasol; T3= 12 % de semilla de girasol y T4= 18 % de semilla de girasol. EEM = Error estándar de la media; DEGMS = Degradación de la materia seca; DEGFDN; Degradación de la fibra detergente neutro; DEGFDA= Degradación de la fibra detergente ácida. [Bacterias]= Concentración de bacterias totales mL-1
La DEGFDN disminuyó entre 8 y 19 % (p≤0.05) al aumentar el contenido de semilla de girasol en los tratamientos (Cuadro 3). Lo anterior se puede deber a los cambios en el contenido de grasa de los tratamientos, la cual se relaciona con una reducción de protozoarios y concentración de bacterias en el rumen (Yang et al., 2009). Cabe destacar que las bacterias fibrolíticas son sensibles al contenido de grasa en la dieta (Patra y Yu, 2012).
El aumento de la proporción de semilla de girasol en los tratamientos redujo (p≤0.05; Cuadro 3) la DEGFDN de 8 a 19 % y la DEGFDA 10 a 33 %, lo cual es similar a la reducción de la degradabilidad de la MS (8.9 a 19.2 %), FDN (10.1 a 19.8 %) y FDA (3.7 a 28.8 %) al incluir en la dieta pulpa de coco, semillas de algodón y semillas de girasol (Chuntrakort et al., 2014). La adición de 10 % de semillas de oleaginosas (linaza, canola y girasol) en una dieta basal con pasto ovillo (Dactylis glomerata L.) no afectó la digestibilidad de la MS y FDN (Soder et al., 2013).
La cantidad de bacterias totales a las 72 h de incubación no mostró diferencias entre tratamientos (p>0.05; Cuadro 3). Esto es similar al reportado por Ley de Coss et al. (2013), pero inferior a lo publicado por Dehority (2003). Los primeros publicaron un conteo de 109 bacterias mL-1; mientras los segundos de 1010 a 1012 bacterias mL1 en rumen. Los resultados de nuestro estudio se relacionan con principios ecológicos, ya que la población microbiana del rumen está integrada por una variedad de especies que constantemente cambia con base en el medio que lo rodea. Así, la eliminación o supresión de algún grupo microbiano causa la adaptación de otro grupo para llenar su hueco en el ecosistema ruminal (Hungate, 1966; Czerkawski, 1986; Weimer, 1998).
La concentración de AGV total mostró una disminución lineal (p≤0.05) respecto al testigo (T1; Cuadro 4). La concentración de acético, propiónico y butírico mostró un comportamiento similar al de AGV total, lo cual puede estar relacionado con la disminución en la DEGMS. La disminución en la concentración de AGV en el rumen se relacionó con una menor concentración de H2 (Dohome et al., 1999), debido a que es el principal subproducto después de la síntesis de ácido acético y ácido butírico en el rumen. Además, el H2 generado y la presencia de arqueas metanogénicas incrementan la producción de CH4 al utilizar el H2 y CO2 como fuente de energía (Kim et al., 2012). Los tratamientos presentaron un efecto lineal (p≤0.05) en la disminución de AGV conforme aumentó el contenido de semilla de girasol. Esto es congruente con lo reportado por Jordan et al. (2006), quienes mencionaron que la concentración total de AGV disminuyó al utilizar aceite de coco en dietas para ganado de carne, porque se redujo la digestibilidad de la MS y de los componentes de la FDN y FDA.
Cuadro 4 Concentración de ácidos grasos volátiles (mM) a las 72 h en dietas integrales para corderos que incluye cuatro niveles de semilla de girasol.
| Tratamiento | Acético | Propiónico | Butírico | A:P | AGV total |
| T1 | 73.93a | 66.05a | 14.80a | 1.12 | 154.78a |
| T2 | 72.72a | 63.34ab | 14.41a | 1.15 | 150.47ab |
| T3 | 69.64ab | 62.03b | 14.00ab | 1.12 | 145.62bc |
| T4 | 65.85b | 59.70b | 13.31b | 1.10 | 138.86C |
| EEM | 1.17 | 0.91 | 0.26 | 0.17 | 2.01 |
| Lineal | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.34 | 0.01 |
| Cuadrático | 0.29 | 0.84 | 0.63 | 0.16 | 0.55 |
a,b,c,d Valores promedio con distinta letra en una columna son estadísticamente diferentes (p≤0.05)
T1= 0 % de semilla de girasol; T2= 6 % de semilla de girasol; T3= 12 % de semilla de girasol y T4= 18 % de semilla de girasol. EEM: Error Estándar de la Media; A:P relación acético propiónico; AGV: ácidos grasos volátiles
