Localización

El experimento se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología Ruminal y Genética Microbiana del Programa de Ganadería del Campus Montecillo, Colegio de Postgraduados.

Dietas experimentales

En este estudio se evaluaron tres dietas formuladas de acuerdo con los requerimientos nutricionales ^{NRC (2007)} para corderos en crecimiento, con 0, 20 y 40 % de DDGS de maíz y con una proporción forraje:concentrado de 15:85. Los DDGS fueron incluidos para sustituir el parte el grano de maíz, pasta de soya y gluten de maíz en el concentrado, manteniendo las dietas isonitrogenadas (Cuadro 1).

Análisis químico

La composición química de las dietas (Cuadro 1) fue determinada por los métodos de la ^{AOAC (2005)}: materia seca (MS; método 930.15), cenizas (método 942.05), extracto etéreo (EE; método 954.02) y proteína cruda (PC; método 984.13). El contenido de fibra detergente neutro (FDN) y ácido (FDA) se determinó con el método propuesto por ^{Van Soest et al. (1991)}.

Animales y líquido ruminal

Tres corderos Rambouillet (37 ± 2.5 kg; seis meses de edad promedio) con cánula en el rumen se usaron para obtener líquido ruminal fresco (LR). Los corderos fueron adaptados a las dietas experimentales por 21 d antes de iniciar el estudio in vitro. En el día 22 se recolectaron 500 mL de LR de cada borrego, 3 h después de la alimentación matutina. El LR se llevó al laboratorio en un termo a 39 °C para inocular los biofermentadores con las dietas experimentales.

Medición de biogás

Los ingredientes y las dietas se molieron con malla de 1 mm en un molino Willey (Arthur H. Thomas, Philadelphia, PA). Muestras de 0.5 g de MS se pesaron y agregaron a viales serológicos de 120 mL, con 45 mL de medio de cultivo para bacterias totales (^{Cobos y Yokoyama, 1995}), para sustituir las fuentes de energía (glucosa, celulosa y almidón) por los ingredientes o las dietas experimentales según el tratamiento. Todos los viales se mantuvieron en condiciones anaeróbicas con CO₂ y cada vial se consideró un biofermentador y una unidad experimental. Las proporciones de CH₄ y CO₂ se determinaron en un cromatógrafo de gases (Perkin-Elmer^®) equipado con un detector de conductividad térmica y una columna empacada Poropack. Las condiciones de detección fueron: temperaturas de horno 80 °C, columna empacada 170 °C y detector de conductividad térmica 130 °C; tiempos de retención 0.71 y 1.05 min para CH₄ y CO₂, respectivamente. El gas acarreador fue helio con un flujo de 23 mL m^-1. La concentración molar de CH₄ y CO₂ se calcularon según la ecuación de gases ideales (^{Posada y Noguera, 2005}). Los ácidos grasos volátiles (AGV) se determinaron en un cromatógrafo de gases (Perkin-Elmer^®) con un detector de ionización con flama. Las condiciones de trabajo fueron: temperatura de horno 130 °C, y de el inyector y la columna capilar (15 x 0.32 m) 250 °C. Los tiempos de retención fueron 1.26 min para acetato, 1.6 min propionato y 2.09 min butirato.

Producción in vitro de biogás

Para cuantificar la cantidad de biogás, CH₄ y CO₂ se adaptó la técnica descrita por ^{Krabill et al. (1969)} en relación a la captura de biogás con solución saturada acidificada, cambiando el Na₂SO₄ al 20 % (p/v) por NaCl para que el CO₂ no se mezcle con el agua. Esta metodología permite estudiar diversos alimentos y se puede cuantificar el total de biogás, CH₄ y CO₂ de una manera práctica, sencilla y económica.

El biogás se capturó en trampas de solución salina saturada (370 g NaCl L^-1 de agua y 5 mL de naranja de metilo al 0.1 % como indicador de pH) con pH 2 ajustado con HCl a 1 N. Los viales serológicos de 120 mL se llenaron completamente con la solución salina y sellados herméticamente con un tapón de neopreno (2 cm de diámetro) y sellados con un arillo de aluminio con una selladora Wheaton^®. Las trampas se cambiaron cada 24 h durante las 72 h de la fermentación.

Los biofermentadores se incubaron en baño María a 39 °C, se inocularon con líquido ruminal fresco centrifugado a 1157 g por 3 min y conectados a las trampas de captura por medio de una manguera Tygon^® con un diámetro interior de 3/32”. La manguera fue adaptada con dos agujas amarillas de la marca Terumo^® de calibre 20 G x 1” en cada extremo. Una manguera se colocó en el biofermentador y la otra a la trampa de captura, la cual tenía una aguja con las características ya mencionadas, que sirvió como válvula de liberación de la solución salina saturada. La trampa se colocó en forma invertida en una probeta de plástico con un corte en V.

Para no obstruir el paso del biogás, la manguera fue bloqueada con una pinza de plástico para liberar el gas a las 24, 48 y 72 h de fermentación. La producción de biogás total se cuantificó midiendo el desplazamiento del líquido de las trampas en la probeta. Para medir la cantidad de CH₄ y CO₂ se tomó una muestra de 500 μL del espacio invertido de las trampas.

Evaluación de las variables de fermentación ruminal

Las muestras se tomaron de la fase líquida a las 72 h de cada biofermentador, en viales Eppendorf^® de 2 mL, con ácido metafosfórico al 25 % con una proporción 4:1, y se congelaron a -4 °C, para después medir la concentración molar de los AGV por cromatografía de gases (^{Erwin et al., 1961}). La concentración de bacterias ruminales se evaluó por conteo directo en una cámara Petroff Houser^® y en un microscopio de contraste Olympuss^® a 1000 X. El pH se midió directamente del biofermentador a las 72 h con un potenciómetro ORION^®, calibrado a pH 4 y 7. El contenido del biofermentador se filtró en papel Whatman para recuperar la MS no degradada y por diferencia de peso se calculó la degradación in vitro de la MS (DIVMS).

Diseño y análisis estadístico

El diseño experimental fue completamente al azar, con cinco repeticiones por variable. Las variables pH, DIVMS, concentración molar total de AGV, producción acetato, propionato y butirato) se analizaron a las 72 h de fermentación, y la producción de biogás total, CH₄ y CO₂ acumulados y producción de CH₄ y CO₂ por cada 100 g de MS, a las 24, 48 y 72 h. Los resultados se analizaron con GLM de SAS (^{SAS Inc., 2011}) y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05). Para cumplir con la normalidad y homogeneidad de varianzas, los datos de concentración de bacterias se transformaron a Log 10, previo al análisis estadístico.

Variables de la fermentación ruminal

Las degradaciones fueron menores a las esperadas para una dieta totalmente mezclada con 85 % concentrado y 15 % forraje. En las dietas con 20 y 40 % de DDGS la DIVMS fue 17.3 y 25.1 % menor (p≤0.05), respectivamente, y este resultado es similar al reportado por ^{Félix et al. (2012)} (Cuadro 2).

La diferencia encontrada en la DIVMS entre las dietas experimentales se atribuye a la sustitución parcial del grano de maíz y pasta de soya que tienen una mayor DIVMS que los DDGS (Cuadro 3). Sin embargo, ^{Buckner et al. (2008)} y ^{Depenbusch et al. (2009)} muestran una utilización óptima de 20 a 30 % de la MS de DDGS en bovinos en engorda, y hasta 40 %, sin afectar la conversión alimenticia ni el crecimiento (^{Amat et al., 2012}; ^{Gibb et al., 2008}; ^{Klopfenstein et al., 2008}). Según ^{Schauer et al. (2008)}, no cambia el comportamiento productivo de borregos alimentados con dietas con 20 % de la MS con DDGS. ^{Avila-Stagno et al. (2013)} reportaron una reducción lineal de la DIVMS al incluir DDGS de trigo en sustitución de la pasta de soya en dietas para corderos. Al reemplazar la pasta de canola y grano de cebada por 20 % de MS de DDGS de trigo, la DIVMS disminuyó 6.17 %, pero al sustituir por 20 % de MS de DDGS de maíz no hubo diferencias (^{McKeown et al., 2010}).

La concentración de AGV no cambió por la inclusión de DDGS en las dietas, lo cual es similar a lo reportado por ^{Miśta et al. (2014)}, pero ^{McKeown et al. (2010)} mencionan que con 20 % de la MS de DDGS en dietas para crecimiento de corderos, la concentración de propionato aumentó sin afectar la concentración de AGV total. El aumento de DDGS de trigo en la dieta disminuyó la concentración total de AGV, y el propionato tuvo un comportamiento cuadrático (^{Avila-Stagno et al., 2013}). Según ^{Pecka-Kiełb et al. (2015)}, la concentración molar de butirato disminuye a las 24 h de incubación al incluir 30 % de DDGS de la MS en dietas para borregos. Además, la inclusión de 40 % de MS de DDGS en dietas para finalización de bovinos reduce la concentración total de AGV (^{Hünerberg et al., 2013}). Las diferencias de nuestros resultados con los de otros estudios pueden deberse a los distintos ingredientes utilizados y su fermentación ruminal individual (Cuadro 3), además de los niveles de inclusión de cada ingrediente en las dietas.

El grano de maíz tiene mayor DIVMS que los DDGS de maíz (p≤0.05). Los DDGS, el salvado de trigo y el gluten de maíz producen una mayor concentración total de AGV (p≤0.05) y el rastrojo de maíz produce una cantidad menor (Cuadro 3).

El pH (6.7 en promedio) entre tratamientos fue similar (p>0.05). Los resultados de otros estudios son contrastantes, ya que ^{Hünerberg et al. (2013)} y ^{Pecka-Kiełb et al. (2015)} reportaron disminuciones del pH, pero ^{Avila-Stagno et al. (2013)} mencionaron un aumento del pH.

Producción de biogás de las dietas experimentales y de los ingredientes utilizados

La producción de gas acumulado es un indicador del grado de fermentación de la MS de las dietas en relación inversa a la digestibilidad. En nuestro estudio, la producción de biogás fue mayor en la dieta con 40 % de DDGS, lo cual coincide con su menor DIVMS (Cuadro 4). Según ^{McKeown et al. (2010)}, la producción de biogás disminuyó 5.96 % al usar 20 % de DDGS de maíz en remplazo de la pasta de canola y parte del grano de cebada en dietas para corderos. El resultado de nuestro estudio es similar, porque al incluir 20 % de DDGS la producción de gas disminuyó 11.37 %, pero con 40 % la producción fue 44. 4 % mayor respecto a la dieta testigo y 62.5 % más que la dieta con 20 % de DDGS. Esto pudo deberse a las diferentes proporciones de sustitución del grano de maíz y pasta se soya por DDGS en las dietas, lo que redujo la DIVMS.

Sin embargo la producción individual de biogás de los ingredientes no se refleja en las dietas, pues el grano de maíz produce mayor cantidad de biogás (p≤0.05) que los DDGS y los otros ingredientes (Cuadro 5).

Producción de CH₄ y CO₂ de las dietas experimentales y de los ingredientes utilizados

Como se esperaba, a mayor tiempo de fermentación la producción de biogás aumentó; sin embargo, la de CH₄ por cada 100 mL de biogás producido disminuyó (22.8 %), y la de CO₂ aumentó (13.2 %) en la dieta con 40 % de DDGS respecto al testigo (Cuadro 6).

^{Avila-Stagno et al. (2013)} reportaron un incremento en la producción de CH₄ al incluir 40 % de DDGS, y lo relacionaron con la disminución de la DIVMS y el aumento en la producción de biogás total. Según ^{Pecka-Kiełb et al. (2015)}, la producción de biogás aumenta en dietas para corderos con 30 % de MS de DDGS, después de 24 h de incubación. En nuestro estudio, la producción de CH₄ a las 72 h fue mayor en 21.1 % en la dieta sin DDGS respecto a la de 20 % de DDGS, pero fue similar a la dieta de 40.0 %, pero el CO₂ acumulado fue menor en 22.2 % en la dieta con 20 %, respecto a la dieta con 40.0 % de DDGS (Cuadro 7).

Estos resultados muestran que la producción de gas total aumenta con el tiempo de fermentación en forma inversa a la digestibilidad de las dietas, pero la composición del gas puede variar en las proporciones de CH₄ y CO₂, según los ingredientes usados para formular las dietas. ^{Johnson y Johnson (1995)} indicaron que las emisiones de metano expresado como porcentaje del consumo de energía o por kg de MS consumida, son menores en ganado alimentado con dietas altas en concentrado que en forraje. Sin embargo, en nuestro estudio, con 40 % DDGS se redujo 22.8 % la producción de CH₄, respecto a la dieta testigo, pero aumentó 13.1 % la producción de CO₂. La sustitución de grano de maíz y pasta de soya por DDGS en las dietas contribuyeron a disminuir la DIVMS, quizás por una menor cantidad de almidón y el aumento en los niveles de grasa, FDN y FDA. La producción de metano de cada ingrediente indica que los ingredientes con alto contenido de proteína, como DDGS, pasta de soya y gluten de maíz, producen más CH₄ a las 72 h de incubación (Cuadro 8); sin embargo, en las dietas totalmente mezcladas la inclusión de 20 % de DDGS disminuyó la producción de CH₄.

^{Grainger y Beauchemin (2011)} mencionaron que el tipo y nivel de grasa en la dieta puede ser el factor más importante que afecta la metanogénesis, y un aumento de 5 a 6 % de grasa en la dieta disminuye la producción de metano en 5.1 % en el ganado. En nuestro estudio, las dietas tuvieron 3.2, 3.7 y 4.5 % de grasa expresada como extracto etéreo con 0.0, 20 y 40 % DDGS, respectivamente, lo cual pudo contribuir a reducir la producción de metano en 22.8 % y al aumento de CO₂ en la dieta con 40 % DDGS en 6.1 %, respecto al testigo. Según ^{Hünerberg et al. (2013)}, al sustituir 40 % grano de cebada por DDGS de maíz, la grasa en la dieta fue 5.4 % y la producción de CH₄ se redujo en 6.3 % por cada 1 % de la grasa; ellos concluyeron que la producción de CH₄ en respuesta a la adición de DDGS de maíz dependerá directamente del contenido de grasa en los DDGS. Nuestros resultados coinciden con los ya mencionados, al relacionar el aumento de grasa en la dieta con la cantidad de DDGS incorporados en las dietas y la reducción de la producción de CH₄. El contenido de grasa se asocia con la disminución de la digestión ruminal de la MS porque niveles altos de AG son tóxicos para algunas bacterias, como las metanogénicas, y protozoarios. Según ^{Martin et al. (2010)}, esta disminución se relaciona con una baja en la producción de metano en rumen. En nuestro estudio no se determinó la población de protozoarios, pero se realizó un conteo total de bacterias y hubo una disminución de 37 % en la dieta con 40 % DDGS respecto al testigo, lo cual puede indicar el efecto negativo de la grasa en la dieta en la población microbiana, ya que el pH de las dietas fue mayor a 6.5.