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Agrociencia

versión On-line ISSN 2521-9766versión impresa ISSN 1405-3195

Agrociencia vol.51 no.8 México nov./dic. 2017

 

Protección Vegetal

Producción de ácido jasmónico por fermentación líquida con cepas de Botryodiplodia theobromae nativas del sureste mexicano

Elan I. Laredo-Alcalá1 

José L. Martínez-Hernandez2 

Lourdes Guillen-Cisneros3 

Francisco D. Hernández-Castillo1  * 

1 Departamento de Parasitología Agrícola. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Calzada Antonio Narro No. 1923. 25315. Buena Vista, Coahuila, México. (elan_laredo@hotmail.com).

2 Cuerpo Académico de Nanobiociencia de la Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Coahuila. 25280. Saltillo, Coahuila, México. (jose-martinez@uadec.edu.mx).

3 Centro de Investigación en Química Aplicada. Boulevard Enrique Reyna Hermosillo No.140. 25294. Saltillo, Coahuila, México. (lourdes.guillen@ciqa.edu.mx).

Resumen

El ácido jasmónico (AJ) es una hormona endógena reguladora del crecimiento de plantas en las especies vegetales. Interviene en senescencia y resistencia y lo produce la planta después del daño ocasionado por microorganismos o insectos patógenos. Una alternativa para su producción es usar microorganismos y el más usado es Botryodiplodia theobromae. El objetivo de este estudio fue evaluar la producción de AJ mediante fermentación líquida con cepas de B. theobromae, aisladas de zonas tropicales del sureste de México. El diseño experimental fue completamente al azar y evaluamos la capacidad de producción de AJ de cada cepa.Los datos se analizaron con ANDEVA y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05) para lo cual se usó el programa SAS. Un estudio cinético de producción se desarrolló con la cepa más productora de AJ mediante evaluación de pH, consumo de sustrato, biomasa y producción de AJ. Veinte cepas de B. theobromae se aislaron desde cacao, maracuyá, mango, coco y papaya en campos experimentales de los estados de Veracruz y Tabasco, México. Cinco de esas cepas produjeron AJ y el metabolito inicio su producción desde el día 10 de bioreacción. Así, se mostró que el hongo fitopatógeno de zonas tropicales B. theobromae puede producir AJ en un sistema de fermentación líquida.

Palabras clave: Botryodiplodia theobromae; bioproducción; jasmonatos; metabolitos secundarios; fitohormona

Introducción

La resistencia natural de las plantas a patógenos se basa en efectos combinados de barreras preformadas y mecanismos inducibles, por lo cual las plantas utilizan protección física y bioquímica en contra de los invasores (Rangel et al., 2010). Las hormonas vegetales son moléculas pequeñas de naturaleza química diversa, que controlan procesos como el crecimiento y desarrollo de la planta y su respuesta frente al estrés biótico y abiótico. El etileno, el ácido jasmónico (AJ) y el ácido salicílico son reguladores del crecimiento vegetal con función documentada en la respuesta de la planta (Lumba y Culter, 2010). El AJ es miembro de un grupo hormonal conocido como jasmonatos, de origen lipídico y lo genera la planta en respuesta al daño producido por microorganismos o insectos patógenos. El AJ actúa como molécula señal de las respuestas de las plantas a situaciones de estrés y participa en procesos del crecimiento y desarrollo (Avanci et al., 2010; Pauwels y Goossens, 2011; Ting et al., 2014). La aplicación exógena de este compuesto puede promover positivamente diversas funciones vegetales (Rohwer y Erwin, 2010). Hasta ahora se busca potencializar su uso en el campo, mediante tres alternativas de producción: síntesis química, extracción de tejidos vegetales y uso de metabolismo microbiano. De ellos, la síntesis química y la extracción de tejido vegetal presentan muy bajo rendimiento y costos altos (Dhandhukia y Thakkar, 2007). Una de las alternativas con resultados mejores es usar metabolismo microbiano en sistemas de fermentación. El hongo Botryodiplodia theobromae que ha mostrado los mejores rendimientos de producción de AJ (Aldridge et al., 1971). Botryodiplodia theobromae es un hongo fitopatógeno en cultivos de zonas tropicales que causa pudriciones en frutos; en fruto de mango causa la pudrición del pedúnculo, lo cual genera pérdidas en la cosecha, dificulta el almacenamiento prolongado, reduce la calidad del fruto y dificulta su comercialización (Mirzaee et al., 2002; Tovar et al., 2013). Pero, por su capacidad productora, el AJ es un microorganismo de interés científico porque el método de producción genera rendimientos satisfactorios y su impacto ecológico es bajo o casi nulo.

El objetivo de este estudio fue determinar la producción de AJ por cepas de B. theobromae aisladas en los estados de Veracruz y Tabasco, México, y evaluar la cinética de producción de la cepa con el rendimiento mayor. La hipótesis fue que al menos una de las cepas probadas produciría AJ en concentraciones similares o superiores a los 300 mg L-1, la cual es la concentración mínima óptima reportada en la literatura.

Materiales y Métodos

Recolección de tejido vegetal, aislamiento e identificación del microorganismo

El tejido vegetal recolectado fue de frutos, cortezas y ramas de mango (Mangifera indica L.), coco (Cocos nucifera L.), maracuyá (Passiflora edulis L.), papaya (Carica papaya L.), guaraná (Paullinia cupana L.) y cacao (Theobroma cacao L.). Estos tejidos se recolectaron en los campos experimentales Cotaxtla y Huimanguillo del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias, en los estados de Veracruz y Tabasco. El campo Cotaxtla está ubicado en el kilómetro 34.5 carretera federal Veracruz-Córdoba, col. S/colonia, Medellín de Bravo. 94270. Veracruz; el campo experimental Huimanguillo se encuentra en el kilómetro 1 carretera Huimanguillo-Cárdenas, Huimanguillo. 86400. Tabasco. El aislamiento se realizó en el laboratorio de fitopatología del departamento de parasitología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Para esta etapa se usaron los tejidos vegetales que presentaran síntomas de infección como picnidios y pudrición de color negra, los cuales se cortaron en trozos pequeños y desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1.5 % en agua (v/v) por 2 min, se lavaron 1 min con agua destilada estéril por triplicado y se secaron sobre papel absorbente en una campana de flujo laminar. Cuatro trozos de tejido de cada muestra se colocaron sobre cajas Petri con medio PDA ubicados en puntos cardinales dentro de esta misma (Contreras, 2016). Las placas se incubaron 7 d a 28±1 °C, se realizó una resiembra por cultivo monospórico, y las cepas se identificaron mediante comparación morfológica macroscópica y microscópica con base en el color, la forma de la colonia, el crecimiento miceliar, esporulación y forma de conidios (Alves et al., 2008).

Producción de ácido jasmónico: fermentación líquida

Para la evaluación de producción de AJ por fermentación líquida se usó la metodología propuesta por Michelena (2001): en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL del medio Miersch modificado se esterilizaron 15 min en autoclave de presión, para inocular el medio se usaron tres fragmentos de 5 mm de diámetro del micelio pre cultivado (obtenidos de siembras realizadas en placas Petri) sobre PDA a 28 °C por 3 d. Después, los matraces se incubaron 15 d en oscuridad a una temperatura constante de 28 °C sin agitación ni aireación.

Medio de cultivo

La composición del medio Miersch modificado (g L-1) fue: sacarosa 50 g, KNO3 3 g; MgSO47 H2O 0.2g; KCl 0.1g; FeSO4. 7H2O 0.01g; ZnSO4. 7H2O 0.01g; MnSO4 0.001g; Na2MoO4. 2H2O 0.001g; CuSO4. 5H2O 0.001 g y extracto de levadura 0.1 g (Lorenzo et al., 2007).

Determinación de ácido jasmónico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Al concluir la incubación, el caldo de la fermentación se separó del micelio por filtración al vacío, usando papel de filtro Whatman N° 4. Alícuotas de 5 mL del cultivo filtrado se ajustaron a pH 3.0 con HCl (4 M) y se realizaron tres extracciones con acetato de etilo (1:1) en un embudo de separación. Las fracciones con AJ se deshidrataron con sulfato de sodio anhidro, se secaron por rotoevaporación a 50 °C (análisis por triplicado), se resuspendieron en 1 mL de acetato de etilo a un recipiente ámbar y se mantuvo en refrigeración a -4 °C hasta su detección o cuantificación (Dathe et al., 1981).

El AJ se determinó y cuantificó con la técnica descrita por Kramell (1999), con un equipo de cromatografía líquida de alta resolución Hewlett-Packard 1050, con un detector Ultravioleta HP79854A (Palo Alto, California, USA). El estándar fue AJ grado reactivo de la casa comercial SIGMA. La fase móvil estuvo compuesta de metanol-agua (60:40) con ácido acético al 1 % (V/V). El flujo fue 0.85 mL min-1 y con una columna Hypresil ODS (Thermo scientific, Waltham, Massachusetts, USA) (25 cmx4.6 mmx5 µm d.i). La detección se fijó a una longitud de onda de 295 nm.

Cinética de producción de ácido jasmónico y procedimientos analíticos

Una vez seleccionada la cepa con mejor rendimiento, se evaluó su capacidad de producción en relación al tiempo, con tres tiempos: 5, 10 y 15 d. Las condiciones de producción fueron las mismas que en la etapa anterior.

Al terminar la fermentación se realizó una filtración rápida, el sobrenadante se recuperó para análisis posteriores de consumo de sustrato (Dubois et al., 1956), pH (Willard et al., 1974), biomasa (Arnáiz et al., 2000) y ácido jasmónico.

El diseño experimental fue completamente al azar, la variable fue la capacidad de producción de AJ respecto a cada cepa, los datos se analizaron con ANDEVA y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05) para lo cual se usó SAS 9.2.

Resultados y Discusiones

Los síntomas en los tejidos vegetales recolectados fueron manchas oscuras de color café a negro con pequeños puntos negros superficiales y en algunas ocasiones pudriciones alrededor del pedúnculo, específicamente en maracuyá y mango. De los tejidos vegetales recolectados se obtuvieron 20 aislamientos fungosos (Cuadro 1), que en medio de cultivo PDA mostraron: micelio de consistencia algodonosa de un color blanco los primeros 9 d de crecimiento, tornándose después el micelio color negro; además, éste formó picnidios agrupados o en racimos parcialmente sumergidos. El micelio fue septado, con conidios inmaduros no septados (amerospora) y conidios maduros septados (didimosporas) de unas medidas promedio en 20X15 µm, paredes membranosas, carnosas, globosas, con frecuencia papiladas. Esta descripción concuerda con lo descrito por otros autores (Pitt y Hocking, 2009; Picos-Muñoz et al., 2015), quienes reportan las principales características de B. theobromae desarrollado en diversos medios de cultivo, y mencionan que la principal característica de identificación macroscópica es la formación de picnidios, mientras que microscópicamente su conidio es alargado con un septo al centro (Figura 1).

Cuadro 1 Asignación de clave de cepas obtenidas y fuente de origen vegetal. 

Figura 1 Características morfológicas de Botryodiplodia theobromae: A) Micelio cultivado en PDA con 21 d de incubación; B) conidio bicelular (didimospora) y conidio inmaduro (amerospora). 

Producción de ácido jasmónico por fermentación líquida

Al término del proceso de caracterización morfológica se evaluó la producción de AJ. Las muestras resultantes de la fermentación se prepararon y analizaron por cromatografía líquida de alta resolución. De los 20 aislamientos ocho produjeron AJ en un sistema de fermentación líquido. La producción de AJ varió de 6.5 a 552 mg L-1, y el aislamiento con la clave 3B tuvo el rendimiento menor, mientras que el aislamiento 3C mostró la concentración mayor, con 552 mg L-1 (Cuadro 2). La capacidad de los microorganismos fúngicos para sintetizar AJ es variable entre cepas, incluso de la misma especie; así, hay cepas que producen AJ en concentraciones superiores a 1000 mg L-1, mientras que otras producen pocos mg L-1 (Farbood et al., 2001). Además, Gibberella fujikuroi (Miersch et al., 1993), Fusarium oxysporum (Cole et al., 2014) y Pseudomonas syringae (Gimenez-Ibanez et al., 2016) producen AJ en pequeñas concentraciones. Pero desde el primer informe de la producción microbiana del AJ (Broadbent et al., 1968) hasta ahora, se ha mostrado que B. Theobromae tiene mayor potencial para su producción.

Cuadro 2 Aislamientos con capacidad productora de ácido jasmónico. 

* Valores con letra diferente son estadísticamente diferentes (p≤0.05).

La concentración de AJ producido fue similar y superior al promedio en otros experimentos, en los cuales se produjo AJ con el mismo sistema de fermentación líquida con medios de cultivo que contenían altas concentraciones de carbohidratos (Dhandhukia y Thakkar, 2007; Eng et al., 2008).

El análisis estadístico mostró que las cepas 3C, 11E y 2A fueron diferentes (p≤0.05) a las demás cepas y mostraron los rendimientos más altos de AJ. Por lo tanto, se usó la cepa 3C para los siguientes experimentos relacionados con la cinética de producción.

Cinética de producción de ácido jasmónico

Las variables respecto al tiempo fueron el consumo de sustrato, el pH, la producción de biomasa y la producción de ácido jasmónico. Al término del día 5 el microorganismo consumió casi 60 % de los carbohidratos adicionados. El pH disminuyó de 7 a 4.1 en los primeros 5 d de fermentación de manera continua, y este cambio se pudo deber a la acumulación de los metabolitos resultantes del proceso de degradación de sustrato (Marero et al., 1997). Los resultados del estudio de producción de biomasa mostraron una clásica curva de crecimiento microbiana: en los primeros 5 d de bioproceso se presentó la fase de crecimiento exponencial, y en el día 10 inició la fase estacionaria. En nuestro estudio no se apreció la etapa de muerte microbiana porque el experimento no alcanzó el tiempo necesario. Los resultados de la evaluación de AJ mostraron que desde el día 10 la producción de este metabolito comienza en 35.45±1.2 ppm, y después 5 d aumenta drásticamente hasta 564.99±2.1 ppm. El comportamiento observado en nuestro estudio fue similar al reportado por Pinakin (2007), quien realizó un estudio cinético de varias cepas de B. theobromae y obtuvo una producción de 50-100 mg L-1, lo cual muestra que este microorganismo puede producir AJ como metabolito secundario en un bioproceso de fermentación en estado líquido. Además, Castillo (2014) cuantificó e identificó diversas hormonas en un caldo fermentado de tres cepas de B. theobromae y los niveles de producción fueron cercanos a 100 ppm (Figura 2).

Figura 2 Cinética de evaluación de producción de ácido jasmónico por fermentación líquida con las variables pH, consumo de sustrato, producción de biomasa y producción de ácido jasmónico en medio Miersch modificado. 

Conclusiones

En nuestro estudio se obtuvieron e identificaron morfológicamente aislamientos de Botryodiplodia theobromae nativos del sureste mexicano y se mostró que produjeron ácido jasmónico en un sistema de fermentación líquida con rendimientos satisfactorios. El estudio cinético de producción de ácido jasmónico mostró que los aislamientos inician su producción después de 10 d, lo cual demuestra que es un metabolito secundario y, además, que al menos cuatro aislamientos lograron superar la concentración mínima óptima reportada en la literatura.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Jesús Uresti, investigador del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agropecuarias y Pecuarias (INIFAP) del Centro de Investigación Regional Golfo Centro, actualmente La Posta, estado de Veracruz, por la ayuda y atención brindada en la etapa de recolección de muestras.

Literatura Citada

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Recibido: Julio de 2016; Aprobado: Mayo de 2017

* Autor de correspondencia: fdanielhc@hotmail.com

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