Muestras de forraje

De junio a noviembre de 2013 y enero de 2014 se recolectaron 120 muestras (40 de alfalfa, 40 de sorgo y 40 de zacate) de granjas y comercios locales en el área metropolitana de Monterrey, Nuevo León (25° 40’ 17” N, 100° 18’ 31” O). Las muestras se llevaron al laboratorio y procesaron en una semana.

Extracción de muestras

Las muestras de forraje (1 kg) se molieron con un molinillo mecánico y se homogenizaron antes de la extracción. Para cuantificar la cantidad total de aflatoxina, fumonisina, toxinas T-2/HT2, y zearalenona, se mezclaron 10 g de muestra pulverizada con 50 mL de metanol/agua (7:3 v/v), y la mezcla se agitó 3 min con vigor. Para extraer ocratoxina, la muestra (10 g) se mezcló con 40 mL de metanol/agua (1:1, v/v). Para extraer deoxinivalenol, la muestra (10 g) se mezcló con 100 mL de agua destilada. Las muestras se filtraron con papel Whatman No. 1, y la solución se usó para la resolución de micotoxinas.

Análisis de micotoxinas

La cantidad total de aflatoxinas, deoxinivalenol, fumonisinas, ocratoxinas, toxinas T-2/HT-2 y zearalenona se cuantificaron usando kits de micotoxinas Neogene (Veratox^®). Estos kits se basan en inmunoensayos directos y competitivos asociados a enzimas, y el procedimiento usó las instrucciones del fabricante. En breve, 100 μL de la muestra extraída y 100 μL de solución de peroxidasa de rábano picante (toxina HRP) se colocaron en los pozos de una placa proporcionada en el kit. Las alícuotas (100 μL) se transfirieron a pozos cubiertos con anticuerpos específicos de micotoxinas, y la placa se incubó 3 min a temperatura ambiente para cuantificar aflatoxina, 10 min para ocratoxina, y 5 minutos para otras toxinas. Los pozos se lavaron 5 veces con agua destilada, y se agregaron 100 mL de solución de substrato de K-Blue. Después de incubar de 3 a 5 min a temperatura ambiente, se detuvo la reacción añadiendo 100 μL de solución Red Stop. La absorbancia (650 nm) se midió usando un lector de tiras NEOGEN^®Stat Fax^® 4700. La concentración de micotoxinas se calculó usando parámetros externos para cada micotoxina proporcionada por el kit (^{Roze et al., 2013}). El límite de detección del kit es 1.4 ppb, 0.1 ppm, 0.2 ppm, 1ppb, 10 ppb para el total de aflatoxinas, deoxinivalenol, fumonisinas, ocratoxinas, y zearalenona, respectivamente (determinado por el promedio de 10 muestras libres de micotoxinas más dos desviaciones estándar; http://foodsafety.neogen.com/en/veratox#mycotoxins).

Análisis estadístico

El muestreo fue aleatorio simple y cada muestra se analizó dos veces. Para determinar si todas las medias eran iguales (H0) o si por lo menos dos medianas eran diferentes (p≤0.05) se usó la prueba Kruskal-Wallis. Para saber si las medianas eran significativamente diferentes se usó la prueba de comparación múltiple Kruskal-Wallis (Prueba de Dunn). El software usado fue The Number Cruncher Statistical System version 6.0 (NCSS, LLC).

Aflatoxinas

Estas toxinas se detectaron en el 62 % de las muestras de alfalfa con un nivel promedio de 2.77 μg kg^-1. En el zacate (45 %, 0.5 μg kg^-1) y en el sorgo (40 %, 0.36 μg kg^-1) se encontró un número menor de muestras positivas (Tabla 1).

Fumonisinas

Fumonisinas se encontraron en 54 % de las muestras de forraje, con un rango de 0.09 a 0.29 mg kg^-1 (Tabla 1). El zacate mostró el mayor nivel promedio (0.29 mg kg^-1), seguido por el sorgo (0.16 mg kg^-1) y alfalfa (0.09 mg kg^-1). La prueba Krustal-Wallis no mostró diferencias significativas (p>0.05).

Ocratoxina

Esta toxina se encontró en 97 de las 120 muestras de forraje, con un rango de 0.92 a 32.74 μg kg^-1. De manera similar a las aflatoxinas, la ocratoxina se encontró principalmente en las muestras de alfalfa (39/40), también en el sorgo (37/40) y zacate (21/40) (Cuadro 1). Además, la alfalfa mostró el promedio de concentración más alto (32.74 μg kg^-1), luego el sorgo (5.09 μg kg^-1) y zacate (0.92 μg kg^-1).

Toxinas T-2/HT-2

Todas las muestras tuvieron toxinas T-2/HT-2, pero hubo diferencias significativas (p≤0.05) entre forrajes (Cuadro 1). La concentración media más alta se detectó en la alfalfa (93.7 μg kg^-1) en comparación con el sorgo (30.2 μg kg^-1) y zacate (17.6 μg kg^-1).

Zearalenona

Las 120 muestras tenían zearalenona. Los niveles promedio más altos se encontraron en la alfalfa y el sorgo (199 μg kg^-1 y 171 μg kg^-1, respectivamente), comparados con el zacate (41 μg kg^-1) (Cuadro 1).

Deoxinivalenol

La alfalfa tuvo el nivel promedio más alto de deoxinivalenol (0.47 mg kg^-1), seguida por el zacate y el sorgo (0.11 mg kg^-1 y 0.03 mg kg^-1, respectivamente) (Cuadro 1).

Las aflatoxinas están entre las micotoxinas con un gran impacto en un rango amplio de productos agrícolas (^{Robledo et al., 2001}). Dado que la contaminación por aflatoxina es difícil de evitar, se establecieron límites en su contenido en alimentos y pienso en muchos países para proteger la salud de animales y humanos (^{Torres et al., 2010}), pero los límites máximos varían en cada país (^{Afsah‐Hejri et al., 2013}). Por ejemplo, el límite máximo de aflatoxinas en cereales para consumo humano establecido por la Secretaría de Salud de México (NOM-188-SSA1-2002; ^{García y Heredia, 2013}) y por la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos es 20 μg kg^-1, mientras que la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria estableció un límite de 10 μg kg^-1 (^{Afsah‐Hejri et al., 2013}). Si se excede esta concentración, el cereal contaminado sólo se puede usar para alimentar animales, aunque también hay límites máximos (μg kg^-1): aves de corral 100, puercos 100-200, ganado 100-300 (^{García y Heredia, 2013}).

Entre 2004 y 2011 se realizó una investigación sobre el maíz en Vietnam y 27 % de 10 172 muestras estaban contaminadas con aflatoxinas (58 μg kg^-1, ^{Skrinjar et al., 1992}). Un estudio similar sobre el sorgo en Brasil mostró aflatoxina B1 (7-33 μg kg^-1) en 12.8 % de 104 muestras (^{Charoenpornsook and Kavisarasai, 2006}). En Tailandia se detectó aflatoxina B₁ (7.5 μg kg^-1) en 23 de 25 (92 %) muestras de alimento (^{Buckle, 1983}); mientras que ^{Amigot et al. (2006)} detectaron aflatoxina en alfalfa, maíz, y sorgo: 3.75±0.5 μg kg^-1, 2.56±0.51 μg kg^-1, y 2.82±1.51 μg kg^-1, respectivamente. Estos resultados son similares a la concentración de aflatoxinas (1.21 μg kg^-1) en el 49 % de las muestras de nuestro estudio, y esos niveles fueron más altos en la alfalfa, seguida del sorgo y el zacate. Aflatoxina se encontró en muchas muestras, pero los niveles estaban dentro de los parámetros permitidos por las regulaciones mexicanas e internacionales para la alimentación de animales.

En EE.UU., el límite máximo total para fumonisinas (FB₁+FB₂+FB₃) en productos de consumo humano es 2-4 mg kg^-1 (^{Streit et al., 2012}), para el consumo de ganado es 60 mg kg^-1, para aves de corral es 100 mg kg^-1 (^{Driehuis et al., 2008a Bhat et al., 2010}; ^{Afsah‐Hejri et al., 2013}). Estudios realizados en pienso en Malasia (^{Petzinger and Weidenbach, 2002}), en cereales y pienso en Croacia (^{Hussein and Brasel, 2001}), y en pienso y sus ingredientes en Asia (^{Bhatnagar and García, 2013}) detectaron niveles bajos (0.261-2.4 mg kg^-1, 2.3 mg kg^-1, and 0.39-1.01 mg kg^-1, respectivamente) de estas toxinas. De manera similar, en nuestro estudio se detectaron niveles bajos (0.09-0.290 mg kg^-1) de fumonisinas en las muestras de forraje analizadas.

Los cereales y otros productos agrícolas son la fuente más prominente de ocratoxina en la dieta humana, y esta toxina puede pasar del pienso a los productos alimenticios de origen animal. Así, las aflatoxinas en las aves de corral pueden tener un índice de traspaso del 0.02 % hacia los huevos, y en rumiantes del 1 % al 3 % hacia la leche (^{Driehuis et al., 2008a}; ^{Peel et al., 2011}, ^{Volkel et al., 2011}). Las regulaciones en varios países muestran que los niveles máximos permitidos de ocratoxinas en cereales y en productos de cereal para consumo humano son de 5 μg kg^-1 y 3 μg kg^-1, respectivamente (^{Naicker et al., 2007}). En algunos países se reportan variaciones en la frecuencia y concentración de esta toxina. Un estudio en Sudáfrica mostró un promedio de 5.2 μg kg^-1 de ocratoxina A en 3 de 7 muestras (^{Lincy et al., 2008}). En Tailandia se encontró una mayor incidencia (30 % de las muestras) y niveles mayores (10.4812.35 μg kg^-1) de esta toxina en el pienso (^{Charoenpornsook and Kavisarasai, 2006}). En Yugoslavia, las concentraciones variaron hasta en 400 μg kg^-1 en muestras de heno, alfalfa seca y fresca, pulpa de remolacha granulada y en ensilaje (^{Skládanka et al., 2010}). En nuestro estudio, los niveles de ocratoxina A oscilaron de 0.9 a 32.7 μg kg^-1, y el promedio fue 12.9 μg kg^-1, que excede el límite máximo (5 μg kg^-1) establecido para ocratoxina en productos de cereal de acuerdo con la legislación en EE.UU.

Maíz, trigo, cebada, arroz, avena, mijo y sorgo se pueden contaminar con zearalenona (^{Zain, 2011}), mientras que la contaminación por toxinas T-2/ HT-2 es rara en trigo y maíz. Pero en nuestro estudio se detectaron toxinas T-2/HT-2 y zearalenona en todas las muestras analizadas de alfalfa, sorgo y zacate (Tabla 1).

Las regulaciones actuales sobre los límites máximos de zearalenona en alimentos y pienso varían en cada país, desde no regulaciones hasta más de 1000 μg kg^-1 (^{Afsah‐Hejri et al., 2013}; ^{Bhatnagar and García, 2013}). Valores menores a 300 μg kg^-1 se recomiendan en el alimento para vacas lecheras (^{Reyes-Velázquez et al., 2008}), a pesar de que los rumiantes son más resistentes a los efectos negativos de micotoxinas (^{Wu et al., 2014}). Estudios in vivo mostraron que la zearalenona se metaboliza con rapidez en humanos y animales y se elimina principalmente como glucurónidos solubles en agua (^{García and Heredia, 2006}). Por lo tanto, el consumo de dosis bajas de alimento contaminado con zearalenona en vacas lecheras no es un riesgo de salud para el humano. Pero la salud de los animales y sus productos alimenticios se pueden alterar cuando los rumiantes consumen alimentos contaminados con micotoxinas por largos periodos (^{García and Heredia, 2006}; ^{Afsah‐Hejri et al., 2013}). El pienso contaminado por estas toxinas se reporta en varios países. Muestras de sorgo importado de Japón de 2001 a 2006 tuvieron un índice de contaminación por zearalenona de 52.5 % (84/160), con valores de 60-7260 μg kg^-1 (^{Aoyama et al., 2009}). De acuerdo con ^{Zain (2011)}, piensos para vaca en Argentina estaban contaminados con esta toxina (1200-3006 μg kg^-1), y en Sudáfrica todas las muestras de pastura tenían micotoxinas (un promedio de 2,500 μg kg^-1), que es una concentración más alta a la permitida para vacas y reses (^{Lincy et al., 2008}). En nuestro estudio, esta toxina se encontró en todas las muestras, pero la concentración fue más baja (49.1-199.5 μg kg^-1).

En México, la información de la prevalencia de toxinas T-2/HT-2 en productos y en pienso es limitada (^{García y Heredia, 2013}). En un estudio realizado en Nayarit, sólo una muestra (5 %) de forraje de maíz estaba contaminada (7 μg kg^-1) según ^{Reyes-Velázquez et al. (2008)}. Sin embargo, en nuestro estudio hubo una incidencia del 100 % en toxinas T-2 / HT-2 en las muestras y una concentración más alta (17.6-93.7 μg kg^-1). Nuestros resultados son similares a los reportados en Croacia, con 6.09-67.68 μg kg^-1 en el 76 % de las muestras de pienso; Tailandia, con 6.91 μg kg^-1 en el 100 % de las muestras de pienso (^{Buckle, 1983}); e India, con 12-130 μg kg^-1 en el 100% de las muestras de sorgo (^{Klarić et al., 2009}).

El deoxinivalenol es la micotoxina más común (20-100 %) en forrajes (en particular en el maíz) y en ingredientes de pienso concentrado (^{Driehuis et al., 2008b}; ^{Skrinjar et al., 1992}). En nuestro estudio, el deoxinivalenol se encontró en la alfalfa (92.5 %), sorgo (25 %) y zacate (67.5 %). A pesar de una incidencia alta de deoxinivalenol, los niveles fueron relativamente bajos (0.035-0.47 mg kg^-1) y dentro de parámetros aceptables (0.5-1.0 mg kg^-1), de acuerdo con ^{Aoyama et al. (2009)}. Nuestros resultados son similares a los reportados en Europa en muestras de alfalfa (0.187±0.059 mg kg^-1), maíz (0.167±0.051 mg kg^-1), y sorgo (0.029±0.015 mg kg^-1) (^{Amigot et al., 2006}), así como en piensos compuestos (0.348-2.40 mg kg^-1) (^{da Silva et al., 2000}).

En nuestro estudio se encontraron dos o más micotoxinas en todas las muestras, que es similar a los resultados de otros países, donde hubo dos o más micotoxinas en 75-100 % de las muestras (^{Streit et al., 2012}). La ocurrencia de múltiples micotoxinas en nuestro estudio se puede deber a: 1) la mayoría de hongos pueden producir de manera simultánea varias micotoxinas, 2) los productos pueden estar contaminados por varios hongos y 3) el pienso puede estar compuesto por varios productos contaminados (^{Streit et al., 2012}). El hecho de que un pienso específico contenga más de una micotoxina puede afectar la salud de los animales, incluso en dosis pequeñas, y se debe realizar un análisis del riesgo para reducir o eliminar el daño al humano por su exposición.