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Introducción
Los principios activos de las plantas aromáticas pueden repercutir en las interacciones planta-planta, porque influyen en el crecimiento, supervivencia o reproducción de otros organismos (Aliotta et al., 1989; Vokou, 1992). Los antioxidantes de las plantas están relacionados específicamente con oxidrilos fenólicos, que tienen efecto en los radicales libres y las moléculas mediadoras en la regulación de procesos fisiológicos (Dröge, 2002). Los radicales libres son altamente reactivos porque tienen un electrón desapareado o libre y tienden a captar un electrón de moléculas estables y alcanzar su estabilidad electroquímica. Una vez que el radical libre sustrajo el electrón, la molécula estable que se lo cedió se transforma en radical libre, por quedar con un electrón desapareado, y así se inicia una reacción en cadena que destruye a las células (Avello y Suwalsky, 2006). Frente a agresiones externas, como infecciones y contaminantes ambientales, los radicales libres tienden a incrementarse, con daños mayores para las células (Dröge, 2002).
Los metabolitos secundarios de las plantas aromáticas son responsables de su olor (terpenos), pigmentación (quinonas y taninos) y sabor (terpenos). Algunos de los extractos de esas plantas son compuestos naturales, mezcla de varios compuestos, como terpenoides y fenoles, a los que se les atribuyen propiedades antisépticas, antifúngicas, antioxidantes y antitumorales (Uedo et al., 1999). Los extractos contienen monoterpenos (C10), moléculas que constituyen 90 % de los aceites esenciales, existen en gran variedad de estructuras y se componen de radicales funcionales como carburos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, éteres, peróxidos y fenoles (Bakkali et al., 2008). También contienen sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) y los politerpenos (C > 40) (Burt, 2004).
Los principios activos, que ejercen efecto antimicrobiano, en los extractos de plantas pueden ser compuestos fenólicos, cumarinas, flavonoides, taninos y las quinonas (Cowan, 1999). De ellos los compuestos fenólicos y los terpenoides muestran la actividad antimicrobiana mayor (Ultee et al., 2000).
Los extractos de plantas extraídos con disolventes orgánicos y destilación son combinaciones de hidrocarburos cíclicos y sus alcoholes, aldehídos o ésteres derivados. Inouye et al. (2001) observaron que los aceites con un aldehído o un fenol como componente principal fueron los más activos frente a bacterias del tracto respiratorio, le siguieron los alcoholes y, en menor grado, los aceites que contienen cetonas, ésteres o hidrocarburos.
La actividad de un aceite esencial está relacionada con la configuración estructural, grupos funcionales de sus compuestos y posibles sinergias entre estos (Dorman y Deans, 2000). La mayoría de los compuestos bioactivos de los extractos de Larrea tridentata, Origanum vulgare, Artemisa ludoviciana y Ruta graveolens son de tipo fenólico. El objetivo de este estudio fue determinar la composición química y espectroscopia de infrarrojo con transformación de Fourier (FTIR) de los extractos etanólicos recolectados en tres municipios del centro del estado de Zacatecas, México.
Materiales y Métodos
Región de estudio y recolección de muestras
Las plantas se recolectaron al azar, en ambiente silvestre durante la primavera-verano del 2014 y 2015, en tres municipios del estado de Zacatecas: Larrea tridentata y A. ludoviciana en Villa de Cos (23°17′42″ N, 102°20′24″ O), O. vulgare en Valparaíso (22°46′12″ N, 103°34′14″ O) y R. graveolens en Calera de Víctor Rosales (23°27′00″ N, 102°55′00″ O), y estos lugares tienen características climáticas adecuadas para el desarrollo de las plantas. Después de la recolección las plantas se mantuvieron dos semanas a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C), luego a 45 °C por 24 h para deshidratarlas, se trituraron y almacenaron en bolsas plásticas hasta que se usaron.
Obtención de los extractos de plantas
La extracción se hizo con 20 g de la muestra triturada y 300 mL de etanol al 70 % (J.T. Baker®) como disolvente, en frasco color ámbar de 1 L (Pesewu et al., 2008). La muestra se mezcló con vigor por 10 min, y reposó un mes a temperatura ambiente (20 °C). El sobrenadante se filtró con papel Whatman No. 2 y el disolvente se evaporó en un extractor tipo Soxhlet a 85°C. Tres alícuotas se obtuvieron y mantuvieron a < 20 °C para su análisis posterior.
Pruebas cualitativas de perfil químico
El perfil químico de los extractos se obtuvo de acuerdo con lo descrito por Domínguez (1973), en tubos de ensayo 10 mL e incluyó lo descrito a continuación.
Prueba con KMnO4 para detectar insaturaciones
Muestras de 1 a 2 mg se resuspendieron en 1 mL de metanol y se añadió gota a gota KMnO4 (SIGMA) al 2 % en agua. La prueba fue positiva cuando hubo decoloración o formación de precipitado café (formación de dióxido de magnesio).
Prueba con FeCl3 para detectar oxidrilos fenólicos (taninos vegetales)
Muestras de 1 a 2 mg se resuspendieron en 1 mL de agua y se añadieron unas gotas de FeCl3 (III) al 12.5 % en agua. La prueba fue positiva cuando se formó precipitado rojo, azul-violeta o verde.
Prueba de Liebermann-Burchard para detectar esteroles y triterpenos
El reactivo preparado con 1 mL de ácido acético y 1 mL de cloroformo mezclados, enfriado a 0 ºC, con ácido sulfúrico añadido gota a gota hasta que no hubo reacción química y se añadió gota a gota a la muestra. La prueba fue positiva cuando se desarrollaron colores azul, verde, rojo o anaranjado en el tiempo.
Prueba de Salkowski para detectar esteroles y triterpenos
En 1 o 2 mg del extracto se añadió 1 mL de ácido sulfúrico. La prueba fue positiva para esteroles o metilesteroles cuando se desarrollaron colores amarillo o rojo.
Prueba detectar cumarinas
De 1 a 2 mg de muestra se disolvieron en NaOH al 10 %. La prueba fue positiva cuando se desarrolló coloración amarilla que se eliminó al acidular la mezcla.
Prueba de Baljet para detectar sesquiterpenlactonas
De 1 a 2 mg del extracto se mezclaron con 3 o 4 gotas de la solución mezcla. La prueba fue positiva cuando la coloración cambió de anaranjado a rojo oscuro.
Prueba del H2SO4 para detectar flavonoides
De 1 a 2 mg de la muestra se disolvieron en H2SO4. La coloración amarilla indicó la presencia de flavonoides, naranja-guinda la de flavonas, rojo-azuloso la de chalconas y rojo-púrpura la de quinonas.
Composición química del extracto por cromatografía de gases
La composición química se determinó en un cromatógrafo de gases (CG; Agilent Tecnologies serie 6890N, EUA), con columna polar DB_WAXetr, a 250 °C y 12.13 psi, flujo de 36.5 mL de He min-1. Las condiciones para la columna fueron: temperatura inicial 50 °C, de 0 a 2 min, aumento de 10 en 10 °C hasta 250 °C, constantes por 5 min, disminución a 50 °C por 2 min con flujo de 1.6 mL de He min-1 a 12.13 psi y velocidad promedio de 25 cm s-1, el detector utilizado fue de flama ionizante (FID) a 210 °C con flujo de 40 mL de H2 min-1 y un flujo de 450 mL de aire min-1. Los estándares (Sigma-Aldrich) se utilizaron en varias concentraciones (Cuadro 1).
Cuadro 1 Concentraciones de estándares (mg mL-1) para determinar la composición química de extractos de Larrea tridentata, Origanum vulgare, Artemisa ludoviciana y Ruta graveolens en cromatógrafo de gases.
| Estándar | Timol | Carvacrol | Linalol | Terpineno | Limoneno |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 10.373 | 8.284 | 7.744 | 7.154 | 8.496 |
| 2 | 5.186 | 4.142 | 3.872 | 3.577 | 4.248 |
| 3 | 2.593 | 2.071 | 1.936 | 1.789 | 2.124 |
| 4 | 1.297 | 1.035 | 0.968 | 0.894 | 1.062 |
| 5 | 0.648 | 0.518 | 0.484 | 0.447 | 0.531 |
| 6 | 0.324 | 0.259 | 0.242 | 0.224 | 0.265 |
Estructura química del extracto por Espectroscopia Infrarroja con Transformación de Fourier (FTIR)
Los análisis de espectroscopía se efectuaron en un equipo Thermo scientific (marca NicoletTM iS50TM, EUA), con celda dispersiva; los gráficos se elaboraron con OriginPro 8. Los espectros se midieron en el intervalo de 600 a 4000 nm, con 32 repeticiones cada uno y se promediaron. Cada muestra se concentró en rotaevaporador (Eppendorf VacufugeTM, EUA) a 30 °C por 12 h.
Resultados y Discusión
Las diferencias del rendimiento de los extractos de las cuatro especies (Cuadro 2) se deben al tiempo que la muestra se mantuvo en el equipo Soxleth (Albado et al., 2001).
Cuadro 2 Rendimiento de los extractos (20 g de materia seca y 300 mL de etanol) analizados en 2014 y 2015.
| Número de muestra | Extracto | Volumen extracto (mL) | Rendimiento (%, W/W) |
|---|---|---|---|
| 1 † | L. tridentata (2014) | 35 | 11.66 |
| 2 | L. tridentata (2015) | 40 | 13.33 |
| 3 | L. tridentata diluido¶ (2015) | 90 | 30 |
| 4 | O. vulgare (2014) | 41.5 | 13.83 |
| 5 | O. vulgare (2015) | 30 | 10 |
| 6 | O. vulgare diluido† (2015) | 120 | 44 |
| 7 | A. ludoviciana (2014) | 36 | 12 |
| 8 | A. ludoviciana (2015) | 17.95 | 5.98 |
| 9 | A. ludoviciana diluido¶ (2015) | 105 | 35 |
| 10 | R. graveolens (2014) | 31.5 | 10.5 |
| 11 | R. graveolens diluido (2015) | 150 | 50 |
†En la primera columna está el número de identificación de la muestra.
¶Extracto diluido, con menos tiempo de evaporación y rendimiento mayor en estos extractos.
Pruebas cualitativas de perfil químico
Las pruebas de perfil químico de los extractos no mostraron diferencias (Cuadro 3).
Cuadro 3. Pruebas cualitativas de perfil químico de extractos de plantas.
| Pruebas cualitativas | Número de muestra | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | ||
| Insaturaciones | Prueba de KMnO4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Ésteres | Prueba de Salkowski | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Carbohidratos | Prueba de cumarinas | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Prueba de lactonas | + | + | + | + | + | + | - | - | - | - | - | |
| Flavonoides | Prueba de H2SO4 | + | + | + | + | + | - | + | + | + | + | + |
| Prueba de Shinada | + | + | + | + | + | + | - | - | - | + | + | |
| Alcaloides | Prueba de Dragendorff | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Saponinas | Prueba de agitación | - | - | - | - | - | - | + | + | + | - | - |
| Prueba de NaHCO3 | - | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | |
El extracto tres diluido de L. tridentata fue positivo porque no se sometió a cambios de temperatura y conservó su estructura química. El extracto O. vulgare diluido fue negativo en la prueba de H2SO4 porque sus compuestos estaban en cantidad menor que en los extractos cuatro y cinco de O. vulgare que se concentraron.
El extracto de L. tridentata mostró insaturaciones, ésteres, carbohidratos y flavonoides. Las condiciones de cultivo in vitro pueden favorecer la síntesis de metabolitos que en condiciones naturales no ocurriría (Garza et al., 2010). Los extractos de O. vulgare fueron positivos para insaturaciones, ésteres, carbohidratos, flavonoides y saponinas, y específicamente para flavonoides. En extractos de O. vulgare se han identificado flavonoides, como crisoeriol, diosmetina, eriodictiol, cosmósido y vicenina-2 (Koukoulitsa et al., 2006), que no se identificaron en este estudio. El extracto de A. ludoviciana mostró insaturaciones, ésteres, cumarinas y saponinas, y el de R. graveolens mostró insaturaciones, ésteres, flavonoides y saponinas. Lin et al. (2007) identificaron en R. graveolens los siguientes flavonoides: luteolina, taxifolina, quercetina y naringenina en concentración total de 59.8 mg g-1 seco. En nuestra investigación la variación no se detectó entre los años de cosecha.
Composición química
El análisis en el cromatógrafo de gases fue de 18 min por muestra y el tiempo de retención de terpinene fue limoneno, linalol, timol y carvacrol fue 3.52, 3.62, 4.21, 8.87 y 9.45 min. En los extractos de L. tridentata, O. vulgare, A. ludoviciana y R. graveolens se determinó carvacrol, timol, terpinene, linalol y limoneno; y en los extractos de L. tridentata se encontraron los compuestos de timol y carvacrol en concentraciones variables (Cuadro 4).
Cuadro 4. Composición química (mg mL-1) de extractos de Larrea tridentata, Origamun vulgare, Artemisa ludoviciana y Ruta graveolens obtenida por cromatografía de gases.
| Muestra | Extracto | Terpineno | Limoneno | Linalol | Timol | Carvacrol |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | L. tridentata (2014) | 0 | 0 | 0 | 4.30 | 7.80 |
| 2 | L. tridentata (2015) | 0 | 0 | 0 | 2.39 | 7.55 |
| 3 | L. tridentata diluido (2015) | 0 | 0 | 0 | 0.30 | 4.43 |
| 4 | O. vulgare (2014) | 0 | 0.07 | 0.13 | 4.19 | 9.10 |
| 5 | O. vulgare (2015) | 0.06 | 0 | 0.10 | 4.36 | 10.75 |
| 6 | O. vulgare diluido (2015) | 0 | 0.07 | 0.01 | 0.98 | 2.47 |
| 7 | A. ludoviciana (2014) | 0.05 | 0 | 0.29 | 0.03 | 0.05 |
| 8 | A. ludoviciana (2015) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.02 |
| 9 | A. ludoviciana diluido (2015) | 0 | 0 | 0.12 | 0.01 | 0.02 |
| 10 | R. graveolens (2014) | 0 | 0.06 | 0 | 0 | 0 |
| 11 | R. graveolens diluido (2015) | 0 | 0.06 | 0 | 0.01 | 0.03 |
Estos resultados confirman que las plantas medicinales estudiadas son ricas en terpenos (carvacrol, citral, linalol y geraniol) y compuestos fenólicos (Cai et al., 2004). Los compuestos fenólicos, como los flavonoides, quercetina, kaempferol y ácido nordihidroguaiarético, son bioactivos que pueden encontrarse en L. tridentata (Nakamura et al., 2005; Tapas et al., 2008; Martins et al., 2012) con una concentración diferente a las de nuestro estudio.
Los extractos cuatro y seis de O. vulgaris contenían limoneno, y el extracto cinco contenía terpinene. Estos resultados coincidieron con los obtenidos en aceites de orégano que contenían terpineoles, fenoles y compuestos relacionados metabólicamente con el carvacrol (Albado et al., 2001).
El extracto siete de A. ludoviciana contenía terpineno, linalol, timol y carvacrol, el extracto ocho contenía solo carvacrol y en el extracto nueve hubo linalol, timol y carvacrol. Estos resultados difirieron de los reportado por Kordali et al. (2005), quienes identificaron en A. ludoviciana anetol (81 %), beta-ocimeno (6.5 %), limoneno (3.0 %) y metileugenol (1.8 %), y ninguno de estos compuestos se encontró en nuestro estudio. Los contrastes se pueden deber a factores genéticos, agronómicos y ambientales (Sharapin et al., 2000).
Los compuestos de limoneno, timol y carvacrol se identificaron en los extractos de R. graveolens. En aceite esencial de R. graveolensDe Feo et al. (2002) identificaron nonanona (18.8 %), undecan-2-one (46.8 %), nonan-2-one (18.8 %), decan-2-one (2.2 %) y tridecan-2-one (2.5%). Los terpenoides constituyeron 11.2 % del aceite con α-pineno (1.3 %), limoneno (3 %) y 1,8- cineole (2.9 %) como los monoterpenos principales. La presencia de limoneno en nuestro estudio coincidió con esos resultados.
Los compuestos identificados en los extractos son importantes por su actividad farmacológica. El limoneno es antibacteriano, antifúngico, antiséptico y antiviral; el timol puede ser menos cáustico que otros fenoles y es antibacteriano, antifúngico, antiinflamatorio, antioxidante, antirreumático y antiséptico; el carvacrol es antibacteriano, antifúngico, antiinflamatorio, antiséptico, antiespasmódico y expectorante (Sorentino y Landmesser, 2005).
Estructura química del extracto por FTIR
En la determinación de la estructura se emplearon los estándares para cromatografía de gases. Los gráficos de correlación IR expresan las frecuencias de vibración en números de onda y se obtuvieron del FTIR; la técnica se considera de alta resolución y proporciona un espectro de reflexión de las bandas de los grupos funcionales de sustancias inorgánicas y orgánicas, que permite identificarlas (Skoog et al., 2001). Las frecuencias de FTIR se atribuyen al estiramiento y la flexión de vibraciones que caracterizan a los grupos funcionales (Baranska et al., 2005).
Los espectros FTIR mostraron ocho regiones, cada una con tres áreas (Figura 1): 1 (1400-1500 cm-1) correspondiente a CO y CC, vibraciones específicas en grupos fenilo; 2 (1500 a 1600 cm-1) correspondiente al dominio aromático y NH de flexión (Baranska et al., 2005); 3 (1600-1760 cm-1) correspondiente a la flexión NH, estiramientos C=O (aldehídos, cetonas, ésteres) y ácidos grasos libres (1710 cm-1) y glicéridos (1740 cm-1) (Socaciu et al., 2009 a, b).
Figura 1 Espectros FTIR de cinco estándares empleados para la determinación química de extractos de Larrea tridentata, Origanum vulgare, Artemisa ludoviciana y Ruta graveolens mediante espectroscopia de infrarrojo.
Las frecuencias de 675 a 920 cm-1 en los estándares de carvacrol, timol, linalol, limoneno y terpineno se asociaron con grupos aromáticos C=C, w (C-H) de anillos aromáticos (Adinew, 2014). Las frecuencias de 1050 cm-1 en los cinco estándares se asignaron a vibraciones de tensión de C-O, cuyos valores fueron reportados por Anicuta et al. (2010); los valores de 1161 a 1233 cm-1 correspondieron al éster de grupos C-O, lo cual coincidió con lo señalado por Vlachos et al. (2006).
Las frecuencias de 1360 cm-1 en los cinco estándares pertenecieron a la deformación de C-O (Martins et al., 2013) y este grupo se identificó en los cinco estándares en frecuencia de 1440 cm-1 (Anicuta et al., 2010). Las frecuencias de 1580 cm-1 correspondieron a grupos amino presentes en carvacrol, timol y terpineno. Los valores 2830 y 2872 cm-1 correspondieron a vibraciones simétricas y asimétricas de grupos CH3 alifático, presentes en carvacrol, timol y terpineno. Las frecuencias de 3300 a 3400 cm-1 correspondieron a grupos hidroxilo (O-H), uniones fuertes de hidrógeno, o absorción y estiramiento en carvacrol, linalol y terpineno.
En el timol, las frecuencias de 745 cm-1 indicaron superposición de grupos CH2 oscilantes. La frecuencia de 809 cm-1 perteneció a w (C-H) de anillos aromáticos, y la de 860 cm-1 a grupos aromáticos C-C (Adinew, 2014). Las frecuencias de 937, 995 y 1288 cm-1 (flexión de enlaces CH, CO, CN, CC) estuvieron en los cinco estándares. La frecuencia de 1110 cm-1 correspondió al esqueleto aromático y estiramiento de C-O presente en carvacrol, timol, linalol y terpineno. Los grupos O-H absorbido y conjugado a C-O se asociaron a la frecuencia de 1620 cm-1 en timol.
La frecuencia de 2872 cm-1 en timol indicó vibraciones simétricas y asimétricas del grupo CH3 alifático. Las frecuencias de 2959 a 2962 cm-1 pertenecen a grupos de estiramiento CH2 y a grupos metilo en anillos fenólicos (Wu et al., 2012) en los cinco estándares. El estiramiento O-H se encontró en la frecuencia 3259 cm-1 en el timol.
Las frecuencias de 995 cm-1 en linalol y limoneno correspondieron a la zona de la huella dactilar de la flexión de enlaces CH, CO, CN y CC. La frecuencia de 1650 cm-1 en linalol, limoneno y terpineno indicó la presencia de anillos C=O de aldehídos. Linalol, limoneno y terpineno presentaron vibraciones simétricas y asimétricas del grupo CH2 alifático con 2921 cm-1. López et al. (2014) indicaron que entre las frecuencias de 3000 y 3100 cm-1 se identificaron anillos aromáticos, los cuales se observaron en linalol y limoneno.
Las frecuencias sobresalientes de los extractos fueron 881cm-1, 1047 cm-1, 1360 cm-1, 1440 cm-1, 1650 cm-1, 2921 cm-1, 2959 cm-1 y 3367 cm-1 pertenecientes a C=C de grupos aromáticos (Adinew, 2014), vibración de tensión de C-O (Anicuta et al., 2010), deformación de C-H (Martins et al., 2013), grupos C-O (Anicuta et al., 2010), anillo C=O de aldehídos (Adinew, 2014), vibración simétrica y asimétrica del grupo CH2 alifático (Vlachos et al., 2006) y grupos hidroxilo (Martins et al., 2013) (Figura 2).
Conclusiones
La presencia de grupos fenólicos se confirmó con técnicas cualitativas y con la técnica cuantitativa de cromatografía de gases se identificaron los compuestos fenólicos en extractos de L. tridentata O. vulgare, A. ludoviciana y R. graveolens. El año de recolección de las plantas no influye en el perfil químico de los extractos. La técnica de espectroscopía permite corroborar la composición química de extractos de plantas determinada con métodos químicos. Las frecuencias de CO-CH, de los espectros FTIR, fueron distintivas para cada extracto analizado. Esta técnica presenta ventajas porque es sencilla, confiable y exacta en comparación con las técnicas químicas convencionales.
