Ciencia de los alimentos

 

Aislamiento, selección e identificación de levaduras Saccharomyces spp. nativas de viñedos en Querétaro, México

 

Isolation, selection and identification of native Saccharomyces spp. yeasts from vineyards in Querétaro, México

 

Dalia E. Miranda-Castilleja¹, Eunice Ortiz-Barrera¹, Sofía M. Arvizu-Medrano¹, Juan Ramiro-Pacheco¹, Jesús A. Aldrete-Tápia¹, Ramón Á. Martínez-Peniche^1*

 

¹ Cuerpo Académico de Inocuidad Microbiana de los Alimentos. División de Estudios de Posgrado, Facultad de Química, Universidad Autónoma de Querétaro. Centro Universitario s/n, Colonia las Campanas. 76010. Querétaro, México. *Autor responsable. (alvar@uaq.mx).

 

Recibido: julio, 2014.
Aprobado: julio, 2015.

 

Resumen

Querétaro es el segundo estado productor de vinos en México, pero la comercialización es difícil por la falta de calidad y tipicidad. Una alternativa es tener levaduras nativas seleccionadas para aumentar el potencial de los mostos y dar originalidad a los vinos. El objetivo del presente estudio fue el aislamiento, selección con base en su potencial enológico e identificación de levaduras Saccharomyes nativas de viñedos queretanos. Las cepas fueron aisladas en 2012 en el laboratorio de fermentaciones y fisiología de frutos de la Universidad Autónoma de Querétaro, México, durante la fermentación espontánea de mostos de uvas maduras recolectadas aleatoriamente dentro de tres viñedos queretanos, diferenciando las Saccharomyces en medio lisina. Su tolerancia al etanol (12 %), sulfitado (200 mg L^-1) y fenotipo killer fue evaluada usando Bioscreen^©; su potencial enológico se determinó en pruebas de microvinificación con las variedades Cabernet Sauvignon y Merlot, y se identificaron amplificando el dominio D1/D2. Ocho cepas destacaron en su tolerancia a SO₂, etanol y fenotipo killer: S. cereviasiae (SR19, SR26, SR27, N05) y S. paradoxus (N42, SR25, OB10, OB11). Los vinos producidos con estas levaduras fueron secos (<3.8 g glucosa L^-1), con acidez total de 6.5 a 8.4 g L^-1 ácido tartárico, acidez volátil de 0.13 a 0.26 g L^-1 ácido acético, y pH de 3.56 a 3.74, sin diferencias entre levaduras (Tukey, p >0.05). La nativa N05 y K1 (testigo) obtuvieron los mayores grados alcohólicos (15.2 y 14.9 %), eficiencia de conversión (16.31 y 16.67 g glucosa °alcohólico^-1), y eficiencia fermentativa (90.8 y 89.1 %). La cepa SR26 contrastó con OB10 en la velocidad de fermentación (19.2 vs. 18.6 g CO₂ 48 h^-1) y SR19 y SR26 obtuvieron las menores producciones de SO₂ (25.6 y 36.8 mg L^-1). El presente estudio reveló el potencial de levaduras nativas del estado de Querétaro para utilizar en la producción de vinos regionales.

Palabras clave: Selección de levaduras, vinificación, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces paradoxus.

 

Abstract

Querétaro is the second state in wine production in México, but the commercialization is difficult because of the lack of quality and tipicity. An alternative is to have native yeasts selected to increase the potential of grape juices and provide originality to the wines. The objective of this study was the isolation, selection based on their wine potential, and identification of native Saccharomyces yeasts in Querétaro vineyards. The strains were isolated in 2012 at the physiology and fermentations laboratory, Universidad Autónoma de Querétaro, México, during the spontaneous fermentation of juices from mature grapes collected randomly inside three Querétaro vineyards, differentiating the Saccharomyces in a lysine medium. Their tolerance to ethanol (12 %), sulfite addition (200 mg L^-1) and the killer phenotype was evaluated using Bioscreen^©; their enological potential was determined in microvinification tests with Cabernet Sauvignon and Merlot varieties, and they were identified by amplifying the D1/D2 domain. Eight strains stood out because of their tolerance to SO₂, ethanol and the killer phenotype: S. cereviasiae (SR19, SR26, SR27, N05) and S. paradoxus (N42, SR25, OB10, OB11). The wines produced with these yeasts were dry (< 3.8 g glucose L^-1), with total acidity of 6.5 to 8.4 g L^-1 tartaric acid, volatile acidity of 0.13 to 0.26 g L^-1 acetic acid, and pH of 3.56 to 3.74, without differences between yeasts (Tukey, p> 0.05). The native N05 and K1 (control) strains obtained the highest alcohol degrees (15.2 and 14.9 %), conversion efficiency (16.31 and 16.67 g glucose °alcohol^-1) and fermentative efficiency (90.8 and 89.1 %). The SR26 strain contrasted with OB10 in the fermentation speed (19.2 vs. 18.6 g CO₂ 48 h1), and SR19 and SR26 obtained the lowest SO₂ production (25.6 and 36.8 mg L1). This study revealed the potential of native yeasts from the state of Querétaro to be used in the production of regional wines.

Key words: yeast selection, vinification, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces paradoxus.

 

INTRODUCCIÓN

Querétaro es el segundo productor de vinos en México (Estevan, 2013) y existe un creciente interés de los productores por extender la superficie establecida con viñedos y mejorar la calidad de los vinos producidos (AVQ, 2011). La falta de mercados es uno de los factores principales que limita el desarrollo de esta agroindustria, porque los vinos carecen de calidad y tipicidad. Ello se debe, en parte, a una acidez alta e insuficiente graduación alcohólica potencial en los mostos, en particular de uvas tintas, lo cual obliga a retrasar la vendimia para aumentar la concentración de los azúcares, causando la pérdida de compuestos aromáticos y la formación de sabores indeseables (Ribereau-Gayon et al., 2006).

La calidad del vino está fundamentada en el aspecto sensorial, relacionado con los compuestos químicos presentes y su equilibrio, para derivar en una experiencia organoléptica agradable al consumidor (Charters y Pettingrew, 2007). Este concepto está sujeto al criterio personal de los consumidores y es difícil enfocarlo objetivamente, pero se reconocen y se han establecido rangos aceptables de concentración de ciertos compuestos que inciden directamente en la calidad, tales como etanol, acidez volátil, SO₂, así como clasificaciones y recomendaciones para el contenido de azúcares residuales y acidez total (OIV, 2009).

En la elaboración de los vinos, una etapa fundamental es la fermentación alcohólica (FA) la cual es una conversión bioquímica de los azúcares en etanol por acción de las levaduras (Pasteur, 1857). Durante este proceso intervienen géneros de levaduras, como Hanseniaspora, Brettanomyces y Candida, aportando distintas características sensoriales al vino. El género Saccharomyces destaca por su mayor eficiencia en la conversión de azúcares y su tolerancia a concentraciones elevadas de etanol y SO₂, y es el género fermentativo por excelencia (Rainieri y Pretorius, 2000).

La FA puede ocurrir de tres formas: 1) Espontánea, desde la microbiota presente de manera natural en el epicarpio de la uva o en equipos y superficies de la bodega; ésta realza la tipicidad del vino debido a las características únicas aportadas por los microorganismos nativos; 2) adicionando levadura seca activa (LSA), lo cual brinda un proceso reproducible y controlable, pero le resta tipicidad al producto; 3) inoculación con levaduras nativas seleccionadas, las cuales permitirán procesos controlables y reproducibles, sin que los vinos pierdan el carácter único y típico que los microorganismos nativos proporcionan (Fleet, 2003; Santamaría et al., 2008).

Los criterios de interés general para seleccionar cepas de levaduras enológicas incluyen buena eficiencia fermentativa, baja producción de SO₂ y H₂S, resistencia al factor killer o bien presencia de éste y tolerancia a niveles altos de etanol y SO₂ (Pretorius, 2000). Durante el proceso de selección deben considerarse las necesidades particulares de la región y, una vez evaluadas las bondades tecnológicas generales, considerar criterios particulares como la adaptación a bajas temperaturas y producción de aromas (Torija et al., 2003), mostos con concentraciones altas de azúcares (Mercado et al., 2007) o requerimientos bajos de nitrógeno asimilable (Manginot et al., 1998).

Hay interés creciente en el uso de cepas nativas seleccionadas en La Patagonia, Argentina (Lopes et al., 2007), Valencia, España (Viana et al., 2008), y en países con reciente actividad vitivinícola como Sudáfrica (Jolly et al., 2003), Nueva Zelanda y Australia (Swiegers et al., 2006; Serjeant et al., 2008), donde se han seleccionado levaduras nativas y tienen rápida aceptación de sus productos, los cuales se caracterizan por elevada tipicidad y prácticas de última generación.

En contraste con la situación mundial, en México no hay estudios acerca de la selección de levaduras enológicas, por lo cual los productores locales inducen la fermentación con cepas comerciales importadas. Esto implica costos adicionales, fuga de divisas y usar microorganismos que no necesariamente responden a las necesidades de los vitivinicultores locales.

La hipótesis de este estudio fue que es posible obtener levaduras provenientes de viñedos de la región vitivinícola de Querétaro con potencial enológico, para mejorar los rendimientos alcanzados por cepas comerciales. El objetivo del estudio fue aislar, determinar el potencial enológico y fermentativo, e identificar cepas de levaduras Saccharomyces nativas de viñedos de Querétaro.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico y sitio experimental

En el estudio se usaron frutos de vid (Vitis vinifera) de los cultivares Merlot y Cabernet Sauvignon cosechados en madurez fisiológica aparente durante 2012 en tres viñedos comerciales en el estado de Querétaro con la siguiente ubicación geográfica (De la Cruz et al., 2012) (Figura 1): El Rosario, ubicado en la carretera La Griega-El Lobo Km 6, El Marqués (20° 58' N, 100° 09' O, 1850 msnm); El Barreno, ubicado en el centro de San Juan del Rio (20° 23' N, 99° 59' O, 1920 msnm); Viñedos Azteca, carretera San Juan del Río-Cadereyta Km 40.4. Ezequiel Montes (20° 43' N, 99° 44' O, 1950 msnm).

La cepa de referencia fue S. cerevisiae K1 (ICV K1V-1116) (Lallemand Inc., Ontario, Canadá), caracterizada por poseer el fenotipo killer (K2), tolerancia alta al etanol (18 %), eficiencia fermentativa de 16.7 g de azúcar por grado alcohólico producido, una fase lag corta, baja producción de SO₂ y acidez volátil, y una velocidad de fermentación moderada.

Aislamiento y diferenciación de cepas Saccharomyces

Los frutos se recolectaron en hileras y plantas tomadas al azar, se llevaron al laboratorio de fermentaciones y fisiología de frutos de la Universidad Autónoma de Querétaro, donde se estrujaron e hicieron fermentar de manera espontánea dentro de bolsas plásticas estériles (300 mL de mosto) a 25 °C por 8 d. Cada 2 d se tomaron alícuotas de 1 mL, con las cuales se realizaron tres diluciones decimales consecutivas que se sembraron mediante extensión en superficie sobre agar papa dextrosa (APD) adicionado de rosa de Bengala (60 mg L^-1) y ampicilina (100 mg L^-1), incubándose 5 d a 25 °C. Las colonias que desarrollaron y presentaron la morfología típica de levaduras se sembraron mediante un asa estéril en medio Agar Nutritivo-Dextrosa para levaduras (NYDA), donde se incubaron 3 d a 25 °C.

Para diferenciar las cepas del género Saccharomyices, las levaduras aisladas se sembraron en dos pases consecutivos en medio agar Lisina (Oxoid, Hampshire, UK), selectivo para no-Saccharomyces (Medina et al., 2007), incubándose 4 d a 25 °C.

Tolerancia a anhídrido sulfuroso y etanol

Un analizador turbidimétrico Bioscreen^© fue utilizado y mediante lecturas automatizadas de densidad óptica (DO) (cada 20 min, por 40 h, a 25 °C) se observó la cinética de crecimiento de las cepas evaluadas. Una concentración de 6Log de UFC de cada levadura se colocó en un total de 200 μL en pozos individuales, conteniendo caldo nutritivo-dextrosa para levaduras (NYDB) ajustado a pH 3.5 y 25 °Brix, en presencia de: 1) Etanol (12 %) o, 2) SO₂ (200 mg L^-1). La viabilidad de las cepas se verificó inoculándolas en el mismo medio NYDB en ausencia de los productos a evaluar.

Además de observar la presencia de crecimiento en el medio correspondiente, las variables cinéticas evaluadas fueron (Métris et al., 2006): 1) Tiempo de detección (h), indica la duración de la fase de adaptación, tiempos más cortos suponen mayor tolerancia al compuesto; 2) velocidad de desarrollo, representa el incremento de DO por unidad de tiempo (DO min^-1), calculada de la pendiente de la línea recta durante la fase de crecimiento exponencial y mayores velocidades suponen mayor tolerancia.

Tolerancia al fenotipo killer

Obtención del caldo-toxina

La cepa de referencia K1 (killer) se incubó 72 h a 25 °C en medio NYDB (pH 3.5). Después el caldo de cultivo se filtró a través de una membrana con tamaño de poro de 0.45 μm (Millipore) para separar las células de la cepa del caldo-toxina, el cual fue recuperado para ser probado en las cepas aisladas (Izgü et al., 2006).

Prueba de tolerancia

En esta prueba también se usó el analizador Bioscreen^© inoculando 6Log de UFC de cada cepa en cada fosa conteniendo: 1) 100 % de caldo-toxina o, 2) 50 % de caldo-toxina y 50 % de medio NYDB (50:50). El equipo se programó para realizar lecturas cada 20 min durante 72 h a 25 °C y evaluar el máximo crecimiento de la levadura, determinado por la máxima DO alcanzada en el tiempo de incubación, el cual se comparó con el obtenido en las pruebas testigo para determinar el porcentaje de inhibición como variable de estudio. Los testigos fueron dos medios diluidos en las proporciones (NYDB:Agua): 1) 1:4 como testigo del caldo-toxina al 100 % y, 2) 1:2 para el caldo 50:50.

Pruebas de microvinificación

Estas pruebas se realizaron con las levaduras seleccionadas en las pruebas de tolerancia ya descritas. Para eliminar las poblaciones de microorganismos naturalmente presentes, uvas despalilladas de las dos variedades fueron sometidas a un proceso de termovinificación (60 °C, 20 min; Ribereau-Gayon et al., 2006). La eficiencia de este método fue comprobada sembrando alícuotas de 100 μL del mosto mediante extensión en superficie sobre medio APD, en 12 ocasiones y se observó nulo crecimiento de microorganismos. Después las uvas fueron prensadas manual y asépticamente para obtener los mostos, los cuales fueron ajustados a pH 3.5 y a 25 °Brix, mediante adición de ácido tartárico y sacarosa estériles, respectivamente.

Las cepas de levaduras seleccionadas fueron incubadas 48 h a 25 °C en medio NYDB, después se realizaron recuentos y se ajustaron para obtener una concentración final en el mosto de 5Log de UFC mL^-1 (OIV, 2012a). La fermentación se realizó en matraces de 1 L con 700 mL de mosto, a 25 °C, en condiciones estériles y de semianaerobiosis, y se determinó el peso de los matraces cada 24 h, hasta que fuera constante.

El comportamiento fermentativo se determinó con las variables: 1) Grado alcohólico, por destilación directa y picnometría (CEE, 1990); 2) eficiencia fermentativa, porcentaje de alcohol producido con relación al grado alcohólico potencial; 3) conversión azúcar/etanol, gramos de azúcar usados para producir un grado alcohólico; 4) velocidad de fermentación expresada en g de CO₂ desprendido cada 48 h (Hidalgo y Fernández, 2005).

También se determinaron las siguientes variables físicas y químicas de los vinos (OIV, 2009): 1) Azúcares reductores, por el método de Fehling Causse Bonnans; 2) pH, usando un potenciómetro Conductronic calibrado a dos puntos; 3) acidez total titulable (ATT) mediante titulación; 4) acidez volátil (AV) por el método de García-Tena (García, 1976); 5) SO₂ total, por el método de Rippert (CEE, 1990).

Identificación de las levaduras seleccionadas

Para la identificar las levaduras se usó PCR amplificando el dominio D1/D2 del gen que codifica para la subunidad 26S del ARNr en las levaduras. Para la extracción de ADN se usó la técnica con calor y purificación con fenol-cloroformo (Silva et al., 2012). Para la reacción de PCR se usaron los oligonucleótidos universales NL1 (GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG) y NL4 (GGTCCGTGTTTCAAGACGG) con las condiciones: 2 min a 95 °C, 35 ciclos (30 s a 95 °C, 1 min a 56.75° y 1 min a 72 °C) y 10 min a 72 °C (Cano et al., en 2004). Los productos obtenidos fueron enviados a la Unidad Universitaria de Secuenciación Masiva de ADN de la Universidad Nacional Autónoma de México. Los resultados se introdujeron en el banco de datos mediante el programa Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), para buscar homología con secuencias de levaduras reportadas (Guamán y Carbajal, 2009).

Análisis estadísticos

Para las pruebas de microvinificación se usó un diseño unifactorial (el factor de estudio fue cepas de levadura) con ocho tratamientos (ocho cepas) más el tratamiento testigo (cepa K1); con dos repeticiones, y la unidad experimental fue un matraz de 1 L con 700 mL de mosto. Con los datos se realizó un ANDEVA y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05) usando el programa JMP^® 9.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento de levaduras

De las fermentaciones espontáneas producidas en laboratorio con la uva cosechada, de los tres viñedos se aislaron 198 cepas de levaduras. Las correspondientes al género Saccharomyces, de acuerdo con la prueba efectuada en medio lisina (52 equivalente a 26 %), se muestran en el Cuadro 1 de acuerdo con el viñedo de origen. Los porcentajes encontrados en este estudio concuerdan con lo reportado por Jolly et al. (2003) quienes observaron un mayor porcentaje de cepas no Saccharomyces en aislamientos realizados en frutos. Además, Saccharomyces predomina principalmente en ambientes de bodega (Mercado et al., 2007).

Tolerancia a SO₂ y etanol

Todas las levaduras probadas (52) se desarrollaron en el medio testigo, lo cual muestra su viabilidad al momento de la evaluación, mientras que sólo 56 % (29) crecieron en el medio en presencia de 200 mg L^-1 de SO₂. En la Figura 2 se muestra que 23 de éstas mostraron comportamientos similares, con tiempos de detección menores a 12 h y velocidades superiores a 0.045 DO min^-1 (dentro del recuadro) correspondientes a una elevada tolerancia al compuesto. En contraste, las levaduras SR19, SR26, SR14, SR16 y SB2 tuvieron tiempos mayores a 19 h y velocidades menores a 0.03 DO min^-1, mientras que la cepa K1 tuvo un valor intermedio en tiempo de detección (15.5 h) y una velocidad de desarrollo muy baja (0.0073 DO) min^-1.

Durante el proceso de vinificación, el SO₂ se adiciona como antioxidante y antiséptico en una operación llamada sulfitado, por lo cual las levaduras seleccionadas para realizar la FA deben tolerar una concentración de SO₂ total superior a 50 mgL^-1, usada con frecuencia en vinificación en tinto (Riberau-Gayon et al., 2006; OIV, 2012a). En este caso se probó una concentración mayor (200 mgL^-1), por lo cual el desarrollo (en mayor o menor proporción) en este medio las hace aptas para ser seleccionadas.

De las 29 levaduras desarrolladas en presencia de SO₂, tres (SR14, SR16 y SB2) fueron incapaces de desarrollarse en etanol 12 %. A diferencia de la prueba de tolerancia a SO₂, aquí se observaron comportamientos más contrastantes entre las levaduras (Figura 3). Nueve cepas (contenidas en el recuadro) se detectaron con tiempos de detección menores a 30 h y velocidades de desarrollo superiores a 0.006

DO min^-1: K1 (cepa de referencia) y la nativa N42, con valores similares entre ellas, seguidas de las cepas SR19, SR22, SR25, SR26, SR27, N05 y OB08.

Ramos et al. (2013) evaluaron la tolerancia a estos dos compuestos de 66 cepas de levaduras tendientes a la producción de etanol como biocombustible, y encontraron que 30 % crecieron en medios con 400 mg L^-1 de SO₂ y 12 % de etanol. En la ficha descriptiva de la patente de dos cepas de Saccharomyces para fermentaciones alcohólicas (IMIA 103 e IMIA 277), Hidalgo y Fernández (2005) indican que éstas se pueden desarrollar (resistentes) a 200 mg L^-1 de SO₂ total y hasta 14 % de etanol.

Tolerancia al fenotipo killer

Con caldo-toxina a 100 % se observó inhibición mayor (superior a 50 %) que con el caldo 50:50 (en torno a 20 %) (Figura 4), un resultado esperado porque en el primer caso la toxina está en mayor concentración y, además, los nutrientes del medio fueron prácticamente consumidos por la levadura K1 durante la preparación del extracto, mientras que el segundo medio cuenta con los nutrientes del medio NYDB y la toxina está diluida.

Asimismo, el fenotipo killer es ocasionado por la secreción extracelular de toxinas por las levaduras caracterizadas con este fenotipo (principalmente K1, K2 y K8 para S. cerevisiae) (Marquina et al., 2002). Esta secreción implica que la o las toxinas estarán presentes en el caldo de cultivo de una cepa killer y ésta se puede extraer para probar su efecto tóxico en otras células. La metodología usada en otros estudios es cualitativa, y consiste en el uso de pruebas en placa donde se determina la sensibilidad (S), neutralidad (N) o resistencia (K) a la toxina killer usando cepas de referencia de tipos K y S (Bevan y Makower, 1963). Así, Jacobs et al. (1991) observaron, de manera semi-cuantitativa midiendo el tamaño del halo de inhibición formado, diferentes grados de sensibilidad en placa en función de la cepa. En estudios cuya finalidad fue determinar las proporciones de cada fenotipo dentro de cepas aisladas, se observan proporciones superiores a 80 % de cepas N o S (Gutiérrez et al., 1995; Rodríguez et al, 1998).

En el medio caldo-toxina 100 % siete cepas destacaron con menos de 51 % de inhibición, mientras que en el medio caldo-toxina 50:50 doce levaduras presentaron menos de 20 % de inhibición. No se obtuvo una correlación del comportamiento de las levaduras en los dos medios (R=0.25), las cepas OB10, OB11, OR08 y SR26 sobresalieron en ambos medios con menor inhibición. En síntesis, de las 52 cepas Saccharomyces analizadas, se seleccionaron ocho que desarrollaron en presencia de SO₂, destacaron en etanol y fueron tolerantes a la toxina killer (Cuadro 2).

Pruebas de microvinificación

Comportamiento fermentativo

La cepa N05 obtuvo los mayores valores de grado alcohólico (15.2 %), eficiencia fermentativa (90.8 %) y conversión azúcar/etanol (16.3 g azúcar/grado alcohólico), valores muy similares a los logrados por K1, y superior a SR25 (Cuadro 3). La eficiencia alta de conversión obtenida por estas cepas es de interés para los vinos tintos producidos localmente, debido a la dificultad para alcanzar, con los azúcares acumulados naturalmente en la región, la graduación alcohólica deseada para vinos tintos de calidad. Los resultados con la cepa de referencia (K1) concuerdan con lo reportado en su ficha técnica (ICV K1V-1116), con una conversión de 16.7 g de azúcar por grado alcohólico y una eficiencia aproximada de 90 %.

Con respecto a la velocidad de fermentación, destaca SR26, contrastando con OB10 (p≤0.05). Lo deseable en la práctica industrial es una velocidad de fermentación alta, pero se debe tener en cuenta que la producción de compuestos aromáticos es favorecida por fermentaciones lentas (Fleet, 2003), y una fermentación rápida podría ocasionar un aumento excesivo en la temperatura de los tanques fermentadores, una vez que se haya usado volúmenes mayores, lo cual puede producir paros en la fermentación y otras consecuencias indeseables en la producción (Ribereau-Gayon et al., 2006).

Análisis físicos y químicos de los vinos

La única variable con diferencia significativa (p≤ 0.05) fue la producción de SO₂ (Cuadro 4), donde las cepas con los valores menores fueron SR19 y SR26, lo cual coincide con una tolerancia baja en la prueba de sulfitado. Además, la cepa SR26 ya había destacado por su velocidad durante la fermentación.

En las otras variables, los valores de azúcares residuales variaron de 2.7 a 3.8, lo cual indica que son vinos secos (menores a 5 g L^-1) con fermentaciones completas (OIV, 2012b), característica deseable en cualquier levadura fermentativa. La acidez volátil fue de 0.13 a 0.26 g ácido acético L^-1, valores muy inferiores al límite máximo legal fijado por la OIV (2012b) para vinos de calidad (menor a 1.1 g ácido acético L^-1). Para el pH (de 3.6 a 3.7) y ATT (de 6.5 a 7.9 g L^-1 de ácido tartárico), los valores estuvieron dentro de los rangos normales, pero es deseable que para vinos tintos los valores de ATT estén alrededor de 4 g L^-1 de ácido tartático (Jackson, 2008). Esto podría lograrse induciendo una fermentación maloláctica, la cual disminuye la ATT en los vinos y mejora sus aspectos sensoriales (Lonvaud-Funel, 1999).

Identificación de las levaduras

En el Cuadro 5 se muestra el nombre de la cepa aislada, la especie a la que pertenece y la cepa referida (NCBI) con la cual se obtuvieron las otras variables de identificación. Los valores de cero para el e-valor, los porcentajes cercanos a 100 en identificación y cobertura de consulta indican lo certero y confiable que fue el proceso de alineación para identificar las cepas. En siete de los ocho casos los valores fueron óptimos, y para la cepa SR27 la cobertura de consulta fue baja, la cual indica el porcentaje de secuencia usado para la alineación de la cepa, es decir 29 % de la secuencia introducida no fue utilizada para la alineación, lo cual se debe a que el dominio amplificado en esta cepa tiene pares de bases que no coinciden con las de las cepas reportadas en la base de datos.

Respecto a las especies, resaltan aquellas que además de presentar tolerancia a los compuestos probados (etanol, SO₂, toxina killer), tuvieron características destacables durante las microvinificaciones, como N05 en su comportamiento fermentativo, o SR19 y SR26 por su baja producción de SO₂, pertenecientes a la especie S. cerevisiae, lo cual era esperado por ser la que tiene más reportes y es la más usada para procesos fermentativos y producción de etanol (Pretorius, 2000; Mas et al., 2002). Además, es novedoso que cuatro de las ocho cepas identificadas pertenezcan a la especie S. paradoxus, la cual se presenta en campo pero no es reconocida su participación durante la vinificación, aunque está reportada por sus características enológicas deseables (Orlic et al., 2007; Orlic et al., 2009).

Finalmente, respecto al origen de los microorganismos, tres cepas seleccionadas provinieron de la finca El Barreno (OB10, OB11 y N42) y fueron identificadas como S. paradoxus. Las otras cinco cepas identificadas provinieron de la finca El Rosario; cuatro de ellas (N05, SR26, SR 19 y SR27) corresponden a S. cerevisiae y una más a S. paradoxus (SR25).

 

CONCLUSIONES

Sólo 26 % de las levaduras aisladas pertenecieron al género Saccharomyces y dentro de éstas se seleccionaron ocho cepas (SR19, SR25, SR26, SR27, OB10, OB11, N42 y N05). La cepa nativa N05 produjo el mayor grado alcohólico, eficiencia de fermentación y conversión azúcar-etanol, comparable con el de la cepa comercial K1. Los valores de pH, ATT, AV y azúcares residuales obtenidos en las microvinificaciones de las ocho cepas evaluadas están dentro de los intervalos normales y dentro de los límites establecidos por los organismos reguladores de la calidad en vinos. La técnica de amplificación mediante PCR del dominio D1/D2 y su secuenciación permitió una identificación confiable de los microorganismos estudiados.

 

LITERATURA CITADA

AVQ (Asociación de vitivinicultores de Querétaro) 2011. Estudio de impacto productivo de un viñedo. Estado de Querétaro. Querétaro, México. 111 p.         [ Links ]

Bevan, E. A., and M. Makower 1963. The physiological bases of the killer character in yeasts. In: Proceedings of the XI International Congress of Genetics. Delft, The Netherlands 1: 202-203.         [ Links ]

Cano, J., J. Guarro, and J. Gené 2004. Molecular and morphological identification of Colletotrichum species of clinical interest. J. Clin. Microbiol. 42: 2450-2454.         [ Links ]

CEE (Comunidad Económica Europea) 1990. Analyses des mouts et des vins. Office des Publications Officielles des Communautés Européennes. Paris, France. 192 p.         [ Links ]

Charters, S., and S. Pettiegrew 2007. The dimensions of wine quality. Food Qual. Prefer. 18: 997-1007.         [ Links ]

De la Cruz, M. A., R. Á. Martínez-Peniche, A. E. Becerril-Román, y M. S. Chávaro-Ortiz, 2012. Caracterización física y química de vinos producidos en Querétaro. Rev. Fitotec. Mex. 35: 61-67.         [ Links ]

Estevan, M. C. 2013. El mercado del vino en México, estudios de mercado. Exportaciones e inversión. Oficina económica y comercial de la embajada de España en México. D.F. México, 60 p.         [ Links ]

Fleet, G. H. 2003. Yeast interactions and wine flavour. Int. J. Food Microbiol. 86: 11-22.         [ Links ]

García, B. J. 1976. Metodología de Análisis de Vinos y Derivados. Ed. Sepsa. Vilafranca del Penedés. España. 92 p.         [ Links ]

Guamán, C., y J. Carbajal 2009. Caracterización e identificación de aislados de levaduras carotenogénicas de varias zonas naturales del Ecuador. Universitas Scientiarum 14: 187-197.         [ Links ]

Gutiérrez V., A. R, M. P. Santamaría A., R. M. López M., y M. J. Sevilla 1995. Selección de levaduras vínicas en la denominación de Origen Calificada Rioja. ZUBÍA Monográfico 7: 103-111.         [ Links ]

Hidalgo, P., y K. Fernández 2005. Cepas de Saccharomyces cerevisiae CECT 11774 y CECT 11775 y su empleo en la elaboración, por fermentación alcohólica, de bebidas alcohólicas y otros productos alimenticios. Solicitud de patente. Oficina Española de Patente y Marcas. ES 2 222 088 A1. Madrid, España. 9 p.         [ Links ]

Izgü F., D. Altinbay, and T. Acun 2006. Killer toxin of Pichia anomala NCYC 432; purification, characterization and its exo-β-1,3-glucanase activity. Enzyme Microb. Tech. 39: 669-676.         [ Links ]

Jackson, R. 2008. Wine Science Principles and Applications. Postfermentation Treatments and Related Topics. Elsevier. London, UK. 419 p.         [ Links ]

Jacobs C. J., I., Fourie, and H. J. J. van Vuuren 1991. Characterization of killer yeast isolates from Chenin blanc grapes and grape skins. S. Afr. J. Enol. Vitic. 12: 57-63.         [ Links ]

Jolly, N. P., O. P. H. Augustyn, and I. S. Pretorius 2003. The occurrence of Non-Saccharomyces cerevisiae yeast species over three vintages in four vineyards and grape must from four production regions of the Western Cape, South Africa. S. Afr. J. Enol. Vitic. 24: 35-42.         [ Links ]

Lonvaud-Funel, A. 1999 Lactic acid bacteria in the quality improvement and depreciation of wine. Antonie van Leeuw 76: 317-331.         [ Links ]

Lopes, C. A., M. E. Rodríguez, M. Sangorrin, A. Querol, and A. C. Caballero 2007. Patagonian wines: The selection of an indigenous yeast starter. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34: 539-546.         [ Links ]

Manginot, C., J. Roustan, and J. Sablayrolles 1998. Nitrogen demand of different yeast strains during alcoholic fermentation. Importance of stationary phase. Enzyme Microbiol. Tech. 23: 511-517.         [ Links ]

Marquina, D., A. Santos, and J. M. Peinado 2002. Biology of killer yeasts. Int. Microbiol. 5: 65-71.         [ Links ]

Mas, A., J. Torija, G. Beltrán, M. Novo, N. Hierro, M. Poblet, N. Rozés, y J. Guillamón 2002. Selección de levaduras. Tecnología del vino, Fermentos 1: 39-44.         [ Links ]

Medina, K., L. Ferreri, L. Fariña, E. Boido, E. Dellacassa, C. Gaggero, y F. Carrau 2007. Aplicación de la levadura Hanseniaspora vineae en cultivos mixtos con Saccharomyces cerevisiae en la vinificación. Enología 6: 1-6.         [ Links ]

Mercado, L., A. Dalcero, R. Masuelli, and M. Combina 2007. Diversity of Saccharomyces strains on grapes and winery surfaces: analysis of their contribution to fermentative flora of Malbec wine from Mendoza (Argentina) during two consecutive years. Food Microbiol. 24: 403-412.         [ Links ]

Métris, A., S. M. George, and J. Baranyi 2006. Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics. Appl. Microbiol. Environ. 72: 6674-6679.         [ Links ]

OIV (Organización internacional de la vid y el vino). 2009. Compendium of international methods of analysis-OIV, reducing substances (OIV-OENO 377-2009). OIV. París, Francia. 5 p.         [ Links ]

OIV (Organización internacional de la vid y el vino) 2012a. Directrices para la caracterización de levaduras de vino del género Saccharomyces aisladas de ambientes vitivinícolas (OIV-OENO 370-2012). Organización internacional de la vid y el vino. París, Francia. 30 p.         [ Links ]

OIV (Organización internacional de la vid y el vino) 2012b. International standard for labeling of wine. Organización internacional de la vid y el vino. París, Francia. 14 p.         [ Links ]

Orlic, S., S. Radzepovic, A. Jeromel, S. Herjavec, and L. Iacumin 2007. Influence of indigenous Saccharomyces paradoxus strains on Chardonnay wine fermentation aroma. Int. J. Food Sci. Tech. 42: 95-101.         [ Links ]

Orlic, S., F. N. Arrollo-Lopez, K. Huic-Babic, I. Lucilla, A. Querol, and E. Barrio 2009. A comparative study of the wine fermentation performance of Saccharomyces paradoxus under different nitrogen concentrations and glucose/fructose ratios. J. Appl. Microbiol. 108: 73-80.         [ Links ]

Pasteur L. 1857. Mémoire sur la fermentation alcoolique. Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances de l'Académie des Sciences. 45: 1032-1036.         [ Links ]

Pretorius, I. S. 2000. Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the ancient art of winemaking. Yeast 16: 675-729.         [ Links ]

Rainieri, S., and I. Pretorius 2000. Selection and improvement of wine yeast. Ann. Microbiol. 50: 15-31.         [ Links ]

Ramos, C. L., W. Ferreira, A. L. Freire, D. R. Dias, E. C. Araújo, and R. F. Schwan 2013. Evaluation of stress tolerance and fermentative behavior of indigenous Saccharomyces cerevisiae. Braz. J. Microbiol. 44: 935-944.         [ Links ]

Ribereau-Gayon, P., D. Dubordieu, B. Donéche, and Lonvaud 2006. Handbook of Enology. Vol. 1. The Microbiology of Wine and Vinifications. 2nd ed. John Wiley and Sons, Ltd. Bordeaux, France. 497 p.         [ Links ]

Rodríguez, L. A., D. Abad, J. Gómez, J.B. Casanova, y C. Lema 1998. Fenotipo killer. Distribución en la Comarca de la Ribiera Sacra en las poblaciones de Saccharomyces cerevisiae. Ciencia Tecnol. Aliment. 2: 33.37        [ Links ]

Santamaría, P., R. López, E. López, P. Garijo, and A. Gutiérrez 2008. Permanence of yeast inocula in the winery ecosystem and presence in spontaneous fermentations. Eur. J. Food Res. Tec. 227: 1563-1567.         [ Links ]

Serjeant, K., R. Tang, N. Anfang, J. R. Beggs, and M. R. Goddard 2008. Yeasts associated with the New Zealand nothofagus honeydew system. NZ J. Ecol. 32: 209-213.         [ Links ]

Silva, G. A., T. L. Bernardi, P. D. Carvalho S., M. Menegotto, and P. Valente 2012. Rapid yeast DNA extraction by boiling and freezing-thawing without using chemical reagents and DNA purification. Braz. Arch. Biol. Technol. 55: 319-327.         [ Links ]

Swiegers, J. H., I. L. Francis, M. J. Herderich, and I. S. Pretorius 2006. Meeting the consumer expectations through management in vineyard and winery the choice of yeast for fermentation offers a great potential to adjust the aroma of Sauvignon Blanc wine. Wine Ind. J. 21: 34-42.         [ Links ]

Togores, J. H. 2006. La Calidad del Vino desde el Viñedo. Ed. Mundi-Prensa Libros. Barcelona, España. 390 p.         [ Links ]

Torija, M. J., G. Beltran, M. Novo, M. Poblet, J. Guillamón, A. Mas, and N. Rozés 2003. Effects of fermentation temperature and Saccharomyces species on the cell fatty acid composition and presence of volatile compounds in wine. Int. J. Food Microbiol. 85: 127-136.         [ Links ]

Viana, F., J.V. Gil, S. Genovés, S. Vallés, and P. Manzanares 2008. Rational selection of non-Saccharomyces wine yeasts for mixed starters based on ester formation and enological traits. Food Microbiol. 25: 778-785.         [ Links ]