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Agrociencia

versión On-line ISSN 2521-9766versión impresa ISSN 1405-3195

Agrociencia vol.52 no.1 México ene./feb. 2018

 

Fitociencia

Variación de compuestos fenólicos totales, flavonoides y taninos en Vanilla planifolia jacks. ex Andrews de la Huasteca Hidalguense, México

Guadalupe Andrade-Andrade1 

Adriana Delgado-Alvarado1  * 

B. Edgar Herrera-Cabrera1 

Lourdes Arévalo-Galarza2 

Laura Caso-Barrera1 

1Estrategias para el Desarrollo Agrícola Regional. Campus Puebla. Colegio de Postgraduados. 72760. Cholula, Puebla. (gdlandrade@hotmail.com, behc@colpos.mx, lauracaso2004@yahoo.com).

2Fruticultura. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México. (larevalo@colpos.mx).


Resumen

Los fitoquímicos o metabolitos secundarios pueden ser compuestos bioactivos, con peso molecular bajo, que generalmente protegen a la planta contra plagas, bacterias, estrés ambiental, radiación UV u otros factores. En vainilla (Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews) se sintetizan compuestos que muestran inhibición microbiana contra fitopatógenos; pero, el tipo de fitoquímicos en las estructuras vegetales de esta especie es poco conocido. Bajo la hipótesis de que el tipo y concentración de fitoquímicos varía de acuerdo con el tejido vegetal y el sitio de recolecta de la planta, el objetivo del estudio fue detectar el tipo de fitoquímicos y cuantificar la concentración de compuestos fenólicos totales (CFT), taninos totales (TT), taninos condensados (TC) y flavonoides (Flav) en hoja, tallo, flor y fruto (vaina) beneficiado de vainilla, de tres sitios (Huizotlaco, Coacuilco y Contepec) de la Huasteca Hidalguense de México. Los diferentes tipos de metabolitos se identificaron en los extractos de metanol, cloroformo y hexano mediante cromatografía en capa fina (CCF). CFT, TT, TC y Flav se cuantificaron en los extractos metanólicos de las cuatro estructuras vegetales mediante métodos espectrofotométricos. CCF mostró la presencia de Flav, saponinas y terpenoides. La vaina presentó la concentración mayor de CFT (749.608 mg 100 g-1) y TT (102.141 mg 100 g-1) y la hoja tuvo la concentración mayor de Flav (127.023 mg 100 g-1) y taninos condensados (40.992 mg 100 g-1). Entre los sitios de recolecta, Coacuilco destacó la concentración mayor de Flav y TT y Contepec por la concentración mayor de CFT y TC.

Palabras clave: Vanilla planifolia; metabolitos secundarios; tejidos vegetales; análisis fitoquímico

Abstract

Phytochemicals or secondary metabolites can be bioactive compounds, with a low molecular weight, which generally protect the plant against pests, bacteria, environmental stress, UV radiation, or other factors. In vanilla (Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews) compounds are synthesized that show microbial inhibition against phytopathogens; however, the type of phytochemicals in the vegetative structures of this species is scarcely known. Under the hypothesis that the type and concentration of phytochemicals varies according to the plant tissue and the site of plant collection, the objective of the study was to detect the type of phytochemicals and to quantify the concentration of total phenolic compounds (TPC), total tannins (TT), condensed tannins (CT) and flavonoids (Flav) in leaf, stem, flower and cured fruit (pod) from vanilla, from three sites (Huizotlaco, Coacuilco and Contepec) of the Huasteca Hidalguense in México. The different types of metabolites were identified in methanol, chloroform and hexane extracts through thin-layer chromatography (TLC). TPC, TT, CT and Flav were quantified in the methanol extracts of the four vegetative structures through spectrophotometric methods. TLC showed the presence of Flav, saponins and terpenoids. The pod presented the highest concentration of TPC (749.608 mg 100 g-1) and TT (102.141 mg 100 g-1), and the leaf had the highest concentration of Flav (127.023 mg 100 g-1) and condensed tannins (40.992 mg 100 g-1). Among the collection sites, Coacuilco stood out for the highest concentration of Flav and TT, and Contepec for the highest concentration of TPC and CT.

Keywords: Vanilla planifolia; secondary metabolites; plant tissues; phytochemical analysis

Introducción

La vainilla (Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews) es una orquídea originaria de México y Centroamérica, se distingue por que es la única del género con importancia económica y la segunda especia aromática más costosa en la industria alimenticia, después del azafrán (Anilkumar, 2004). La vainilla se cultiva tradicionalmente en la región del Totonacapan de México, que comprende los estados de Puebla y Veracruz, y en otras regiones con condiciones agroclimáticas apropiadas para su cultivo, en Chiapas, Oaxaca, Tabasco, San Luís Potosí e Hidalgo (Castro-Bobadilla y García-Franco, 2007).

Las estructuras vegetales de las plantas contienen compuestos químicos que pueden desempeñar funciones de protección contra patógenos, radiación UV, plagas y comunicación para atraer polinizadores, u otras (Mazid et al., 2011; Pagare et al., 2015). En algunas orquídeas con uso medicinal se han identificado numerosos metabolitos secundarios que justifican sus propiedades medicinales, como alcaloides, flavonoides, fenantrenos, antocianinas, esteroles y terpenoides, particularmente en los extractos de las flores y las hojas (Pérez, 2010; Hossain, 2011). Los aztecas utilizaban la vainilla en el tratamiento de histeria, fiebre, impotencia y reumatismo (Bruman, 1948).

El fruto maduro de la vainilla se ha estudiado y utilizado como agente antioxidante, antimicrobiano, antiinflamatorio y anticancerígeno (Sinha et al., 2008; Shanmugavalli et al., 2009). Los estudios se han realizado mayormente en el fruto beneficiado de la vainilla (Pérez-Silva et al., 2006; Sinha et al., 2008) y se han descrito alrededor de 200 metabolitos del aroma, identificados estructuralmente como ácidos orgánicos, éteres, ésteres, alcoholes, compuestos fenólicos y carbonilos (Klimes y Lamparsky, 1976). De estos compuestos casi un tercio son aromáticos volátiles, entre ellos destacan, por su concentración alta e importancia en el aroma cuatro compuestos fenólicos: ácido p-hidroxibenzoico, ácido vaníllico, p-hidroxibenzaldehído y vainillina; este último es el compuesto más abundante (Pérez-Silva et al., 2006; Sharma et al., 2006). Existe información de los metabolitos volátiles en el extracto de los frutos beneficiados, pero se conoce poco su tipo y cantidad en otras estructuras y su variación con la etapa de desarrollo de la planta y el ambiente (Shanmugavalli et al., 2009). Sun et al. (2001) identificaron en extractos de acetato de etilo de la hoja y el tallo compuestos fenólicos, como p-etoximetilfenol, p-butoximetilfenol, vainillina y dos identificados por primera vez en esta especie, p-hidroxi-2-metoxicinamaldehído y ácido 3,4-dihidroxifenilacético, con propiedades insecticidas. Shanmugavalli et al. (2009) mencionaron que entre los metabolitos, particularmente en hoja, algunos tienen actividad contra patógenos, como Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli.

La hipótesis de este estudio fue que el tipo y la cantidad de fitoquímicos varían entre los tejidos vegetales y sitios de recolecta de la planta; el objetivo fue identificar el perfil de fitoquímicos y cuantificar la variación de los compuestos fenólicos totales, taninos totales, taninos condensados y flavonoides en hoja, tallo, flor y vaina beneficiada de vainilla de plantas recolectadas en Huizotlaco, Coacuilco y Contepec, en la Huasteca Hidalguense, México.

Materiales y Métodos

Recolecta de material vegetal

Los tejidos vegetales se recolectaron en plantaciones de Huizotlaco, Coacuilco y Contepec en Hidalgo, México (Figura 1, Cuadro 1). La recolecta de hoja, tallo y flor se realizó durante la etapa de floración en mayo de 2014. Los frutos de las plantas de cada sitio se recolectaron 32 semanas después de la polinización y se beneficiaron con el proceso tradicional (Beneficio Primero de Mayo, Papantla, Veracruz) por el maestro beneficiador Veremundo Rodríguez.

Figura 1 Ubicación geográfica de los sitios de recolecta de estructuras de vainilla en la Huasteca Hidalguense, México. S1: Huizotlaco, S2: Coacuilco, S3: Contepec. 

Cuadro 1 Ubicación de poblaciones de plantas de Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews en la Huasteca Hidalguense, México. 

Municipio Localidad Longitud (grados) Latitud (grados) Altitud (m) Clima
Atlapexco Huizotlaco -98.38 21.05 285 Am (f) Cálido húmedo, temperatura media
anual mayor de 22 ºC y temperatura del mes más frío
mayor de 18 ºC.
Huejutla Coacuilco -98.60 21.11 400 A (f) Cálido húmedo, temperatura media anual
mayor de 22 ºC y temperatura del mes más frío
mayor de 18 ºC.
Huejutla Contepec -98.49 21.14 352 (A)C(m)(f) Semicálido húmedo del grupo C,
temperatura media anual mayor de 18 ºC,
temperatura del mes más frío menor de 18 ºC.

(CONABIO, 2012).

Análisis cualitativo por cromatografía en capa fina (CCF)

Preparación de extractos. A partir de hojas, tallos y flores frescos triturados y hexano y metanol en proporción 1:5 (tejido: disolvente) se obtuvieron los extractos con diferente polaridad (Recio-Iglesias, 1999); el extracto de vaina beneficiada se obtuvo sólo con metanol por la disponibilidad baja de la muestra (Jadhav et al., 2009). Las muestras se colocaron en un sonicador (Auto Science, modelo A5515OB) por 30 min, a frecuencia de 5.5, se mantuvieron en maceración a temperatura ambiente por 24 h, se filtraron y almacenaron en viales de vidrio a -20 °C) hasta el momento de su análisis.

Identificación de los grupos de compuestos. A placas de gel de sílice 60, F254 (Sigma-Aldrich) se aplicaron de 15 a 20 μL de los extractos. Los eluyentes y agentes cromogénicos fueron específicos para la detección de cada grupo de metabolito (Wagner y Bladl, 1996), en el caso de flavonoides las placas se visualizaron con luz ultravioleta (UVLMS-38 El series 3UV™ Lamp) a365 nm.

Análisis cuantitativo

Hojas y tallo se obtuvieron de los extremos superior e inferior y de la región media de un metro de esqueje de la planta, se seccionaron en trozos pequeños, se extrajeron con metanol y se mantuvieron en la misma forma que se describió antes. A cada tejido se le determinó el contenido de humedad para expresar la concentración de los metabolitos secundarios con base en la materia seca (MS).

Compuestos fenólicos totales. Estos compuestos se cuantificaron con el método propuesto por Singleton et al. (1999), a 725 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Evolution 300, Thermo Scientific). La curva estándar (y=1.6571x-0.016, R²=0.9932) se preparó con ácido gálico (Sigma). Los resultados se expresaron en mg equivalentes de ácido gálico por 100 g de materia seca.

Taninos totales. Estos compuestos se cuantificaron con el método descrito por Makkar et al. (1993), a 725 nm en un espectrofotómetro UV/VIS (Evolution 300 Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en mg de ácido tánico (Sigma) por 100 g de materia seca, con base en la ecuación de la curva estándar (y=1.6571x-0.016, R²=0.9932).

Taninos condensados. Estos compuestos se cuantificaron con el método propuesto por Makkar et al. (1993), a 550 nm en un espectrofotómetro UV/VIS (Evolution 300 Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en mg de ácido tánico (Sigma) por 100 g de materia seca de acuerdo con la ecuación:

Taninos condensados (%)=A550nm×78.26×Factor de dilución%MS

dónde A es absorbancia, 78.26 es el factor de corrección, % MS es porcentaje de materia seca.

Flavonoides. Estos compuestos se cuantificaron con el método de Chang et al. (2002) a 415 nm en un espectrofotómetro UV/VIS (Evolution 300, Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en mg equivalentes de quercetina (Sigma) por 100 g de materia seca de acuerdo con la ecuación de la curva estándar (y=6.0143x-0.0084, R²=0.9984).

El beneficiado del fruto se realizó siguiendo la descripción de Xochipa-Morante et al. (2016).

Análisis estadístico

Para analizar los resultados de las pruebas cualitativas por cromatografía en capa fina se obtuvieron tablas de contingencia. La concentración de los compuestos fenólicos totales, taninos totales, taninos condensados y flavonoides, de nueve repeticiones de hoja y tallo, y cuatro de flor y vaina beneficiada, de cada sitio de recolecta, se realizó ANDEVA. La diferencia entre medias por recolecta y entre tejidos se evaluó con la prueba de Tukey (α=0.05) con el paquete estadístico SAS versión 9.0 (SAS Institute Inc., 2002).

Resultados y Discusión

Análisis cualitativo por cromatografía en capa fina

Los grupos de fitoquímicos más abundantes, identificados por CCF, variaron entre los tejido (Cuadro 2): 1) los terpenoides (17 a 20 bandas) se producen comúnmente en tejidos vegetales, flores y ocasionalmente en raíces (Dudareva et al., 2004), su presencia en vainilla pudo deberse a que es el grupo de metabolitos secundarios vegetales más abundante y diverso en estructura química, y su papel es importante en la interacciones planta-insecto, planta-patógeno y planta-planta (Paschold et al. 2006); 2) las saponinas (16 a 18 bandas) son un tipo de terpenoide, habitualmente participan activamente en los procesos de regulación del crecimiento vegetal y las variaciones en su distribución, composición y concentración en las plantas también se atribuyen a las reacciones de las especies al ambiente (Moses et al., 2014) y 3) flavonoides (14-18 bandas), su síntesis en las plantas se reconoce como una reacción a infección por microorganismos (Dixon et al., 1983), ayudan a combatir el estrés oxidativo y actúan como reguladores del crecimiento (Kumar y Pandey, 2013). En general, las hojas presentaron diversidad mayor de metabolitos (19 a 22 bandas), quizá por su actividad metabólica mayor, que además de la fotosíntesis, la exposición a la luz modula la síntesis y presencia de fitoquímicos que protegen a las plantas contra patógenos o herbívoros; esos compuestos pueden incluso depositarse en el exterior de las hojas, como ceras y cutina (Vivanco et al., 2005).

Cuadro 2 Número de bandas por grupo químico, observadas en cromatografía en capa fina, en extractos de hoja (H), tallo (T), flor (F) y vaina beneficiada (Vb) de Vanilla planifolia de tres sitios de recolecta de la Huasteca Hidalguense, México. 

Sitio de recolecta Tejido Flav* Sap Tan Alc CFT Terp** Total
Número de bandas
Huizotlaco H 5 5 1 2 2 5 20
T 4 4 1 2 1 2 14
F 5 4 1 2 1 4 17
Vb 1 3 1 2 2 6 15
Total 15 16 4 8 6 17 66
Coacuilco H 6 4 0 2 2 5 19
T 6 5 1 2 1 5 20
F 5 4 1 2 2 3 17
Vb 1 3 1 2 2 5 14
Total 18 16 3 8 7 18 70
Contepec H 4 7 0 2 2 7 22
T 4 7 0 2 2 5 20
F 5 2 0 2 2 3 14
Vb 1 2 1 2 3 5 14
Total 14 18 1 8 9 20 70

*Extractos metanólicos de flavonoides, saponinas, taninos, alcaloides y compuestos fenólicos totales; **extracto hexánico de terpenoides

La presencia de metabolitos por tejido dependió del sitio de recolecta. Los flavonoides mostraron más bandas (6) en hojas y tallos de Coacuilco; las hojas y tallos de Contepec destacaron por el número mayor correspondiente a saponinas (7 bandas), terpenoides en hoja (7) y compuestos fenólicos totales en vaina beneficiada (3). En los tejidos de los tres sitios de recolecta hubo menos bandas (1-2) de taninos y alcaloides (Cuadro 2). Shanmugavalli et al. (2009) documentaron resultados similares, ya que detectaron trazas de estos dos grupos en hojas y tallos de V. planifolia, en condiciones naturales, en India.

Análisis cuantitativo

Los principales grupos de fitoquímicos en tejidos mostraron coeficientes de variación (CV) entre 7 y 15 %, el mayor correspondió a los taninos condensados. En todas las variables se observaron diferencias altamente significativas (p<0.0001) (Cuadro 3).

Cuadro 3 Media, coeficiente de variación (CV) y cuadrados medios de componentes fitoquímicos por sitio de recolecta y tejido y su interacción en Vanilla planifolia de la Huasteca Hidalguense, México. 

Variable (mg·100 g-1 MS) Media CV (%) Cuadrados medios
Sitio Tejido Sitio*Tejido Error
Compuestos fenólicos totales 302.844 7.580 44 666.961*** 1 008 918.109*** 7936.734*** 526.935
Flavonoides 94.236 10.940 12 654.398*** 16 701.632*** 2241.404*** 106.287
Taninos totales 56.197 11.021 12 99.700*** 103 69.071*** 1011.244 *** 38.367
Taninos condensados 23.179 14.250 332.960*** 5223.171*** 822.119*** 10.909

*** p<0.0001 y CV: coeficiente de variación.

La concentración de los componentes fitoquímicos varió ampliamente entre los sitios de recolecta. El material vegetal de Contepec tuvo la concentración mayor de compuestos fenólicos totales y taninos totales. El de Coacuilco tuvo la concentración mayor de flavonoides y taninos condensados, y el de Huizotlaco presentó la concentración menor de todos los componentes evaluados (Cuadro 4).

Cuadro 4 Componentes químicos por sitio de recolecta y en los tejidos de la planta de Vanilla planifolia de la Huasteca Hidalguense, México. 

Factor Compuestos fenólicos totales Flavonoides Taninos totales Taninos condensados
(mg·100 g-1 MS)
Sitio de recolecta
Huizotlaco 252.352c 88.168b 50.236b 22.897b
Coacuilco 318.977b 120.417a 64.009a 27.529c
Contepec 335.099a 74.915c 54.345b 19.654a
DMS 15.952 7.164 4.119 2.444
Tejido
Hoja 166.245d 127.023a 52.414b 40.992a
Tallo 212.372c 64.243c 46.250c 28.572b
Flor 298.692b 71.026c 41.145c 8.336c
Vb 749.608a 111.860b 102.141a 0.382d
DMS 21.503 9.632 5.664 3.202

Valores promedio con la misma letra en una columna y por factor no son estadísticamente diferentes (Tukey p(0.05). Vb: vaina beneficiada y DMS: diferencia mínima significativa

La vaina beneficiada presentó la concentración mayor de compuestos fenólicos totales (Cuadro 4), aparentemente porque contribuyen ampliamente (1 000 a 3 000 mg 100 g-1 MS) al aroma de las vainas beneficiadas (Shina et al., 2008) y favorecen la actividad antioxidante de extractos de vainas curadas (Rojas-López y Cañizares-Macías, 2013).

La hoja fue el tejido con concentración mayor de flavonoides, pero su contenido fue considerablemente menor al del té (Camelia sinensis) (611 mg 100 g-1 MS), el cual tiene gran capacidad antioxidante (Pereira et al., 2014) (Cuadro 4). La vaina beneficiada mostró la concentración mayor de taninos totales, pero correspondió a menos de la mitad en algunos frutos frescos, como el arándano (233 mg 100 g-1) (Vázquez-Flores et al., 2012), o incluso frutos que tienen un proceso de beneficio, como el café tostado (270 mg 100 g-1) (Savolainen, 1992). Las hoja mostraron la concentración mayor de taninos condensados y les siguieron los tallos; estos compuestos pueden contribuir a la protección de los tejidos, que como otros están expuestos a patógenos, herbívoros y radiación UV (Brillouet et al., 2013).

La concentración mayor de compuestos fenólicos totales se observó en flores y vaina beneficiada de Contepec, respecto a los otros sitios de recolecta y tejidos. Esto coincidió con los resultados de los componentes del aroma (principalmente compuestos fenólicos) en vainas beneficiadas del mismo sitio de recolecta, que mostraron concentración alta de ácido vaníllico y media de vainillina (Delgado-Alvarado et al., 2016). Hojas, tallos y flores de Coacuilco y la vaina beneficiada de Contepec mostraron concentración mayor de flavonoides y taninos totales (Cuadro 5). La concentración mayor de taninos condensados la presentaron los tallos de Coacuilco, las hojas procedentes de Huizotlaco y las flores y la vaina beneficiada de Contepec (Cuadro 5). Estas diferencias entre sitios de recolecta pueden atribuirse a las condiciones de cada sitio; Coacuilco está a altitud mayor, respecto a los otros sitios (Cuadro 1), por lo que la temperatura difiere y puede generar estrés en las plantas y favorecer la producción de esos compuestos.

Cuadro 5 Concentración de fenoles totales (CFT), flavonoides (Flav), taninos totales (TT) y taninos condensados (TC) en tejidos de Vanilla planifolia recolectados en localidades de la Huasteca Hidalguense, México. 

Sitio de recolecta/ tejido CFT Flav TT TC
(mg·100 g-1MS)
Huizotlaco
Hoja 125.591d 122.708a 52.326b 46.106a
Tallo 160.024c 48.295c 37.424c 23.152b
Flor 183.469b 74.947b 37.731c 4.586c
Vb 719.115a 113.388a 86.869a 0.213c
DMS 22.545 17.382 8.323 7.357
Coacuilco
Hoja 194.510d 143.505a 55.525bc 33.969b
Tallo 252.850c 120.361ab 66.858b 52.775a
Flor 335.290b 81.059b 43.430c 7.123c
Vb 731.490a 107.914c 97.265a 0.407d
DMS 53.63 24.411 13.177 6.418
Contepec
Hoja 164.500d 108.773a 49.390b 42.048a
Tallo 224.240c 42.779b 34.468c 16.051b
Flor 377.320b 57.071c 42.275bc 13.30b
Vb 798.220a 114.280a 122.290a 0.526c
DMS 30.507 7.059 8.808 3.872

Medias con la misma letra en cada variable y por cada sitio de recolecta no son estadísticamente diferentes (Tukey p(0.05). Vb: vaina beneficiada.

Cola parchycarpa y Cola lepidota crecen en condiciones geográficas y ambientales diferentes y el sitios de recolecta determina la presencia y concentración de fitoquímicos en las estructuras vegetales (Ene-Obong et al., 2016). Además, en V. planifolia las diferencias entre tejidos también pueden asociarse a la etapa de desarrollo y condiciones de crecimiento de la planta, puesto que los tejidos más jóvenes tienden a concentrar cantidad mayor de fitoquímicos (Palama et al., 2010). Esos metabolitos suelen transportarse de la raíz a los tallos y las hojas, vía xilema o floema, y almacenarse en estructuras reproductivas, como flores y vainas (Wink y Schimmer, 2010).

Con base en lo anterior, la región de recolecta de mayor interés podrían ser Coacuilco, porque las hojas y tallos recolectados ahí presentaron la concentración mayor de flavonoides y taninos totales, y Contepec porque las vainas y las flores presentaron la concentración mayor de compuestos fenólicos totales y taninos condensados. En contraste, en Huizotlaco todos los tejidos vegetales mostraron la concentración menor de metabolitos secundarios. Estos resultados permiten sugerir la conveniencia de investigar el efecto de otros factores que favorezcan la síntesis de metabolitos en la planta de vainilla.

Conclusiones

La concentración de los componentes fitoquímicos varió en función del tejido y del sitio de la recolecta de vainilla. Entre los tejidos, la hoja tuvo la mayor concentración de flavonoides y taninos condensados, la vaina beneficiada tuvo la concentración mayor de compuestos fenólicos totales y taninos totales. Las plantas recolectadas en Coacuilco y Contepec tuvieron contenido mayor de compuestos fenólicos, flavonoides y taninos (totales y condensados) y las de Huizotlaco tuvieron perfil diferente con las concentraciones menores de los fitoquímicos.

Agradecimientos

Al fondo SAGARPA-CONACYT a través del proyecto 2012-04-190442 “Estrategia de investigación aplicada para el fortalecimiento, innovación y competitividad de la vainilla en México” (SP-14).

Literatura citada

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Recibido: Octubre de 2016; Aprobado: Abril de 2017

*Autor responsable: adah@colpos.mx

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