Biotecnología

 

Caracterización genética de Manilkara zapota de Veracruz, México, con marcadores SSR

 

Genetic characterization of Manilkara zapota from Veracruz, Mexico, with SSR markers

 

Dolores González–Hernández^1*, Eliseo García–Pérez², Pablo Guntin–Marey³

 

¹ Red de Biodiversidad y Sistemática, Instituto de Ecología, A. C. Carretera Antigua a Coatepec 351, El Haya, 91070. Xalapa, Veracruz. *Autor responsable: (dolores.gonzalez@inecol.edu.mx).

² Colegio de Post–graduados, Campus Veracruz, Km. 88.5 Carretera Federal Xalapa–Veracruz. (geliseo@colpos.mx).

³ Centro Universitario Las Tunas. Av. Carlos J. Finlay s/n Rpto. Buena Vista, 75200. Las Tunas, Cuba. (guntin23@ult.edu.cu).

 

Recibido: septiembre, 2011.
Aprobado: octubre, 2012.

 

Resumen

Manilkara zapota, un fruto de las sapotáceas, es nativo de México y América Central y se cultiva en países tropicales. La variabilidad morfológica de la especie está documentada, pero la diversidad genética no se ha estudiado con marcadores moleculares co–dominantes. Los objetivos de este estudio fueron: 1) probar si los loci de microsatélites diseñados para Manilkara huberi pueden usarse para estudiar la variación genética en M. zapota, 2) conocer la variación de esta especie en ejemplares silvestres o aislados de plantaciones comerciales del estado de Veracruz, México y 3) identificar los individuos más contrastantes que puedan usarse en un programa de manejo a largo plazo. La variación genética se evaluó en 20 árboles adultos de diferentes regiones fisiográficas del estado de Veracruz. Los 12 loci de microsatélite desarrollados para M. huberi se probaron en M. zapota. Dos fueron monomórficos y tres no amplificaron. Los otros siete loci se usaron para el análisis genético. El número de alelos fue alto (media de 11.85); sin embargo, la heterocigosidad fue baja (media de 0.154). El análisis de agrupamiento formó un grupo con los ejemplares del norte y otro, con múltiples subgrupos, del sur y centro del estado. El análisis también mostró que la mayor variación se encuentra en áreas conservadas del estado. Los microsatélite empleados fueron útiles para conocer la variación genética de M. zapota.

Palabras clave: Manilkara zapota, Manilkara huberi, árbol tropical, recursos genéticos, marcadores moleculares, microsatélites.

 

Abstract

Manilkara zapota is a fruit belonging to the Sapotaceae, native to Mexico and Central America and is cultivated in tropical countries. The morphological variability of the species has been documented, but its genetic diversity has not been studied with co–dominant molecular markers. The objectives of this study were: 1) to test whether microsatellite loci designed for Manilkara huberi could be used to study genetic variation in M. zapota, 2) to learn about the variation of this species in wild and isolated specimens from commercial plantations, in the state ofVeracruz, Mexico, and 3) to identify the most contrasting individuals that could be used in a long–term management program. We assessed the genetic variation of 20 adult trees from different physiographic regions of the state of Veracruz. The 12 microsatellite loci developed for M. huberi were tested in M. zapota. Two were monomorphic and three did not amplify. The seven remaining loci were used for genetic analysis. The number of alleles was high (mean 11.85); however, the heterozygosity was low (mean 0.154). Cluster analysis formed a group with specimens from the north and the other, with multiple subgroups, from the south and center of the state. The analysis also showed that the biggest change occurred in conservation areas of the state. The microsatellites employed were useful to learn about the genetic variation of M. zapota.

Key words: Manilkara zapota, Manilkara huberi, tropical tree, genetic resources, molecular markers, microsatellites.

 

INTRODUCCIÓN

El último inventario de frutales nativos de América Tropical contiene 1100 especies distribuidas en 282 géneros y 66 familias (IP–GRI, 2001). Las sapotáceas son una familia de árboles y arbustos con distribución cosmopolita, aunque la mayoría de las especies está en regiones tropicales y subtropicales de Asia y América (Swenson y Anderberg, 2005). La familia contiene más de 50 géneros y unas 1250 especies y es importante ecológica y económicamente (Govaerts et al., 2001). Manilkara zapota (L.) van Royen (chicozapote, zapotilla o zapota) produce frutos de calidad excelente, es nativa de México y Centro América pero se cultiva en otros países tropicales por su fruto, látex y madera (Meghala et al., 2005). En México, el estudio y rescate de la biodiversidad y de los recursos naturales es prioritario. Por ello, se realizan estudios de variabilidad genética útiles para la conservación, mejoramiento y manejo racional de las especies (Serna–Lagunes et al., 2012).

Existen distintos métodos para identificar las especies vegetales, evaluar su diversidad y filogenia. Los basados en la morfología son más usados (Bayuelo–Jiménez y Ochoa, 2006), aunque su expresión puede afectarse por el ambiente y disminuir el número que pudiera evaluarse sin ambigüedad (Phillips et al., 1995). Marcadores como los citogenéticos y moleculares permiten analizar las diferencias entre los cromosomas, las proteínas o el ADN (Avise, 2004) y se usan para complementar la información cuando la de los morfológicos es insuficientes (González, 1998). Los marcadores moleculares se usan para implementar programas de mejoramiento y manejo de cultivos (Xinhua et al., 2007). En dos estudios realizados con marcadores moleculares para detectar variación genética en M. zapota (Heaton et al., 1999; Meghala et al., 2005) se usaron marcadores RAPDs (Random Amplification of Polymorphic DNAs) para detectar variación. Los resultados fueron contrastantes porque Heaton et al. (1999) detectaron variación genética reducida entre las poblaciones mexicanas con diferentes hábitat y localidades geográficas que contrasta con la diversidad morfológica amplia observada. Además, Meghala et al. (2005) evaluaron la diversidad genética de los cultivares de la India y observaron diversidad genética amplia. Lo anterior parece contradecir la probabilidad de que sea un cultivo introducido y la variación dependa del número de genotipos presentes.

Los microsatélites (SSR; simple sequence repeats) son los marcadores moleculares más usados para detectar variación genética dentro y entre poblaciones. Estos marcadores consisten en secuencias cortas repetidas de ADN localizadas a lo largo del genoma de organismos eucariontes (Tautz et al., 1986). La variabilidad y abundancia de los microsatélites es útil para medir el polimorfismo entre especies o variedades relacionadas cercanamente (Avise, 2004). Para Manilkara se han identificado regiones de microsatélites que permiten investigar parámetros de la estructura y variabilidad genética en M. huberi (Azevedo et al., 2005). Los SSR son útiles para análisis genéticos detallados por su naturaleza co–dominante; pero muchos son especie–específicos (Perrier et al., 2011). No obstante, hay presencia de estas secuencias en especies del mismo género e incluso de la misma familia (Pinhero et al., 2009) en las que las medidas de polimorfismo pueden o no estar correlacionadas con la distancia evolutiva de las especies (Sun y Kirkpatric, 1996).

Aunque el chicozapote es una especie económicamente importante en México, no hay información que permita generar programas apropiados para su mejoramiento y manejo. Los objetivos de esta investigación fueron: 1) probar si los marcadores moleculares de microsatélites identificados en M. huberi son útiles para estudiar la variación genética en M. zapota; 2) conocer la variación genética de esta especie en ejemplares silvestres o alejados de plantaciones comerciales del estado de Veracruz y 3) identificar los individuos más contrastantes que pudieran usarse para conservarlos y eventualmente integrarlos a un programa de mejoramiento genético a largo plazo.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio y material vegetal

El estado de Veracruz se localiza en la parte central de la vertiente del Golfo de México, entre 22° 28' N y 17° 09' S y 93° 36' E y 98° 39' O, en la zona tropical del hemisferio norte (Morrone, 2001), con climas y tipos de vegetación diversos. Para este estudio se recolectaron hojas jóvenes de 20 árboles de chicozapote, separados de plantaciones comerciales (con excepción de la recolecta EZ–10), en diferentes regiones fisiográficas del estado (Cuadro 1). La ubicación geográfica de los árboles muestreados se registró con un equipo de posicionamiento global (GPS). Las hojas recolectadas se colocaron en bolsas ziploc con sílica gel para mantenerlas secas hasta su llegada al laboratorio.

Extracción, purificación y PCR con oligonucleótidos para microsatélites

Antes de extraer el ADN las hojas se desinfectaron superficialmente con alcohol etílico al 75 % (solución acuosa v:v) y la extracción se realizó con el método CTAB, modificado por González y Vovides (2002). La purificación del ADN genómico se efectuó en columnas con Sephadex G50 (Sigma–Aldrich).

Se realizó un ensayo preliminar con 12 loci de microsatélites detectados previamente en M. huberi (Azevedo et al., 2005) en cinco de los ejemplares muestreados, para saber si sucedería la amplificación y conocer si eran polimórficos. De los 12 loci probados, tres no amplificaron y dos fueron monomórficos. Los siete loci restantes (Mh 04, Mh 06, Mh 07, Mh 08, Mh 12, Mh 17 y Mh 22) se usaron para conocer la variación genética en los 20 ejemplares de M. zapota (Cuadro 2).

La amplificación (PCR) se realizó en un volumen de 20 con: amortiguador de pH Tris–HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl₂ 1.5 mM y Triton X–100 0.1 %, MgCl₂ 1.25 mM, oligonucleótidos 1.0 µM, dNTPs 250 µM, 25 ng de ADN y 2 U de polimerasa Taq (Apex Gene choice). La PCR se realizó en un termociclador (Labnet International) con desnaturalización inicial a 94 °C por 3 min, seguida de 30 ciclos de 15 seg a 94 °C, 1 min a la temperatura de anillado específico del par de oligonucleótidos y extensión de 30 seg a 72 °C y una extensión final de 7 min a 72 °C. La amplificación de los productos de la PCR (5 µL) se corroboró en geles de agarosa al 0.8 %, antes de realizar la electroforesis en el gel de acrilamida. Cuando no hubo amplificación, se realizaron tres ensayos más. La concentración de ADN se aumentó a 50 y 80 ng y 15 s al tiempo para cada segmento del ciclo de la PCR.

Electroforesis en gel de acrilamida, visualización y registro de alelos

Los productos de PCR se separaron en geles de acrilamida al 6 %, según el procedimiento de Benbouza et al. (2006). La electroforesis se realizó por 3 h a 1680V, 60 mA y 80 W en una cámara vertical (Thermo Scientific Owl P10DS Dual Gel System) con amortiguador de pH TBE 1X (Trizma 10 mM, ácido bórico 8.9 mM y Na₂EDTA 2 mM). Antes de la electroforesis, el ADN se desnaturalizó 2 min a 92 °C. Entre las muestras se colocó un marcador con múltiplos de 100 pb (Promega). Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con nitrato de plata y la imagen del gel se capturó con una cámara Kodak Digital Science®. Para conocer el tamaño de los alelos (pb) se usó ID Image Analysis (versión 3.0) y el tamaño de los fragmentos del marcador como referencia.

Análisis de la variación genética

El polimorfismo genético, en número de alelos por locus (na) y efectivo de alelos (ne), los niveles observados y esperados de homo y heterocigosidad, asumiendo equilibrio de Hardy–Weinberg (HWE), las desviaciones al HWE para cada locus y el desequilibrio por ligamiento (LD) sin asumir HWE (P<0.05), se calcularon con el programa Popgen (Yeh et al., 1999). La información del contenido de polimorfismo (PIC) para cada locus se calculó en el "excel microsatellite toolkit". La presencia de alelos nulos se calculó con la estimación de máxima verosimilitud (ML) del algoritmo EM (Expectation–Maximization) de Dempster et al. (1977) con el programa GenePop 4.0 (Rousset, 2008). El coeficiente F_IS se calculó como una medida de exceso o deficiencia de heterocigosidad dentro de la especie con el programa FSTAT versión 2.9.3.2 (Goudet, 2002). La significancia de F_IS se probó con métodos de re–muestreo aleatorio y los valores de P para F_IS = 0 se calcularon con 1000 permutaciones al azar.

La similitud entre los genotipos se obtuvo con una matriz binaria de presencia (1) o ausencia (0) de alelos, y se calculó con el programa PAUP 4.0b8 (Swofford, 2001) de acuerdo con Nei y Li (1979): S = 2c /(a + b + 2c), donde c = número de alelos compartidos por la muestra (A) y la muestra (B), a = número de alelos presentes en A y no en B, y b = el número de alelos no presentes en A, pero sí en B. Con los valores de similitud se construyó un filograma sin enraizar para conocer el grado de divergencia entre ejemplares con el método NJ (Neighbor–Joining).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Siete loci de microsatélite (Mh 04, Mh 06, Mh 07, Mh 08, Mh 12, Mh 17 y Mh 22) identificados originalmente en M. huberi fueron polimórficos en M. zapota (Figura 1). El resto no amplificó (Mh 03, Mh 19 y Mh 24) o fueron monomórficos (Mh 20 y Mh 26). Esto confirmó que las amplificaciones cruzadas con los marcadores usados en especies del mismo género son posibles. Además, es posible usarlas en estudios ecológicos y de diversidad genética en escala mayor para diseñar programas para la conservación de M. zapota.

Se observaron 70 alelos en los siete loci usados. Los microsatélites en M. zapota mostraron variabilidad mayor en el número de alelos que en M. huberi con los mismos marcadores. Los alelos fueron entre 6 y 17, con media de 11.85 por locus, mientras que M. huberi promedió 6.14. Sólo el locus Mh 22 en M. zapota presentó menor número de alelos (Cuadro 3).

Los valores PIC fueron 81 % en el locus Mh 22 a 93 % en el Mh 12 (Cuadro 4). Los microsatélites, como otros marcadores co–dominantes, se usan en especies diploides suponiendo que no hay ligamiento entre loci. Esto se corroboró con los valores de LD de 0.00 en los siete loci examinados y mostró que los loci son independientes. Por tanto, el número mayor de alelos en M. zapota no resulta de artificios por ligamiento, lo cual podría deberse a procesos de hibridación o poliploidía (natural o inducida) sucedidos en el tiempo y documentados por Kosman y Leonard (2005).

En contraste con el número elevado de alelos, sólo cinco de los siete loci probados fueron heterocigotos. La H_O fue baja con respecto a H_E bajo HWE. El valor medio de Ho fue 0.154, que contrasta con el esperado de 0.951. Los valores de heterocigosidad proporcionan información de la estructura y de la evolución de las poblaciones. Por tanto, los valores bajos de heterocigosidad en M. zapota podrían indicar que la especie ha sufrido una erosión en su variabilidad genética por endogamia. Estos resultados concuerdan con los de F_IS, que indican un exceso de homocigotos. Para los loci Mh 06 y Mh 22 los valores de 1.00 indican ausencia de heterocigotos. En todos los loci, los valores de P (0.05) para este coeficiente indicaron una desviación significativa al HWE.

La combinación de un número alto de alelos y heterocigosidad baja es un fenómeno explicado con modelos teóricos (Nei y Li, 1976; Maruyama y Fuerst, 1984), que comparan los valores relativos esperados de número de alelos y la heterocigosidad de poblaciones en expansión, después que el número de miembros ha descendido drásticamente (cuello de botella), contra los valores de poblaciones que están en equilibrio. Estos modelos predicen que en poblaciones en expansión el número de alelos crecerá más rápidamente que la heterocigosidad. Si este es el caso para M. zapota, se podría suponer que esta especie en algún momento en su evolución experimentó un cuello de botella, quizá por fragmentación de su hábitat, y ahora se encuentra en expansión. Esta hipótesis podría probarse con una muestra mayor de ejemplares y de diferentes áreas de distribución.

Otra posible explicación para la deficiencia de heterocigotos es la presencia de alelos nulos. Los resultados obtenidos con el algoritmo EM para estos alelos oscilan entre 0.3581 y 0.5521 para los locus Mh 04 y Mh 17 (Cuadro 4) lo cual mostró la presencia probable de alelos nulos en M. zapota. Dado que su presencia varía considerablemente entre estudios (Dakin y Avise, 2004), se ha sugerido que las regiones flanqueadoras son más inestables que lo propuesto (Grimaldi y Crouau–Roy, 1997). Los alelos nulos se han postulado para explicar las desviaciones significativas del HWE y coeficientes positivos de endogamia (exceso de homocigotos, Jones y Ardren, 2003). Estos alelos no se amplifican debido a la concentración o calidad baja de ADN, o por la presencia de mutaciones en las regiones flanqueadoras de los oligonucleótidos, debida a la divergencia de las secuencias (Dakin y Avise, 2004). Los mismos microsatélites en amplificaciones cruzadas aumentan la presencia de alelos nulos, cuando la frecuencia de substituciones o inserciones/deleciones entre especies es mayor que dentro de la especie para la cual fueron diseñados (Oddou–Muratorio, 2009). Esto puede explicar la presencia de alelos nulos en M. zapota. Al respecto, Azevedo et al. (2005) atribuyen la deficiencia de heterocigotos en los loci Mh 06 y Mh 24 de M. huberi a la presencia posible de estos alelos. En M. zapota el locus Mh 06 no presentó heterocigotos, lo que parece indicar presencia de alelos nulos en este locus en ambas especies.

Hay métodos diversos para estimar la frecuencia de los alelos nulos desde datos genéticos experimentales. Todos suponen panmixia y atribuyen las proporciones bajas de heterocigotos a la presencia de estos alelos. Sin embargo, difieren en la interpretación de la ausencia de bandas visibles, que puede deberse a individuos homocigotos para un alelo nulo (homocigotos nulos) o a artificios de la PCR (Dakin y Avise, 2004; Chapuis y Estoup, 2007; Oddou–Muratorio, 2009). En simulaciones hechas con algoritmos diversos el método EM estimó mejor la frecuencia de alelos nulos. Este método iterativo estima la verosimilitud máxima de la frecuencia de estos alelos en los datos genéticos. No obstante, para asegurar la existencia de alelos nulos en M. zapota es necesario hacer cruzas y observar el patrón de alelos de la progenie, rediseñar oligonucleótidos para intentar recuperar el alelo heterocigoto o secuenciar los alelos para conocer sus bases moleculares detalladas.

Los valores de similitud genética obtenidos de acuerdo a Nei y Li (1979) en M. zapota variaron de 0.2326, entre los ejemplares ch8 y ch7, a 0.0290, entre los ejemplares A7 y ch8. El análisis de agrupamiento NJ, distribuyó las recolectas en dos grupos principales. El primero consistió de especímenes del norte del estado. Esas muestras (ch2, ch3 y ch4) correspondieron a individuos aislados y distantes de cualquier zona productora de chicozapote. El resto de los ejemplares, provenientes del centro y sur del estado, se incluyeron en un gran grupo formado por tres subgrupos relacionados principales por su similitud genética (Figura 2).

El subgrupo formado por ch5, ch7, NB–1, EZ–10, G2, C3 y EZ–2 concentró ejemplares recolectados en el centro del estado, con excepción de los ejemplares ch5 y ch7, de los municipios de Catemaco y Huayepan de Ocampo. El subgrupo formado por ch6, ch16, ch18, ch10, A7, ch9, ch5, y ch14 agrupó ejemplares recolectados desde Apazapan (A7) en el centro del estado, hasta Moloacán (ch9) una de las localidades más sureñas. El otro subgrupo incluyó los ejemplares ch8 de Las Choapas y ch13 de Playa Vicente (Figura 2).

El análisis de agrupamiento también reveló que los ejemplares en el mismo subgrupo no comparten rasgos morfológicos, como la forma del fruto o tamaño de las semillas. Es el caso de los frutos de la muestra C3 con semillas notablemente pequeñas o ausentes y el ejemplar genéticamente más parecido (EZ–2) con semillas normales; o el ejemplar ch8 con frutos redondos en contraste con los de ch13 que son ovalados. Estos resultados indicaron que la similitud genética de la mayoría de los ejemplares no parece estar relacionada con su cercanía geográfica. Así, los ejemplares ch5 y ch6 de Catemaco y San Andrés Tuxtla estuvieron en subgrupos diferentes, y los ejemplares ch10 y A7, de Cosoleacaque y Apazapan, estuvieron íntimamente relacionados genéticamente. El hecho de que el análisis de similitud genética haya agrupado ejemplares recolectados desde el municipio de Emiliano Zapata hasta Las Choapas podría explicarse por un flujo génico en la especie, dado por plantaciones comerciales cercanas. Sin embargo, es necesario estudiar las plantaciones de esas zonas para probar esta hipótesis. La similitud entre ejemplares geográficamente distantes, también puede explicarse por el manejo de la especie a lo largo de los años. El interés en explotar este cultivo para uso comercial en las zonas centro y sur del estado de Veracruz, pudo provocar el movimiento de la especie por agricultores en busca de nuevas áreas de producción o por los pobladores que la han trasladado para su consumo.

La longitud de las ramas del filograma es proporcional a la variación entre los ejemplares y mostró que la mayor variación se encuentra en áreas conservadas, es caso del ejemplar ch7 recolectado en un relicto de bosque tropical. Además, G2, ch2, ch6, ch8 y ch13 son candidatos adecuados para manejo fitogenético. Estos árboles también estaban entre los de más edad o se recolectaron en zonas visiblemente mejor conservadas.

 

CONCLUSIONES

El análisis genético de 20 ejemplares de M. zapota, basado en siete loci de microsatélites, reveló las afinidades genéticas de ejemplares silvestres o alejados de plantaciones comerciales en el estado de Veracruz. Los microsatélites usados tienen potencial para aplicarse en otras especies del género. La utilización de diversos índices para evaluar el nivel de polimorfismo y la capacidad de discriminación de los análisis de similitud, mostró el potencial de los microsatélites para identificar ejemplares con mayor variación genética. Para preservar el germoplasma de esta especie debe continuar la investigación, y para la configuración genética mayor de M. zapota se requiere ampliar la información genética aumentando el número de ejemplares y loci.

 

AGRADECIMIENTOS

A la Línea Prioritaria de Investigación No. 2 Agroecosistemas Tropicales del Colegio de Postgraduados, por el apoyo otorgado para la realización de las recolectas y al Laboratorio de Sistemática Molecular del Instituto de Ecología, A. C., por la infraestructura para la realización de este trabajo.

 

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