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Agrociencia

versión On-line ISSN 2521-9766versión impresa ISSN 1405-3195

Agrociencia vol.46 no.7 México oct./nov. 2012

 

Fitociencia

 

Antocianinas y actividad antioxidante en maíces (Zea mays L.) de las razas chalqueño, elotes cónicos y bolita

 

Anthocyanins and antioxidant activity in maize grains (Zea mays L.) of chalqueño, elotes cónicos and bolita races

 

Yolanda Salinas–Moreno1*, José J. Pérez–Alonso2, Gricelda Vázquez–Carrillo3, Flavio Aragón–Cuevas3, Gustavo A. Velázquez–Cardelas3

 

1 Laboratorio de Maíz, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Apartado Postal 10. 56230. Chapingo, Estado de México. *Autor responsable: (yolysamx@yahoo.com).

2 Unidad de Nutrición y Bromatología, Facultad de Farmacia, Universidad de Salamanca, Campus Miguel de Unamuno s/n. E–37007 Salamanca, España.

3 Programa de maíz, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Apartado Postal 10. 56230. Chapingo, Estado de México.

 

Recibido: julio, 2012.
Aprobado: septiembre, 2012.

 

Resumen

En México los maíces (Zea mays L.) de grano azul se destinan preferentemente a la elaboración de diversos alimentos dentro de los cuales la tortilla es el más común. La variabilidad en el contenido de antocianinas, que son los pigmentos responsables de la coloración, entre los maíces destinados para este fin, se conoce poco. Por tanto, se analizaron 18 muestras de grano de maíz azul/morado (Zea mays L.) de las razas Chalqueño (CHAL), Elotes Cónicos (EC) y Bolita (BOL) para determinar su contenido de antocianinas (AT), fenoles solubles totales (FST) y actividad antioxidante (AA), así como su color y tamaño de grano. También se determinó el perfil cromatográfico de sus antocianinas y agliconas. El diseño experimental fue un completamente al azar. Los resultados mostraron variabilidad reducida en AT y FST dentro de las razas y mayor entre razas. Los contenidos promedio de AT por raza fueron 855 ±140, 1205±130 y 423 ±95 mg ECG/kg MS en CHAL, EC y BOL. Hubo una correlación significativa (r2=0.89) entre AT y AA. Las razas presentaron las mismas antocianinas y el perfil estuvo caracterizado por predominancia de antocianinas aciladas (>60 %) derivadas de cianidina, que fue la aglicona más abundante. El peso de 100 semillas y color del grano (L y croma) mostraron correlación altamente significativa con el contenido de AT. Debido al contenido alto de AT y un perfil cromatográfico dominado por derivados de cianidina, estos maíces son una materia prima atractiva para elaborar productos alimenticios altos en antioxidantes.

Palabras clave: Zea mays, antocianinas, flavonoides, color, razas.

 

Abstract

In México, blue maize (Zea mays L.) grains are destined preferably for the elaboration of diverse foods among which tortilla is the most common. Anthocyanins are the pigments responsible for grain color, nevertheless, their variability among maize used for torilla elaboration is scarcely known. Therefore, 18 samples of blue/purple maize grains (Zea mays L.) of Chalqueño (CHAL), Elotes Cónicos (EC) and Bolita (BOL) races were analyzed to determine their anthocyanin content (AT), total soluble phenols (TSP), and antioxidant activity (AA), as well as the color and size of the grain. The chromatographic profile of their anthocyanins and aglycons was also determined. A completely randomized experimental design was used. Results showed a reduced variability in AT and TSP within the races but variability was higher among the races. The average AT contents per race were 855 ±140, 1205±130 and 423±95 mg ECG/kg MS in CHAL, EC and BOL, respectively. There was a significant correlation (r2=0.89) between AT and AA. The races presented a similar anthocyanin profile characterized by the predominance of acylated anthocyanins (>60 %) derived from cyanidin, which was the most abundant aglycone. The weight of 100 seeds and the color of the grain (L and chrome) showed a highly significant correlation with the AT content. Due to the high AT content and a chromatographic profile dominated by cyanidin derivatives, these maize varieties are an attractive raw material for the elaboration of food products with high antioxidant content.

Key words: Zea mays, anthocyanins, flavonoids, color, races.

 

INTRODUCCIÓN

En México, las razas de maíz (Zea mays L.) Elotes Cónicos, Chalqueño y Bolita están entre las más usadas por productores tradicionales que utilizan semillas de maíz nativas. En estas razas de maíz nativas de México hay variedades de grano pigmentado en las cuales pueden predominar los carotenoides o los flavonoides del tipo antocianinas, las cuales confieren al grano de maíz colores desde rojo tenue hasta púrpura intenso (Salinas et al., 1999).

Las antocianinas del grano de maíz se han cuantificado (Harborne y Self, 1987; Salinas et al., 1999) e identificado (Salinas et al., 2005; Montilla et al., 2011; Zilic et al., 2012) y evaluado sus actividades biológicas (Zhao et al., 2009; Yang y Zhai, 2011) especialmente su actividad antioxidante (AA) (Jing et al., 2008; Lopez–Martínez et al, 2009; Zilic et al, 2012). La AA se atribuye principalmente a las antocianinas de los granos rojos y azul/morados estudiadas extensamente (de la Parra et al., 2007; Lopez–Martínez et al., 2009; Zilic et al., 2012). Además participan los ácidos fenólicos y otros flavonoides sin color, como la quercetina, que se extraen conjuntamente con las antocianinas (Predeschi y Cisneros–Zeballos 2006). La AA tiene relevancia por su relación con efectos anticarcinogénicos (Liu, 2007). Las antocianinas también tienen actividad antimicrobiana y antiproliferativa (Zhao et al., 2009).

Varios estudios sobre antocianinas en maíz se han realizado con un número limitado de muestras para cada color de grano (de la Parra et al., 2007; Montilla et al., 2011; Zilic et al., 2012). Pero hay pocos estudios acerca de la variabilidad de antocianinas y actividad antioxidante entre recolectas de una misma raza y color de grano. Esta información es relevante para elegir los mejores maíces de grano azul/morado y aprovechar su valor nutracéutico en la elaboración de productos alimenticios o su aprovechamiento industrial no alimenticio.

Los objetivos del presente estudio fueron determinar en poblaciones de maíz azul/morado de las razas Chalqueño, Elotes Cónicos y Bolita: 1) la variabilidad en el contenido y tipo de antocianinas, 2) la relación de características físicas de grano y contenido de antocianinas, y 3) la actividad antioxidante de los extractos de antocianinas del grano crudo.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material de estudio

Se estudiaron 18 muestras de grano azul/morado de las razas de maíz Elotes Cónicos (EC), Chalqueño (CHAL) y Bolita (BOL). Las muestras de la raza EC se recolectaron con productores en los municipios de Acambay, Almoloya de Juárez, Mexicaltzingo, Tenango del Valle, Tenango del Aire, y Villa del Carbón, del Estado de México; las de la raza CHAL son del proyecto No. BEI–MAI–1034, financiado por SINAREFI y se recolectaron en las Delegaciones Tlalpan y Milpa Alta en el Distrito Federal; y las de la raza BOL se recolectaron en los municipios de San Pablo Huitzo, San Pedro Ixtlahuaca, San Martín Tilcajete, Trinidad Zaachila, Zimatlán y Ejutla, estado de Oaxaca.

Características físicas del grano

Las variables fueron: 1) color de grano medido con un colorímetro Hunter–Lab (Mini Scan XE Plus 45/0–L, USA) en una muestra de 30 granos sanos montados sobre una base de plastilina gris simulando la forma en que se encuentran en la mazorca, y se obtuvieron los valores de L, a* y b* y se calculó el ángulo de tono o hue y croma de acuerdo con lo descrito por McGuire (1982); 2) peso de 100 semillas, se contaron manualmente de manera aleatoria 100 granos sanos de cada muestra por duplicado y se pesaron en una balanza semi–analítica (Sartorius BL610, GER, sensibilidad de 0.01g). La humedad en las muestras de grano fue 11 a 12 %.

Preparación de las muestras para su análisis

En 40 granos de cada muestra, tomados al azar, se removió el germen manualmente con un bisturí. El germen carece de antocianinas pero tiene una cantidad alta de fenoles extractables (Salinas et al., 2007). El germen se eliminó antes de la molienda para no realizar extracciones líquido–líquido con hexano del extracto de antocianinas, pues la grasa interfiere en su cuantificación. El grano sin germen se trituró en un molino IKA (MF 10 Basic, IKA Laboratory equipment, USA) con malla 0.5 mm, y la harina se deshidrató en una estufa (Blue M, Electronic Company, USA) a 40 °C por 18 h. Las muestras deshidratadas se colocaron en un desecador de vidrio.

Extracción de fenoles solubles totales

En un matraz Erlenmeyer de 50 mL se depositó 1.0 g de muestra y se mezcló con 20 mL de metanol acidificado al 1 % con ácido triflouracético. La mezcla se sónico 15 min en un baño sonicador (Branson equipment, model 2510, USA) y se refrigeró (4 °C±1°) por 105 min. La mezcla se centrifugó (Universal 32, Hettich Zentrifugen, Germany) 10 min a 2200 g y el sobrenadante se filtró en papel Whatman No. 4. Con este extracto se realizaron las determinaciones.

Fenoles solubles totales (Folin–Ciocalteau)

Se usó el método de Folin–Ciocalteau (Singleton y Rossi, 1965). El extracto metanólico (100 µL) se mezcló con el reactivo Folin–Ciocalteu, se dejó reposar 6 min y se agregó Na2CO3. El volumen se ajustó a 3 mL con agua destilada, se agitó en vórtex y reposó 90 min a temperatura ambiente (22 °C±2°) en la oscuridad. Las muestras se centrifugaron y se midió su absorbancia en un espectrofotómetro (Perkin–Elmer Lambda 25 UV/Vis) a 760 nm. El contenido de fenoles solubles totales (FST) se calculó con base en una curva patrón de acido gálico y se expresó en mg equivalentes de ácido gálico (EAG) kg–1 de muestra seca (de la Parra et al., 2007).

Antocianinas totales

Se usó el método de Abdel–Aal et al. (1999) y modificado por Salinas et al. (2005). La absorbancia del extracto metanólico de la muestra se midió en un espectrofotómetro (Perkin–Elmer Lambda 25) a 520 nm. Se elaboró una curva patrón de cianidina 3–glucósido (Extrashintasa, FR) para expresar el contenido de antocianinas totales en mg equivalentes de cianidina 3–glucósido (ECG) kg–1 de muestra seca.

Análisis de antocianinas por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Una fracción del extracto de fenoles se purificó en una columna de resina Amberlite XAD–7 según lo descrito por Salinas et al. (2005). El extracto purificado se filtró con un filtro (acrodisco) de nylon (Millipore, 0.45 /im) y se analizó por HPLC en un equipo Perkin–Elmer Series 200 con un detector de UV–DAD con arreglo de diodos, controlados por una computadora personal con el programa TotalChromTM. Se uso el método descrito por Fossen et al. (2001) con dos disolventes bajo un sistema de gradientes; los disolventes fueron A (ácido fórmico–agua, 1:9 v/v) y B (ácido fórmico–agua–metanol, 1:4:5 v/v/v). Se empleó un gradiente lineal de 10 % de B hasta 100 % por 17 min, una elusión isocrática por 4 min (100 % B) y un gradiente lineal de 100 % de B hasta 10 % de B por 1 min. La velocidad de flujo fue 1.2 mL min–1, un volumen de inyección de 20 µL y tiempo de corrida de 21 min. La temperatura de la columna se mantuvo en 25 °C. Las antocianinas se identificaron comparando sus tiempos de retención con los de estándares comerciales, y comparando los espectros obtenidos con el arreglo de diodos y con los resultados reportados por de Pascual–Teresa et al. (2002) y Gonzalez–Manzano et al. (2008).

Para las agliconas o antocianidinas, la muestra purificada se hidrolizó con HCl 6 M a 100 °C por 40 min. La solución fue concentrada a sequedad y el residuo re–disuelto en HCl 0.01M. Se analizó en el HPLC bajo las mismas condiciones descritas para antocianinas (de Pascual–Teresa et al., 2002).

Actividad antioxidante

Se usó el método del DPPH (Cai et al., 2003) basado en la medición de la habilidad de compuestos antioxidantes para reducir el DPPH (2,2–difenil–1–picrilhidrazil), observada como un decremento de la absorbancia de la reacción en función del tiempo. Un volumen de 2.8 mL de una solución 60 µM de DPPH disuelto en metanol al 80 % se puso en contacto con 200 µL del extracto. Se monitoreó la absorbancia cada 5 min durante 30 min a una longitud de onda de 515 nm. La actividad antioxidante se expresó en función del porcentaje de reducción del DPPH, calculado así: [%DPPH = (A0 – An) 100 / A0], donde A0 es la absorbancia obtenida al emplear en la prueba metanol al 80 % en lugar de muestra, y An es la absorbancia de la muestra.

Análisis estadístico

El diseño experimental fue completamente al azar, los tratamientos fueron las muestras de maíz de cada raza y con dos repeticiones para cada variable. Se realizó un análisis de varianza y las medias de las variables por raza se compararon con la prueba de Tukey (p<0.05) con los resultados de las variables por raza. Se efectuó análisis de correlación con las variables de todas las muestras analizadas. En todos los casos los análisis se realizaron con SAS (SAS Institute Inc. 2002).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Características físicas del grano, fenoles y actividad antioxidante

Las características físicas del grano que afectan la concentración de antocianinas son tamaño y color principalmente. El tamaño influye por un efecto de dilución de las antocianinas en la harina del grano usada para la cuantificación, dado que las antocianinas se localizan en el pericarpio y en la capa de aleurona (Salinas et al., 1999). Un grano grande tendrá mayor efecto de dilución que uno pequeño; el grano de maíz de la raza Chalqueño se considera grande y la variación observada fue 25 a 51 g 100–1 semillas (Cuadro 1) En las muestras de grano azul/morado de la raza Chalqueño las antocianinas se localizan únicamente en la capa de aleurona (Salinas et al., 1999) y la textura de su endospermo es harinosa (Wellhausen et al., 1951).

El color se relaciona con el contenido de antocianinas y los granos rojos presentan menor contenido que los granos púrpura o magenta (Salinas et al., 1999; Montilla et al., 2011; Zilic et al., 2012). En las muestras analizadas, el tono o tinte (h°) varió desde 299 hasta 335.9°, los valores de luminosidad (L) apenas alcanzaron 20 %, en tanto que el índice de saturación de color (Croma) más elevado fue 2.3. De acuerdo con estos valores, el color del grano en las muestras de CHAL analizadas es azul/morado oscuro y poco brillante, pero no es azul, tono que se asocia con un valor de h° de 270° aunque las muestras 10 y 20 se acercan a dicho tono. Al respecto, hay fotografías digitales de las muestras de antocianinas del grano de maíz (Yang y Zhai, 2011; Montilla et al., 2011; Zilic et al., 2012), lo que ayuda a comparar más objetivamente color de grano y contenido de antocianinas. Sin embargo, es más útil contar con información sobre los valores de las variables de color para cada color de grano.

El contenido de AT en las muestras varió de 579.4 a 1042.1 mg equivalentes de cianidina 3–glucosido (ECG) kg–1 de muestra seca (MS). Para maíces de grano azul en 20 poblaciones de la raza Olotillo los valores van desde 276.8 hasta 904.0 mg ECG kg–1 MS (Salinas et al., 2012), que son similares a los de las muestras de la raza Chalqueño, mientras que Lopez–Martínez et al. (2009) reportan 995.0 mg ECG kg–1 MS en una muestra de grano azul. Los FST variaron de 918.9 a 1479.2 mg equivalentes de ácido gálico (EAG) kg MS; los valores más bajos se presentaron en las muestras 19 y 20, que también mostraron menor contenido de AT.

El disolvente usado para la extracción de antocianinas permite la mayor extracción de estos compuestos (Abdel–Aal y Hucl, 1999), pero se extraen conjuntamente ácidos fenólicos y otros flavonoides que son cuantificados en el ensayo de Folin–Ciocalteau. En las muestras de maíz Chalqueño las antocianinas representaron en promedio 76.2 % de los FST. Por tanto, el valor de FST es invariablemente mayor que el de AT. Las antocianinas son los fenoles predominantes en el extracto, por lo cual son las principales responsables de la actividad antioxidante (Yang y Zhai, 2011), la cual varió de 34.0 a 60.3 %. Las muestras con menor AA mostraron contenidos menores de AT y FST.

El tamaño de grano en los maíces EC mostró una variación de 24.8 a 46.8 g 100–1 semillas (Cuadro 2), lo cual es parecido al de los maíces Chalqueños. Las antocianinas se ubican sólo en la capa de aleurona (por su color de grano) y la textura del endospermo es harinosa (Wellhausen et al. 1951). Los valores de las variables de color fueron similares a los de los maíces Chalqueños por lo que se puede afirmar que ambos grupos de maíces tienen un color parecido. Los valores de AT variaron de 997.8 a 1332.2 mg ECG kg–1 MS, y con más de 1000 mg ECG kg–1 MS en cinco de las seis muestras analizadas, por lo que su valor promedio fue superior al de las muestras de Chalqueño. Dentro de las muestras de EC, las de menor y mayor tamaño de grano tuvieron un contenido mayor y menor de AT, lo cual concuerda con lo señalado por Betran et al. (2000) y Zilic et al. (2012) respecto al efecto del tamaño de grano en el contenido de AT. Los FST mostraron un intervalo de 1425.8 a 1626.7 mg EAG kg–1 MS, valores mayores a los observados en los maíces CHAL. En los maíces EC la proporción promedio de antocianinas dentro de los FST fue 82.4 %, proporción mayor que la observada en los maíces CHAL. La proporción alta de antocianinas en los FST de estos maíces posiblemente contribuyó al mayor poder antioxidante que presentaron sus extractos, con valores de reducción de DPPH de 46.6 a 60.4 %.

Los granos de la raza BOL presentaron valores de peso de 100 semillas entre 39.2 y 46.8 g (Cuadro 3), que corresponden a la categoría de maíces de grano grande; sin embargo, sus dimensiones son menores que el grano del maíz CHAL, pero al ser más cristalino, pesa más. Con respecto al color del grano, los valores de luminosidad y croma fueron mayores a los observados en los granos de las razas CHAL y EC, particularmente en las muestras VC–016, VC–089 y VC–151, lo que indica granos de coloración menos intensa y más brillante. El tinte o tono de color en dichas muestras varió de 25.6 a 33.1°, indicando color morado/rojizo, en tanto que en las muestras VC–082, VC–107 y VC–120 los valores fueron mayores de 300° y corresponden a un tinte de color azul/morado.

El contenido de AT en los maíces BOL fue de 304.1 a 528.0 mg ECG kg–1 MS y considerablemente menor que el observado en los CHAL y EC. Los contenidos menores se presentaron en las muestras de color rojizo (VC–016, VC–089 y VC–151) y los más altos en las azul/morado (VC–082, VC–107 y VC–120). Los valores de FST variaron de 875.0 a 1276.2 mg EAG kg–1 MS, con los más altos en las muestras con mayor contenido de AT, excepto en VC–151. En las muestras de la raza Bolita la proporción promedio de antocianinas en los FST fue 41.6 %, que es considerablemente menor a la observada en los maíces Chalqueño y Elotes Cónicos; además, los valores de AA de la raza Bolita también fueron bajos comparados con los de las razas mencionadas.

Los fenoles en el grano de maíz están compuestos por ácidos fenólicos y flavonoides y pueden estar en forma libre o soluble, o ligados a biomoléculas como proteínas y carbohidratos estructurales (Adom y Liu, 2002). Alrededor de 90 % de los ácidos fenólicos en el grano de maíz se encuentra en forma ligada, principalmente a componentes de pared celular (de la Parra et al., 2007; Montilla et al., 2011), mientras que los flavonoides están predominantemente en forma extraíble o soluble. En el caso de las antocianinas (flavonoides) la proporción ligada es baja (Montilla et al., 2011). En el extracto de FST de los maíces BOL una proporción importante puede corresponder a flavonoides diferentes a antocianinas, que no poseen una capacidad alta para reducir el radicar estable DPPH.

Correlaciones entre las variables analizadas

El PCS del grano de los maíces mostró correlaciones negativas y altamente significativas con las variables fenólicas (AT, FST) y la AA, y esto significa que los granos de menor peso tendrán un contenido mayor de antocianinas, fenoles solubles y actividad antioxidante (Cuadro 4), lo cual se explica por la ubicación del pigmento en los granos en las capas periféricas (capa de aleurona). Así, un grano pequeño tiene proporcionalmente más área pigmentada que un grano grande, por unidad de peso.

La luminosidad (L) y el croma (Cr) mostraron una correlación mayor con las variables fenólicas y la AA; la variable h°, relacionada con el tono de color, mostró correlaciones menores. Esto significa que en muestras de grano azul/morado, aquellas con los valores más bajos en L y Cr tendrán contenidos de AT y FST mayores. Los valores de correlación entre las variables peso de 100 semillas y color (variables no destructivas) son para maíces con un color azul/morado, lo cual agrega validez para usarse como criterios de selección en un programa de mejoramiento genético de maíces azules en el que interese el contenido de AT.

Las variables AT y FST mostraron una correlación positiva y altamente significativa con la AA evaluada mediante el porcentaje de DPPH reducido. Estos resultados coinciden con los reportados por Adom y Liu (2002) y de la Parra et al. (2007) de que los fenoles son los responsables de la AA del grano de maíz, y en los maíces con pigmentos antocianos las antocianinas contribuyen más (Zilic et al., 2012).

Perfil de antocianinas y antocianidinas en el grano de maíces azul/morado

El perfil de antocianinas observado en el grano azul/morado de las razas de maíz CHAL, EC y BOL fue parecido, con la presencia de hasta 14 picos (Figuras 13) (2). Los picos predominantes fueron 7 y 10 que corresponden a las antocianinas cianidina 3– malonil glucósido y ciandina 3–dimalonil–glucósido (Cuadro 5). La suma de los porcentajes relativos de área promedio de las antocianinas aciladas, en las razas de maíz fue 63.4 %, el cual es más alto que el informado para maíces de grano color magenta, con pigmento en pericarpio y en capa de aleurona, y es el tipo de grano con pigmentos antocianos más estudiado (Yang y Zhai, 2011; Montilla et al., 2011; Zilic et al., 2012). Se ha descrito el perfil completo de antocianinas para este color de grano, con la identificación de entre 7 y 11 antocianinas diferentes, con predominio de cianidina 3–glucósido, que es una antocianina no acilada.

Las antocianinas no aciladas se consideran más inestables a pH y temperatura que las aciladas (de Pascual–Teresa et al., (2003), por lo que los maíces azul/morado analizados en el presente estudio podrían presentar ventajas durante los procesos de transformación hacia productos de consumo alimenticio con relación a los granos rojo magenta.

La hidrólisis ácida del extracto de antocianinas permite obtener las agliconas o antocianidinas (de Pascual–Teresa et al., 2003). En los maíces analizados el cromatograma de agliconas mostró que la mayor proporción de antocianinas deriva de cianidina (87 %), dato respaldado con la información del Cuadro 5 en el cual se aprecia que 9 de las 14 antocianinas presentes en maíz azul/morado corresponden a derivados de cianidina. Destaca también que en el maíz azul/morado de la raza Bolita no se presenta la antocianina peonidina 3–glucósido, que si está presente en el de las razas Chalqueño y Elotes Cónicos. Salinas et al. (1999) reportan que muestras de grano azul provenientes de diferentes razas comparten un mismo perfil de agliconas. Sin embargo, en el presente estudio, con un número mayor de muestras de maíz azul/morado analizadas, se observó que la raza BOL no tiene peonidina (Figura 3B), la cual está presente en el perfil de agliconas de las razas CHAL y EC (Figuras 1B y 2B).

De acuerdo con los resultados sobre la composición de las antocianinas en las muestras de grano azul/morado de las tres razas de maíz, la menor AA observada en los extractos de las muestras de la raza BOL puede explicarse por su menor contenido de AT más que por diferencias de las antocianinas en el extracto.

 

CONCLUSIONES

En el grano de maíz azul/morado existe variabilidad para antocianinas totales y actividad antioxidante entre razas de maíz, sin embargo, la raza influye en el perfil de antocianinas o agliconas. La selección de maíces de grano azul/morado para elaborar productos alimenticios con elevado contenido de antioxidantes puede apoyarse en el peso de 100 semillas y color del grano que guardan una elevada correlación con el contenido de antocianinas totales.

 

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo del Instituto de Ciencia y Tecnología del Distrito Federal para la realización parcial de este estudio a través del proyecto con clave PICSO10–53.

 

LITERATURA CITADA

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