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Introducción
El trigo (Triticum aestivum L.) en México se siembra en 683 mil ha y la producción anual es 3.36 millones de t. En la superficie sembrada de cereales ocupa el tercer lugar después del maíz y el sorgo. La producción de 3.17 millones t se obtiene en condiciones de riego y se concentra en los estados de Sonora, Chihuahua y Jalisco. En El Bajío, que incluye a los estados de Guanajuato, Michoacán, Querétaro y Jalisco, se producen 215 000 t (CANIMOLT, 2015; SIAP, 2015). Las enfermedades foliares se consideran las limitantes principales del rendimiento en el cultivo. La roya de la hoja y la roya lineal amarilla, causadas por Puccinia triticina y P. striiformis f. sp. tritici, son las dos enfermedades más importantes y más estudiadas en trigo con riego en El Bajío (Huerta et al., 2012; Solís et al., 2013; Mariscal, 2014). En esta región se observan manchas y tizones foliares causadas por agentes causales desconocidos y contribuyen al reducir el rendimiento de las variedades sembradas. Zillinsky (1984) y Warham et al. (1999) indicaron que los géneros Helminthosporium y Septoria causan estos síntomas en trigo y son los más importantes. Las especies H. sativum, H. tritici-repentis, H. giganteum y H. spiciferum causan los tizones foliares en trigo en el mundo. El hongo S. tritici se identificó como la especie principal causante de las manchas foliares. En México, hay varias especies de Helminthosporium (Osorio et al., 1998) y S. tritici esta en regiones de secano húmedo (Rodríguez et al., 2008). Estos hongos causan pérdidas de rendimiento, de 4 a 38 % (Acharya et al., 2011) y pueden transmitirse por la semilla, lo que causa manchado de grano, pudriciones de raíz y muerte de las plántulas (Zillinsky, 1984).
La hipótesis de nuestro estudio fue que los hongos que causan manchas y tizones foliares en trigo pueden estar en cualquier región donde se siembre el cereal y pueden ocasionar pérdida significativas del rendimiento. El objetivo fue identificar los hongos asociados con manchas y tizones foliares en trigo con riego en El Bajío y conocer su distribución y su frecuencia en esta región.
Materiales y Métodos
Recolecta de tejido foliar
En el estudio se incluyeron 10 variedades de trigo sembradas en 16 localidades de 12 municipios de los estados de Guanajuato, Jalisco y Michoacán (Cuadro 1). Las variedades se sembraron sembradas en cada localidad dentro de los experimentos de rendimiento del Programa de Trigo de Riego del INIFAP. Las variedades Cortázar S94 y Bárcenas S2002 ocupan la superficie mayor sembrada en El Bajío (Solís et al., 2014). Los muestreos se hicieron durante los ciclos agrícolas otoño-invierno de 2012-2013 y 2013-2014, en la etapa de grano lechoso-masoso próximo a la maduración. Con el esquema de cinco de oros, en cada punto se seleccionó una parcela y de dos surcos al azar por parcela se eligieron dos plantas con síntomas de tizones o manchas foliares, y de ellas se seleccionó una hoja con los síntomas por planta. Esto se hizo en cada punto (10 hojas en total), en todos las localidades muestreadas (160 hojas en total). Las hojas se almacenaron en bolsas glicine para preservarlas, se prensaron y secaron para evitar que se quebraran (Zillinsky, 1984). La incidencia de las enfermedades fue natural en todas las variedades y localidades muestreadas, por las condiciones óptimas de temperatura (>25 °C) y humedad relativa (>80 %) y el inóculo, ya que en los sitios evaluados la siembra de cereales es constante, lo que es indispensable para el desarrollo de hongos que infectan el follaje del trigo (Narro, 2000; Mariscal, 2014).
Aislamiento e identificación morfológica de hongos
Las muestras se procesaron y la identificación morfológica se realizó en el Laboratorio de Fitopatología del INIFAP-CEBAJ; las técnicas moleculares se efectuaron en el Laboratorio de Biotecnología de la misma institución. Las hojas recolectadas se procesaron con el protocolo de Zillinsky (1984). De cada hoja bandera se cortó una porción central de 8 cm de longitud, se desinfectó por 90 s con hipoclorito de sodio al 5 %. Las porciones se lavaron con agua destilada estéril tres veces y se secaron en papel absorbente estéril. Dos porciones de hoja se pusieron por cámara húmeda. Estas fueron cajas Petri (Ø=10 cm) con papel filtro absorbente estéril humedecido con agua destilada estéril. Las cámaras se sellaron con parafilm, se etiquetaron y mantuvieron a 24 °C, 48 h, se revisaron y luego cada 24 h según la tasa de crecimiento de los hongos. La identificación se hizo mediante las características de las colonias y observación directa de la morfología de los conidios en el microscopio estereoscópico (Motic®, Modelo SMZ168TH, Motic, China). También se observaron en el microscopio compuesto (Motic®, Modelo BA410, Motic, China) preparaciones temporales con lactofenol al 10 %. La identificación morfológica se realizó con los descriptores utilizados por Leslie y Summerell (2006), Zillinsky (1984) y Warham et al. (1999). Con el microscopio estereoscópico y una aguja entomológica se tomaron porciones de micelio crecido en las hojas. Para cada crecimiento se sembraron por duplicado cuatro porciones en forma de cruz en cajas Petri (Ø=10 cm), con medio de cultivo papa-dextrosa-agar (Bioxon®) y ácido láctico (0.25 mL L-1) (PDA+AL) y se mantuvieron a 24 °C. Después de 48 a 72 h, según la tasa de crecimiento de cada aislado, se hicieron transferencias de micelio por cuadruplicado mediante la técnica de punta de hifa a cajas Petri con PDA+AL y se mantuvieron a 24 °C. Después de que el hongo creció, se seleccionó una caja, de ella se extrajo una porción de 5 mm2 que se sembró por duplicado en cajas Petri (Ø=6 cm) con PDA+AL. De estas se obtuvieron los cultivos puros para la identificación molecular.
Identificación molecular de los hongos
La identificación molecular de los cultivos puros se realizó mediante amplificación por PCR de los espaciadores transcritos internos (ITS), secuenciación y comparación con la base de datos del GenBank.
Extracción de ADN
El ADN total de cada cultivo puro seleccionado se extrajo de acuerdo al protocolo descrito por Lievens et al. (2003), con algunas modificaciones, en cultivos de 5 a 10 d de crecimiento. El micelio se obtuvo raspando secciones de 2 cm2 al margen de la colonia y pulverizadas en mortero y nitrógeno líquido. El micelio pulverizado se recolectó en tubos Eppendorff de 1.5 mL, mM Tris, 62.5 mM EDTA y 4.0 % Tritón X-100, pH 8.0) y un volumen igual de mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v). Los tubos se agitaron manualmente por 30 s, se centrifugaron a 9300 g por 10 min (microcentrífuga Sorvall™ Legend™ Micro 21R, Modelo LR58495, Thermo Fisher Scientific, Alemania); 250 µL del sobrenadante se transfirieron a tubos Eppendorff nuevos, de 1.5 mL, se agregaron 15 µL de RNAsa por tubo (RNasa A, Qiagen®, Qiagen, 10 mg mL-1) y se mantuvieron a 37 °C durante 30 min, para eliminar el ARN. A los tubos se agregaron 300 µL de la mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v), se agitaron manualmente por 30 s, se centrifugaron a 9300 g por 10 min, y se transfirieron 200 µL del sobrenadante a tubos Eppendorff nuevos, de 1.5 mL. El ADN total se precipitó adicionando dos volúmenes de etanol absoluto e incubando 15 min a -20 °C. Para compactar el ADN se centrifugaron los tubos a 9300 g por 10 min, se decantó el sobrenadante y se lavó la pastilla de ADN con 200 µL de etanol al 70 %, se centrifugó a 11 200 g por 5 min, se decantó el sobrenadante y se dejó secar la pastilla de DNA al aire libre por 3 h. La pastilla se resuspendió en 30 µL de agua desionizada estéril. El ADN genómico se cuantificó en un espectrofotómetro (Nanodrop 8000, Thermo Scientific®, Modelo ND-8000, Thermo Fisher Scientific, Alemania) a 260 y 280 nm, y su integridad se verificó por electroforesis en geles de agarosa 1 %. Después, todas las muestras de ADN se diluyeron a 10 ng µL-1 para la amplificación por PCR de los ITS.
Amplificación de ITS por PCR
El iniciador directo ITS1-F: 5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’ (Gardes y Bruns, 1993) y el reverso ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (White et al., 1990) se usaron para amplificar los ITS. Los iniciadores delimitan el ITS1, la región 5.8 S y el ITS2 de los hongos. La reacción en cadena de la polimerasa consistió de 25 ng de ADN molde, 1x PCR amortiguador (SENNA®), 0.2 mM de cada dNTP, 0.5 µM del iniciador directo, 1.0 µM del iniciador reverso y 1 U Taq DNA Polimerasa High Fidelity (SENNA®) en 25 µL. Las amplificaciones se realizaron en termociclador (T100™ Thermal Cycler, Bio-Rad®, Modelo T100, EE.UU.) y desnaturalización inicial de 94 °C por 2 min, luego 35 ciclos a 94 °C por 45 s, 59 °C por 45 s y 72 °C por 90 s, y extensión final de 72 °C por 10 min. Los amplicones se analizaron por electroforesis en geles de agarosa 1 % y fotodocumentaron con Gel Logic 212 Pro (Carestream®, Modelo GL 212 Pro, Imaging System, EE.UU.).
Purificación y secuenciación
Los fragmentos amplificados se cortaron del gel de agarosa con un bisturí y se purificaron con el kit Freeze ‘N Squeeze™ DNA Gel Extraction Spin Columns (Bio-Rad®) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los amplicones los secuenciaron en el Departamento de Servicios Genómicos del LANGEBIO, CINVESTAV-Campus Guanajuato. Las secuencias se compararon con la base de datos del GenBank y la herramienta Nucleotide BLAST (NCBI, 2015).
Cálculo de la frecuencia de los hongos
La frecuencia de los hongos por municipio (FM) se calculó agrupando los dos ciclos agrícolas; y la frecuencia general (FG) de cada uno por ciclo agrícola, ajustando las fórmulas propuestas por Iftikhar et al. (2006). Para FM se utilizó la fórmula FM (%) = (Núm. veces que se identificó al hongo en el total de hojas recolectadas por municipio en los dos ciclos/total de crecimientos miceliales examinados en todas las hojas) (100). Para FG se utilizó la fórmula IG (%) = (número de veces que se identificó al hongo en las hojas recolectadas por ciclo agrícola/total de crecimientos miceliales analizados en las hojas) (100).
Resultados y Discusión
Identificación morfológica
Los hongos identificados fueron de los géneros Alternaria, Cladosporium, Chaetomium, Epicoccum, Torula, Curvularia, Nigrospora, Fusarium, Helminthosporium y Septoria. En Alternaria se observaron cadenas cortas de cuatro a siete conidios, con coloración castaño claro, ovoides, de paredes lisas, varias septas transversales (Figura 1A) y de 18 a 36 µm x 10 a 15 µm. Estas características coinciden con las descritas por Zillinsky (1984) y Warham et al. (1999) en las especies de este género. Los conidios de Cladosporium se desarrollaron en grupos arbustiformes (Figura 1B) de coloración gris, con conidióforos ramificados y conidios ovoides, con color castaño claro y en su mayoría con una o dos septas, de 8 a 20 µm x 3 a 11 µm (Figura 1C) (Zillinsky, 1984; Warham et al. 1999). Epicoccum se presentó como masas de conidios con coloración castaño oscuro a negra (Figura 1D), la mayoría esféricos, sin septas visibles, con pared rugosa y con diámetro de 13 a 20 µm; estas características coincidieron con las descritas por Warham et al. (1999). Sobre las lesiones se observaron peritecios esféricos y alargados de Chaetomium (Figura 1E). En los peritecios se observaron ascosporas unicelulares ovaladas (Figura 1F). En Torula se observaron cadenas conidiales con conidios esféricos, unicelulares, con coloración castaño claro, diámetros aproximados de 5.5 a 6 µm (Zillinsky, 1984; Warham et al. 1999). El hongo Nigrospora presentó conidióforos cortos con coloración castaño claro a hialina, en ángulo recto y conidios de color castaño oscuro a negro, la mayoría esféricos (Figura 1G) y con diámetro de 13 a 15 µm (Warham et al. 1999).
Figura 1 Hongos identificados a partir de tizones y manchas foliares en trigo de riego. Conidios de Alternaria spp., (A); conidios en racimo (B) e individuales (C) de Cladosporium spp.; conidios de Epicoccum spp., (D); peritecio (E) y ascosporas (F) de Chaetomium spp.; conidios de Nigrospora spp., (G); conidios de Curvularia spp., (H); micro (I) (Mi) y macroconidios (I) (Ma) de Fusarium spp.; conidios de Helminthosporium spp., (J); síntomas y picnidios (Pi) de Septoria tritici, crecidos en las hojas (K).
El hongo Curvularia presentó conidióforos individuales de coloración castaño claro con varias septas, rectos y sin ramificaciones (Figura 1H); los conidios eran curvos con cuatro septas visibles, coloración castaño claro los más jóvenes y castaño oscuro al envejecer. La célula central del conidio fue más grande y oscura que las demás (Figura 1H) (Zillinsky, 1984; Warham et al., 1999). En Fusarium se observaron microconidios hialinos, la mayoría rectos, con 1 a 2 septas de 9 a 22 µm x 3 a 6 µm (Figura 1I). Los macroconidios fueron ligeramente curvos con 3 a 4 septas y con una célula apical curveada de 25 a 42 µm x 3 a 5 µm (Figura 1I) (Leslie y Summerell (2006). En Helminthosporium se observaron conidióforos individuales con conidios en forma de racimo y coloración castaño oscuro a negra. Los conidios (Figura 1J) fueron de dos tipos, unos rectos, individuales, ligeramente más anchos en el medio, con coloración café olivácea a café clara, 6 a 10 septas con puntas redondeadas y 60 a 78 µm x 15 a 20 µm. Los otros conidios fueron cortos, ovalados, con los extremos más redondeados y más anchos en el medio, con 6 a 8 septas de 55 a 73 µm x 12 a 17 µm (Zillinsky, 1984; Warham et al., 1999). Septoria tritici se identificó con base en los signos y síntomas solo en lesiones de las hojas; estas eran manchas irregulares de coloración castaño oscuro con desarrollo de los picnidios típicos (Figura 1K) (Zillinsky, 1984).
Identificación molecular
La identificación molecular se hizo en Curvularia spp., Fusarium spp., Chaetomium spp., Helminthosporium spp., y Alternaria spp., pues en los cultivos puros presentaron diferencias morfológicas, como en la coloración del micelio, tipo de crecimiento de las hifas, pigmentación del medio de cultivo y morfología de los conidios, y podían deberse a la presencia de más especies. Las seis secuencias obtenidas se depositaron en la base de datos del GenBank (NCBI, 2015) con los números de acceso KR819408, KR819405, KR819409, KR819406, KR819404 y KR819407. La comparación en el BLAST de la secuencia KR819408 (383 pb) tuvo similitud de 97 % con la de F. proliferatum (GenBank No. de acceso KJ439117), KR819405 (763 pb) tuvo similitud de 100 % con la de F. equiseti (GenBank No. de acceso HQ718414), KR819409 (262 pb) fue 100 % similar a la secuencia JF499675 de Gibberella moniliformis (Anamorfo: F. moniliforme, Sin. F. verticillioides), KR819406 (877 pb) fue 97 % similar a Chaetomium globosum (GenBank No. de acceso KP067226), KR819404 (970 pb) fue 99 % similar a la secuencia KP174682 de B. sorokiniana (Sinónimo: H. sativum) y KR819407 (973 pb) mostró 99 % de similitud con Alternaria alternata (GenBank No. de acceso KJ867625). Una secuencia de Curvularia spp., de 148 pb, tuvo 100 % de similitud con las secuencias de Cochliobolus lunatus y C. geniculatus (GenBank No. de acceso KF946043 y JX868663), telemorfos de C. lunata y C. geniculata, respectivamente; pero, no se le asignó un número de acceso ya que su secuencia fue menor a las 200 pb que señala el GenBank. La caracterización molecular confirmó la identificación morfología y permitió identificar la especie de los géneros mediante claves taxonómicas.
Frecuencia de hongos
Chaetomium spp., se aisló con frecuencia mayor en los dos ciclos de cultivo y en la mayoría de los municipios (Cuadro 2) (Figura 2); se considera saprófito (Warham et al., 1999) y causante de decoloración del grano de trigo (APS, 1987). Chaetomim globosum no está reportado como causante de manchas o tizones foliares; pero, ha mostrado actividad antagónica contra B. sorokiniana, S. tritici y A. triticimacularis (Perelló et al., 2002; Aggarwal et al., 2004). Por lo tanto, en nuestro estudio su frecuencia alta en el follaje afectado podría deberse a que actuaba como un microorganismo antagónico.
Cuadro 2 Hongos identificados en variedades de trigo con síntomas de tizones y manchas foliares; y su frecuencia en porcentaje por municipio. Ciclos agrícolas otoño-invierno 2012-2013 y 2013-2014
NHR/NCME: No. De hojas recolectadas/No. Crecimientos miceliales examinados
Figura 2 Frecuencia general de hongos identificados en hojas de trigo con síntomas de tizones y manchas foliares recolectadas en El Bajío, en los ciclos agrícolas otoño-invierno 2012-2013 y 2013-2014.
El género Alternaria fue el segundo más frecuente y se presentó en más de 30 % de los crecimientos miceliales analizados en ambos ciclos agrícolas (Figura 2). La especie A. alternata, identificada en este estudio, ha causado tizones foliares que generan pérdidas altas en trigo y arroz en otras partes del mundo (Iram y Ahmad, 2005; Iftikhar et al., 2006). Este hongo puede ser peligro para avena en la Meseta Central de México (García et al., 2013). Bipolanis sorokiniana (sin. H. sativum) es causante del tizón foliar en trigo y se considera uno de los hongos más destructivos en este cereal en algunas partes del mundo (Acharya et al., 2011), donde se han estimado pérdidas de 20 a 60 % de rendimiento (Duveiller et al., 2007; Rattu et al., 2011). En cinco municipios de Guanajuato (Cuadro 2) se identificó B. sorokiniana (sin. H. sativum), su frecuencia fue baja (Figura 2), probablemente porque las condiciones no eran óptimas y por el efecto antagónico de C. globosum. Septoria spp., se identificó como Septoria tritici porque en las plantas de las que se recolectó se identificaron síntomas solo en las hojas, en contraste con S. nodorum que infecta también las glumas (Eyal et al., 1987). La especie S. tritici es causante de la mancha foliar y causa pérdidas de rendimiento de 44 % en México (Rodríguez et al., 2008) y de 12 % en trigos con riego en otros partes del mundo (Rezgui et al., 2008). Este hongo solo se identificó en los municipios de Michoacán y Jalisco, con una frecuencia baja similar a B. sorokiniana. Este es el primer reporte de estos tres hongos en trigo con riego en El Bajío. Varias especies de Fusarium que causan lesiones en hojas en ambientes húmedos también están documentadas (Zillinsky, 1984); estos no se consideran importantes causantes de tizones. Pero, las tres especies son patogénicas, causan la roña del trigo (Chehri et al., 2011), pueden sintetizar micotoxinas y causar pudriciones de la raíz (Goswami et al., 2008). Por lo tanto, los patógenos en condiciones óptimas podrían ser un peligro para el cultivo.
El hongo Curvularia spp. se identificó en dos municipios (Cuadro 2) con frecuencia baja (Figura 2) y está identificado como causante de manchas foliares en trigo (Warham et al., 1999), sorgo y maíz (C. lunata); y en maíz causó hasta 60 % de pérdidas (Akinbode, 2010). Aunque con Cladosporium spp. se ha observado su asociación más frecuente al moho negro u hollín de la espiga de trigo (Warham et al., 1999; APS, 1987), Smiley et al. (1993) aislaron con mayor frecuencia a tres especies de este género a partir de las lesiones foliares al evaluar la enfermedad llamada “mancha fisiológica de la hoja” en este cereal. La frecuencia de los hongos Torula spp., Epicoccum spp. y Nigrospora spp. que se consideran saprófitos (APS, 1987 Warham et al., 1999), fue baja. Aunque Nigrospora spp. es uno de los hongos causantes del punto negro del grano del trigo (APS, 1987), en arroz se aisló de lesiones foliares (Hajano et al., 2011). Torula spp., y Epicoccum spp., causan también moho negro y manchado en el grano (Warham et al., 1999; APS, 1987) pero, en nuestro estudio parece que estaban como invasores secundarios en las lesiones foliares causadas por los otros hongos (Zillinsky, 1984).
Conclusiones
En el Bajío, México, se identificaron a los hongos B. sorokiniana, A. alternata y Septoria tritici, en manchas y tizones foliares de trigo. También se identificaron F. proliferatum, F. verticillioides, F. equiseti, Curvularia spp., Cladosporium spp., y Nigrospora spp. Aunque la frecuencia de la mayoría de los hongos fitopatógenos fue baja, por su incidencia en todas las variedades sembradas y el movimiento de semilla contaminada, podrían incidir en cualquier zona productora del cereal
