Explantes para experimentos in vitro y ex vitro

Las plántulas asépticas obtenidas de la germinación in vitro de semillas de A. leiocarpa, de tres plantas madre, se establecieron en Wood Plant Medium (WPM) (^{Lloyd y McCown, 1980}) por 15 d (Figura 1A). La parte aérea de las plántulas se seccionó en segmentos nodales (Figura 1B), que se mantuvieron 30 d en el medio WPM más suplemento con 8.8 μM de bencilaminopurina (BAP), y luego se transfirieron a un medio sin BAP otros 30 d. Los brotes formados al final de este período (Figura 1C) se seccionaron nuevamente en segmentos nodales, con sólo un brote y se usaron para el enraizamiento in vitro y ex vitro (Figura 1D). El sistema radicular y la parte aérea remanente en las plántulas asépticas, denominadas microcepas, se mantuvieron en el medio WPM más suplemento con BAP 8.8 μM por 30 d y después se trasladaron a un medio libre de BAP donde permanecieron 30 d más (Figura 1E). Los brotes formados desde las microcepas (Figura 1F) se seccionaron en microcortes de un brote, que también se usaron para experimentos de enraizamiento in vitro y ex vitro (Figura 1G). Así, los explantes difirieron en origen. Segmentos nodales se produjeron desde los segmentos aéreos, mientras que los microcortes se produjeron desde microcepas formados por el sistema radicular y la parte aérea restante.

Figure 1 Etapas para obtener segmentos nodales y microcortes utilizados en el enraizamiento de Apuleia leiocarpa. 

Enraizamiento in vitro y aclimatación

Para el enraizamiento in vitro, se cultivaron segmentos nodales y microcortes de un brote de 1.0 a 1.5 cm de longitud en tubos de cultivo de vidrio (50 mL) que contenían aproximadamente 10 mL del medio WPM con 30 g de sacarosa L^-1, 6 g de agar L^-1, 0.1 g de inositol L^-1 y 1.5 g de carbón activado L^-1. El medio de cultivo se esterilizó 20 min por autoclave a 121 °C y presión de 1 atm. El pH se ajustó a 5.8 antes del autoclavado y todos los cultivos se mantuvieron en una habitación de crecimiento a una temperatura de 25±2 °C en un fotoperíodo de 16 h bajo una intensidad de luz de 14.3 μE m^-2 S^-1 suministrado por lámparas fluorescentes. Se probaron concentraciones de 0, 4.9, 9.8, 14.7 y 19.6 μM de ácido indolbutírico (IBA). El experimento fue un factorial 2 x 5 (tipo de explante y concentración de IBA), con cinco repeticiones de cuatro explantes. Los porcentajes de supervivencia y enraizamiento y el número y la longitud (cm) de las raíces se evaluaron después de 60 d en cultivo.

Para la aclimatación, los explantes arraigados in vitro en cinco concentraciones de IBA se retiraron de los tubos de cultivo de vidrio. Las raíces se lavaron con agua corriente y se transfirieron al azar a macetas de plástico individuales (330 mL), con cerca de 110 g de sustrato; antes, esto se esterilizó 1 h en autoclave. Se evaluaron proporciones iguales de sustrato comercial + vermiculita + arena gruesa y sustrato comercial + vermiculita. En todos los tratamientos se usaron sustrato comercial de corteza de pino (H.DECKER^®), vermiculita mediana (partículas entre 0.50 y 1.19 mm de diámetro) y arena gruesa (partículas entre 1.0 y 3.0 mm de diámetro). Los recipientes se mantuvieron en una sala de cultivo en bandejas de plástico (55 x 34 x 15 cm) cubiertas con una película de PVC transparente. El riego se aplicó cada día con agua destilada para mantener la humedad del sustrato. Una vez a la semana, se aplicó un riego con una solución nutritiva (mmol): 0.61 nitrato de potasio, 1.0 nitrato de calcio, 1.67 sulfato de magnesio, 0.14 nitrato de amonio, 0.14 monofosfato de potasio y 0.16 % hierro quelado. Los micronutrientes se añadieron a la solución nutritiva en una solución preparada (mmol): 0.015 molibdato sódico, 0.089 ácido bórico, 0.125 sulfato de cobre, 0.123 sulfato de manganeso y 0.028 sulfato de zinc. El experimento se hizo con un diseño completamente aleatorio, con dos tratamientos y ocho repeticiones de cuatro contenedores con una plántula. Después de 30 d de crecimiento, se evaluó el porcentaje de supervivencia, la altura de la parte aérea (cm) y el número de hojas.

Enraizamiento y aclimatación ex vitro

Segmentos nodales y microcortes de un brote (Figura 1) de una longitud de 1.0 a 1.5 cm, excisados de los brotes producidos durante la multiplicación in vitro, se colocaron con la base sumergida en una solución con 0 o 4920 μM de IBA, por 10 s. Luego se cultivaron en recipientes de plástico (50 mL) que contenían cerca de 20 g de sustrato, ya esterilizados en autoclave 1 h. Proporciones iguales de las composiciones de sustrato fueron evaluadas: sustrato comercial + vermiculita + arena gruesa, sustrato comercial + vermiculita, y sustrato comercial + arena gruesa. Sustrato comercial de corteza de pino y vermiculita de grano medio se utilizaron. Los contenedores se mantuvieron 7 d en bandejas cubiertas con película de PVC transparente en una habitación a 25±2 °C y fotoperiodo de 16 h con una intensidad luminosa de 14,3 μE m^-2s^-1 suministrada por lámparas fluorescentes. Dos riegos con agua destilada se aplicaron cada día para mantener la humedad del sustrato. Luego los cultivos se trasladaron a una cámara húmeda en un invernadero aclimatado donde se cultivaron 45 d. El diseño experimental fue completamente al azar y con arreglo factorial 2 x 2 x 3 (tipo de explante, concentración de IBA y composición del sustrato), con cinco replicaciones de cinco contenedores con un explante. Después de 7, 15, 30 y 45 d en una cámara húmeda, se evaluó el porcentaje de supervivencia y enraizamiento y el número y longitud (cm) de las raíces en los explantes.

Los datos porcentuales fueron transformados por la función arco-seno de x/100 y ANOVA. Los promedios se compararon mediante la prueba de Tukey con p=0.05, utilizando el software ESTAT (^{Estat, 1994}).

Enraizamiento in vitro y aclimatación

Para el enraizamiento in vitro, no hubo interacción entre el tipo de explante y la concentración de IBA para todas las variables analizadas a los 60 d. Para la supervivencia, el enraizamiento y la longitud de la raíz, hubo diferencias en el tipo de explante, con los mejores resultados encontrados en segmentos nodales (97.5 % de supervivencia, 28.9 % de enraizamiento y 6.2 cm de longitud media de raíz) en comparación con microcortes (Cuadro 1). Tanto los segmentos nodales como los microcortes se originan de órganos meristemáticos preformados (yema axilar), que por lo general presentan un crecimiento y uniformidad satisfactorios (^{Watt et al., 2003}). Creemos que las diferentes respuestas entre los tipos de explantes no derivan de diferentes competencias morfogénicas, ya que se forman a partir del mismo tejido meristemático, sino más bien porque presentan diferentes concentraciones endógenas de fitohormonas. La síntesis de auxina ocurre en el ápice de la planta y presenta un movimiento unidireccional en los tejidos parenquimatosos hacia el ápice de la raíz (^{Taiz y Zeiger, 2013}). Debido a esto, la mayor capacidad de enraizamiento en los segmentos nodales de A. leiocarpa puede estar relacionada con una mayor cantidad de auxina endógena en comparación con la de los microcortes, ya que esta fitohormona actúa como un señalizador celular en el enraizamiento.

Cuadro 1 Porcentajes de supervivencia y enraizamiento y número y longitud de raíces formadas a partir de segmentos nodales y microcortes de Apuleia leiocarpa cultivadas in vitro durante 60 días en medio WPM con cinco concentraciones de IBA. 

† Valores dentro del mismo factor con letra diferente son estadísticamente diferentes (p≤0.05). SE: Error estándar; CV: coeficiente de variación.

En contraste a nuestros resultados, ^{Pimentel et al. (2016)} encontraron que los explantes de microcortes de Handroanthus heptaphyllus mostraron una mejor respuesta de enraizamiento in vitro en comparación con los segmentos nodales.

Las concentraciones de IBA no influyeron en las variables evaluadas, excepto en la longitud de la raíz, donde se observaron los mejores resultados en explantes cultivados en un medio sin IBA o con 9.8 μM IBA (Cuadro 1). Muchas especies forestales presentan dificultades de enraizamiento adventicio, incluso en un medio de cultivo con suplemento de auxinas, lo que indica que otros factores influyen en la diferenciación de los tejidos durante este proceso (^{Souza y Junghans, 2006}). Además, es posible que las concentraciones de IBA utilizadas no fueran adecuadas para favorecer el enraizamiento in vitro de A. leiocarpa. También se observó enraizamiento in vitro ineficiente en Lavandula angustifolia (Miller) tratado con 0.5, 1.0 y 2.0 -μM de IBA (^{Machado et al., 2013}).

En la aclimatación de las plántulas de A. leiocarpa producidas in vitro, las composiciones de sustrato evaluadas no afectaron la supervivencia, la altura de la parte aérea y el número de hojas, con una media de 73.4 % de plántulas supervivientes después de 30 d de crecimiento (Cuadro 2). En la aclimatación de Cydonia oblonga Mill. de plántulas micropropagadas, hubo 81.8 % de supervivencia a los 30 d cuando se utilizó sustrato comercial y vermiculita (v/v 1: 1) (^{Erig et al., 2004}). Las plántulas de Stryphnodendron adstringens Mart. obtenidas de un enraizamiento in vitro presentaron 41 % de supervivencia cuando se aclimataron en sustrato comercial y vermiculita (v/v 1: 1), a los 30 d de crecimiento (^{Nicioli et al., 2008}).

La combinación de suelo y vermicompostación (v/v 3: 1) resultó en una supervivencia de 80 % de las plántulas de Azadirachta indica A. Juss después de 30 d de aclimatación (^{Reddy et al., 2006}). La supervivencia promedio fue 73 % en las plántulas de Pterocarpus santalinus L. durante la aclimatación, en una combinación de estiércol orgánico y arena (v/v 1: 1) (^{Balaraju et al., 2011}). En nuestro estudio, las condiciones de aclimatación proporcionadas durante la transición del estado heterotrófico al autotrófico pueden haber sido adecuadas para favorecer la supervivencia de las plántulas.

Cuadro 2 Porcentaje de supervivencia, altura de la parte aérea y número de hojas de las plántulas de Apuleia leiocarpa enraizadas in vitro y aclimatadas durante 30 días en sala de crecimiento. 

^†Valores con diferente letra son estadisticamente diferentes (p≤0.05). SE: Error estándar; CV: coeficiente de variación.

^¶Proporciones iguales (v/v) de sustrato comercial (CS), vermiculita (V) y arena gruesa (S).

Enraizamiento ex vitro y aclimatación

No hubo interacción significativa entre los tipos de explantes, la concentración de IBA o el sustrato para todas las variables analizadas a los 7, 15, 30 y 45 d. La formación de raíces ocurrió sólo a los 30 d de crecimiento, pero sin diferencias entre los tipos de explantes, la concentración de IBA o el sustrato para cualquiera de las variables analizadas. A los 45 d de evaluación, la supervivencia fue afectada sólo por el tipo de explante, con la mejor respuesta en los segmentos nodales, comparada con los microcortes (Cuadro 3). Para el enraizamiento ex vitro, las mejores respuestas fueron en los segmentos nodales (14.6 % de enraizamiento), 4920 μM de IBA (12 % de explantes enraizados) y en sustrato comercial + vermiculita + arena gruesa (14 % de explantes enraizados) (Cuadro 3).

Cuadro 3 Porcentaje de supervivencia y enraizamiento de los segmentos nodales de Apuleia leiocarpa y microcortes tratados con IBA y cultivados ex vitro durante 45 días en diferentes sustratos 

^†Los valores dentro del mismo factor seguidos por la misma letra no difieren en la prueba de Tukey con p=0.05. SE: Error estándar; CV: coeficiente de variación.

^¶Proporciones iguales (v/v) de sustrato comercial (CS), vermiculita (V) y arena gruesa (S).

A pesar del pequeño número de unidades experimentales evaluadas en nuesro estudio, estos resultados sugieren que los segmentos nodales responden mejor al enraizamiento ex vitro en comparación con los microcortes. Además, para el enraizamiento ex vitro en A. leiocarpa, el uso de IBA es necesario, contrario a los hallazgos en el enraizamiento in vitro. En los brotes obtenidos de la multiplicación in vitro de Tectona grandis L. tratada con 4920 μM IBA y cultivada en sustrato comercial o vermiculita, se observó un enraizamiento ex vitro de 100 % a los 30 días de crecimiento, mientras que en los no tratados con IBA se observó un 85 % de enraizamiento en vermiculita y 95 % de enraizamiento en sustrato comercial (^{Fermino et al., 2011}). Los microcortes de T. grandis tratados con 2460 μM de IBA resultaron en 85 % de enraizamiento en vermiculita a los 30 d (^{Ramesh et al., 2009}). Los microcortes de Dalbergia sissoo Roxb. tratados con 984 μM IBA presentaron 90 % de enraizamiento ex vitro en turba comercial, perlita y vermiculita (^{Vibha et al., 2014}).

En número de raíces y longitud, hubo concentración de IBA y efectos de la composición del sustrato a los 45 d de crecimiento (Cuadro 3). El mayor número y longitud de raíces se obtuvieron en cultivos no tratados con IBA, con promedios de 1.6 y 1.4 cm respectivamente, o cultivados en sustrato comercial + vermiculita + arena o en sustrato comercial + vermiculita (Cuadro 3). Con base en el análisis físico, la composición de proporciones iguales de sustrato comercial + vermiculita + arena presentó densidad seca de 770.7 kg m^-3, porosidad de aireación de 25.3 % y la capacidad de retención de agua de 38.7 %. Mientras que el substrato comercial + vermiculita presentó 277.8 kg m^-3 de densidad seca, 19.9 % de porosidad de aireación y 57.2 % de capacidad de retención de agua, y el sustrato comercial + arena presentó densidad seca de 997.1 kg m^-3, 29.6 % de porosidad de aireación y 30.9 % de capacidad de retención de agua. En el sustrato comercial + vermiculita + arena y sustrato comercial + arena, se reportó una mayor densidad seca en comparación con valores de referencia entre 400 y 500 kg m^-3 (^{Bunt, 1973}). Este resultado se puede explicar por la presencia de arena en estas mezclas, que es un componente altamente denso. Las tres combinaciones de sustratos probadas en muestreo estudio presentaron una porosidad de aireación adecuada, dentro del rango recomendado por ^{De Boodt y Verdonck (1972)}, entre 20 y 40 %. Para la producción de plántulas de Sesbania virgata Cav. Pers, la porosidad de aireación de hasta 25 % aumentó la producción de raíces después de 150 d (^{Delarmelina et al., 2014}).

Valores más altos de capacidad de retención de agua se observaron en el sustrato comercial + vermiculita + arena y sustrato comercial + arena, lo cual puede estar relacionado con la menor proporción de arena en comparación con el substrato comercial + arena. Así, los mayores explantados de A. leiocarpa enraizados en sustrato comercial + vermiculita + arena (Cuadro 3) pueden estar asociados a una mayor capacidad de retención de agua derivada de esta composición del sustrato.

Los resultados de muestreo estudio demuestran que A. leiocarpa es una especie con difícil enraizamiento in vitro y ex vitro, dado que los mayores porcentajes de enraizamiento fueron 28.9 % y 14.0 %, respectivamente. Tanto en el enraizamiento in vitro como en el ex vitro, los segmentos nodales presentaron una mayor capacidad de enraizamiento que los microcortes. Sin embargo, aunque hubo un enraizamiento significativamente mayor en los segmentos nodales, ambos explantes presentaron enraizamiento in vitro. Además, al considerar que el mantenimiento de microcepas puede ser una estrategia importante para aumentar la tasa de multiplicación en A. leiocarpa, es necesario realizar más estudios para encontrar soluciones que minimicen estas diferencias. En relación al uso de auxina, las concentraciones de IBA evaluadas no alteraron el porcentaje de enraizamiento in vitro, pero sí favorecieron el enraizamiento ex vitro. En el enraizamiento ex vitro, 14 % de los explantes enraizados en sustrato comercial + vermiculita + arena, muestran que ajustes son necesarios para definir mejor las condiciones ideales para el enraizamiento ex vitro y la aclimatación de las plántulas de A. leiocarpa. Además, estas plántulas pueden utilizarse en setos micro-clonales (para la producción de plántulas por microcortes), con lo cual su producción masiva sería técnicamente viable.