Protección vegetal

 

Cancrosis en ramas de Salix bonplandiana Kunth causada por Alternaria tenuissima (Kunze ex Pers.) Wiltshire

 

Canker in Salix bonplandiana Kunth twigs caused by Alternaria tenuissima (Kunze ex Pers.) Wiltshire

 

J. Gerardo González–Díaz¹, Rómulo García–Velasco^1*, Guadalupe Camacho–Cerón¹, Daniel Nieto–Ángel²

 

¹ Centro Universitario Tenancingo–Universidad Autónoma del Estado de México, km 1.5 Carretera Tenancingo Villa Guerrero, 52400. Estado de México.* Autor responsable: (rgarciave@uaemex.mx).

² Fitopatología. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.

 

Recibido: Mayo, 2010.
Aprobado: Enero, 2011.

 

Resumen

Salix bonplandiana Kunth, una especie arbórea nativa del Valle de México, es usada para reforestación, sus ramillas en cestería y como ornamental, su madera para construir graneros y sus hojas como forraje. Por ello es importante identificar los agentes causales de enfermedades que afectan su desarrollo. Para determinar el agente causal de la enfermedad que produce cancros en ramas de S. bomplandiana se efectuaron aislamientos y pruebas de patogenicidad. Las muestras recolectadas de tallos y ramas con cancros se sembraron en PDA y se incubaron 72 h a 25 °C. El hongo se purificó y se realizaron pruebas de patogenicidad en tres tratamientos: T1) lesiones en ramas de S. bonplandiana donde se inoculó una suspensión de 1X10⁶ conidios mL^–1 del hongo, T2) lesiones inoculadas con agua destilada estéril, y T3) testigo absoluto. Los primeros cancros de la enfermedad se obsevaron en TI y T2, 11 d después de la inoculación. De estos cancros se reaisló el hongo Alternaria tenuissima (Kunze ex Pers.) Wiltshire con características iguales al inoculo inicial. Además, la secuenciación del ADNr–ITS mostró 99 % de homología con las secuencias de A. tenuissima reportada en el GenBank–NCBI.

Palabras clave: sauce, cancros, patogenicidad.

 

Abstract

Salix bonplandiana Kunth, a tree species native to the Valley of México, is used fot reforestation; its branches in basketry and ornaments, its wood fot building barns, and its leaves as fodder. It is therefore important to identify the causative agents of diseases that affect its development. To detetmine the causative agent that produces cankers on branches of S. bonplandiana, isolates were conducted as well as pathogenicity tests. The collected samples of stems and branches with cankers were planted on PDA and incubated fot 72 h at 25 °C. The fungus was putified and tested fot pathogenicity in thtee tteatments: Tl) lesions on branches of S. bonplandiana which was inoculated with a suspension of 1Xl10⁶ conidia mL^–1 of the fungus; T2) lesions inoculated with sterile distilled water; and T3) absolute control. The first cankers of the disease were observed in T1 and T2, lid after inoculation. From these cankers the fungus Alternaria tenuissima (Kunze ex Pers) Wiltshire was reisolated with characteristics equal to the initial inoculum. In addition, the rDNA–ITS sequencing showed 99 % homology with the sequence of A. tenuissima reported in the NCBI–GenBank.

Keywords: willow, canker, pathogenicity.

 

INTRODUCCIÓN

El sauce, Salix bonplandiana Kunth o ahuejote, es un árbol originario del Valle México ampliamente distribuido desde el suroeste de los EE.UU. hasta Guatemala a través de casi todo el territorio mexicano. Se desarrolla en climas templados y le favorecen suelos ácidos y húmedos. Es una especie de crecimiento rápido que vive 20 a 30 años y tiene potencial para restauración de zonas erosionadas. Por ello se han establecido plantaciones con fines de reforestación en el Distrito Federal y Durango, México. Además sus ramillas se usan en cestería, su madera para construir graneros eficaces contra plagas y sus hojas como forraje (Quintero y Villa, 1991); ramas y ramillas deshidratadas se usan como material de relleno en arreglos florales con flores frescas o deshidratadas.

Las enfermedades más importantes en diversas especies de Salix sp. son causadas por hongos que dañan raíz, corteza, brotes y hojas, además de bacterias que dañan ramas (Nejad et al., 2004; Anselmi et al., 2006). La importancia del daño ocasionado por dichas enfermedades varía de acuerdo con la finalidad de la plantación. En plantaciones para usos ornamentales los problemas más severos derivan de microorganismos que causan manchas foliares, marchitamientos y defoliación prematura. También se presentan patógenos causantes de enfermedades que conducen a pudrición en la raíz, dañan los tallos y pueden provocar caída repentina de los árboles o rompimiento de ramas (Anselmi et al., 2006).

Las principales enfermedades que dañan tallos y ramas son necrosis provocadas por Discella carbonacea Berk. & Broome, Cytospora spp. y Phomopsis spp., costra del sauce causada por Venturia chlorospora Sacc. (Anselmi et al., 2006), cancro del sauce causado por Melampsora spp. (Ostry y Anderson, 2001), cancro negro cuyo agente causal es Glomerella myabeana Fuck. (Spiers y Hopcroft, 1993), bacteriosis causada por Erwinia salicis (Day) Chester (Sakamoto et al., 1999); además, Pseudomonas sp. (Hunter y Stott, 1978), Xanthomonas campestris (Pammel) Dowson y Agrobacterium tumefaciens (Smith & Townsend) Conn, causan daños menores. La incidencia de una enfermedad desconocida en tallos y ramas de árboles de sauce de 1 a 3 años de edad ha aumentado y provoca cancros, lo que disminuye el valor de las plantas y las hace inadecuadas para usos más rentables (Anselmi et al., 2006).

Debido a su potencial como especie ornamental, en Tenancingo, Estado de México, se estableció una plantación de S. bonplandiana, en la cual se presentó un problema fitosanitario. El objetivo del presente estudio fue determinar la etiología de la cancrosis en ramas de S. bonplandiana.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento del patógeno

En las instalaciones del Centro Universitario UAEM Tenancingo, en la Carretera Tenancingo–Villa Guerrero, Municipio de Tenancingo, Estado de México, México, se recolectaron muestras con lesiones sobre ramas de árboles de S. bonplandiana y se llevaron al laboratorio para identificar el agente causal.

De cada muestra de las lesiones en las ramas se seleccionaron cortes de 0.5 cm², con las orillas de las lesiones en el margen del tejido sintomático, se lavaron con agua destilada y sumergieron 2 min en hipoclorito de sodio al 2 %, se lavaron dos veces con agua destilada estéril y se colocaron en papel desecante estéril. Se sembraron cinco trozos por caja petri Kimax^® con papa–dextrosa–agar (PDA) Bioxon^®. Las siembras se colocaron en una incubadora (Riossa^®) a 25 °C por 72 h. La colonia desarrollada se transfirió a PDA para su purificación y se obtuvo un cultivo monospórico (Agrios, 2005; Gilchrist–Saavedra et al., 2005).

Identificación del patógeno

La identificación se realizó con base en las características del micelio y conidios; crecimiento del hongo en diferentes medios de cultivo y pruebas moleculares. Para observar las estructuras en el microscopio óptico (Cari Zeiss^®), se hicieron preparaciones permanentes de las colonias en glicerol al 50 % acidificada con HCl 12 N. El hongo aislado se identificó con claves taxonómicas de Rotem (1994) y la descripción de Ellis (1971).

El hongo fitopatógeno se sembró en cinco medios de cultivo: PDA (39 g PDA 1000 mL^–1 agua destilada), extracto de malta (EM) (50 g de extracto de malta (Difco^®) y 37.5 g de agar (Merck^®) en 1000 mL de agua destilada, harina de maíz (HM) (20 g de harina de maíz (Minsa^®) y 20 g de agar (Merk^®) en 1000 mL de agua destilada, Czapek's (C) (30 g sacarosa, 3 g nitrato de sodio, 1 g fosfato de potasio, 0.5 g de sulfato de magnesio, 0.5 g cloruro potasio y 0.01 g sulfato de fierro en 1000 mL de agua destilada) y extracto de tallo de S. bonplandiana (ET) (25.6 mL extracto de tallo, 38.5 g agar Merck^® en 1000 mL de agua destilada).

Para obtener el extracto de tallo se pesaron 25 g de corteza del tallo de arbustos de un año de edad y se trituró con 50 mL de agua destilada estéril. El sobrenadante se filtró con papel filtro No. 3 y se centrifugó 5 min a 2000 rpm.

Con el cultivo monospórico obtenido en PDA se sembró un disco de 0.6 cm de diámetro en cada medio de cultivo PDA, EM, HM, C y ET. Para cada medio de cultivo se tomaron lecturas cada 12 h, para registrar el tiempo de desarrollo de los primeros conidios. Los conidios obtenidos en cada medio se observaron para corroborar la identidad del hongo. La identificación morfológica se confirmó mediante secuenciación: se amplificó la región espadadora interna transcrita (ITS) con iniciadores universales (White et al., 1990; Bridge y Arora, 2000).

La extracción del ADN de Alternaria tenuissima se realizó con el método de CTAB 3 % descrito por Ahrens y Seemüller (1992). Se pesaron 0.03 g de micelio liofilizado y maceraron en mortero con nitrógeno líquido. El polvo se transfirió a tubos eppendorf estériles con 200 μL de CTAB (Tris–HCl 100 mM pH 8.0, Na₂EDTA 2H₂O 20 mM, CTAB 3 %, NaCl 1.4 M, β–mercaptoetanol 0.2 %) previamente calentado a 60 °C, se agitó vigorosamente y se adicionaron 600 μL; se incubó 1 h a 60 °C y agitó ocasionalmente. Después se adicionaron 600 μLde cloroformo–alcohol isoamílico (24:1, v/v), se mezcló, y se centrifugó 8 min a 14 000 rpm. La fase acuosa se colocó en un tubo eppendorf nuevo y estéril, se adicionaron 600 μLde isopropanol frío, se mezcló suavemente por inversión e incubó por 1 h a –20 °C para precipitar el ADN. Luego se centrifugó 8 min a 14 000 rpm y se eliminó el sobrenadante. La pastilla obtenida se secó a temperatura ambiente (24 °C) y se disolvió en 50 μLde agua destilada estéril. La integridad del ADN obtenido se verificó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 %.

Se utilizaron los iniciadores universales ITS5 (5'–GGAAGTA AAAGTCGTAACAAGG–3') e ITS4 (5'–TCCTCCGCTTATT–GATATGC–3') para amplificar los genes nucleares ribosomales 18S, 5.8S y 28S que son altamente conservados y se encuentran unidos internamente por las regiones ITS1 e ITS2. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: amortiguador 1X, MgCl₂ 2.5 mM, dNTP's 0.2 mM, Taq ADN polimerasa 1U (Invitrogen) y 20 pmol de cada iniciador. Del ADN obtenido se usaron 100 ng en la PCR. El programa de amplificación consistió de 94 °C por 2 min de desnaturalización inicial, 30 ciclos de 94 °C por 1 min, 55 °C 30, 72 °C por 2 min y 72 °C por 10 min de extensión final. El ADN amplificado se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 % y fue secuenciado en Macrogen (www.macrogen.com). Las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias depositadas en el Banco de Genes (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Debido a que el hongo identificado no es considerado patógeno de S. bonplandiana, a partir del cultivo monospórico obtenido para su identificación, el aislado se incrementó en medio de cultivo PDA para realizar los postulados de Koch (Agrios, 2005).

Diseño experimental y variables evaluadas

El diseño experimental fue de bloques completos al azar con cuatro bloques y seis repeticiones por bloque, y tres tratamientos: T1) lesiones en la epidermis inoculadas con una suspensión de 1X10⁶ conidios del hongo patógeno mL^–1 en ramas de arbustos de S. bonplandiana; T2) lesiones en la epidermis tratadas con agua destilada estéril en ramas de arbustos de S. bonplandiana; y T3) testigo absoluto (plantas sin lesiones y sin inoculación). Las variables fueron número de cancros desarrollados en las lesiones realizadas y tiempo en días para su aparición. La toma de datos se hizo cada tercer día.

Pruebas de patogenicidad

Los arbustos de S. bonplandiana tenían un año de edad, desarrollados de estacas de 1.5 cm de diámetro en bolsas de polietileno (40X20 cm largo–ancho), y se mantuvieron en invernadero libres de plagas y con fertilización. Después de tres meses se interrumpió la dominancia apical para lograr el desarrollo de ramas, en las que se aplicaron los tratamientos. Cuando las ramas de sauce tuvieron 1 cm de diámetro, se seleccionaron dos por planta y con navaja se hicieron cinco lesiones de 1 cm longitud sobre la epidermis de cada rama. Después la navaja se lavó con agua destilada, se sumergió 2 min en hipoclorito de sodio al 2 % y se lavó con agua destilada estéril.

Para aplicar los primeros dos tratamientos se usaron hisopos de algodón estériles. En T1 el hisopo se sumergió en la suspensión de conidios homogeneizada y se frotó sobre la lesión; en T2 el hisopo se sumergió en agua destilada estéril y luego se frotó sobre la lesión. T3 fue el testigo absoluto.

Reaislamiento del patógeno

De la zona de avance del síntoma del sitio inoculado se separaron cinco cortes de 0.5 cm² de tejido, se lavaron con agua destilada y sumergieron en hipoclorito de sodio al 2 % por 2 min; se lavaron dos veces consecutivas con agua destilada estéril y colocaron en papel desecante estéril. Cinco trozos se sembraron en cajas petri con PDA que se colocaron en una incubadora (Rios–sa^®) a 25 °C. Las colonias del hongo desarrolladas en el medio de cultivo nuevamente se transfirieron a medio de cultivo PDA para su purificación e identificación.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Síntomas y daño ocasionado por Alternaria tenuissima

Los síntomas registrados en ramas y ramillas de S. bonplandiana ocasionados por A. tenuissima fueron lesiones en forma de cancros de 1.5 a 2.0 cm de longitud por 1.0 cm de anchura, con abultamientos y tonalidad café oscura en los bordes y centro del mismo color; el daño inició en la epidermis y luego invadió el floema y el cambium vascular hasta llegar al xilema. De estas ramas se retiró la epidermis y quedó expuesto el floema, cambium vascular y xilema dañado y manchado y se tornaron quebradizas (Figura 1). Agrios (2005) menciona que los hongos fitopatógenos producen en sus hospederos diferentes síntomas como cancros, manchas cloróticas y necróticas, cribados, tizones, podredumbres húmedas o secas, momificación, agallas, abolladuras, costras, ahogamientos, marchitamientos y pústulas, entre otros. El daño a la estética en ornamentales es determinante al comercializar el producto pues los síntoma por plagas o enfermedades en las flores y follaje reducen la calidad y en consecuencia su valor económico. No obstante, hay demanda creciente de varas cortadas de esta modalidad por lo que la fitosanidad es determinante para atender la demanda (González et al., 1998). Este tipo de daño en sauce no se ha relacionado con la presencia de A tenuissima; sin embargo Alternaria fue identificada, como causante de manchas foliares en S. bomplandiana es EE.UU. (Alfieri et al., 1984). A. tenuissima ha sido identificada como agente fitopatógeno en EE.UU. en plantas de los géneros Amaranthus sp., Cajanus sp., Cichorium sp., Fragaria sp., Glycine sp., Lycopersicon sp., Nicotiana sp., Passiflora sp., Phaseolus sp., Pittosporum sp., Prunus sp., Santolina sp., Tragopogón sp., Vaccinium sp. y Viola sp. (Farr et al., 1989). Además, causa daños en pimiento (Capsicum annuum var. annuum), fresa (Fragaria spp.), calabaza de culebra (Cucurbita spp.), soya (Glycine max (L.) Merrill), gloria de la mañana, algodón (Gossypium hirsutum L.), chícharo (Lathyrus odaratus L.), gandú (Cajanus cajan (L.) millsp.), melón amargo (Momordica charantia L.), frijol capí (Vigna unguiculata (L.) Walp.), trigo (Triticum aestivum L.), girasol (Helianthus annuus L.), jojoba (Simmondsia chinensis (Link) Schneid), cacahuate (Arachis hypogaea L.), lunaria (Lunaria annua L.), flor terciopelo (Celosia cristata L.), chabacano (Prunus armeniaca L.) y haba (Vicia faba L.), (Rahman et al., 2002); además, en chícharo (Lathyrus odaratus L.), (Nutsugah et al., 1994), cítricos (Castro et al., 1995), Solanum khasianum C.B. Clarke (Boruah et al., 1999), quintonil (Amaranthus hypochondriacus L.), (Blodgett y Swart, 2002), Coccinia indica L., Paris polyphylla (pol–ee–FIL–uh) (Info) y Potentilla fulgens L. (Vijay et al., 2001), tulsi (Bhadauria et al., 2003) y berenjena (Cyphomandra betaceae (Cav.) Sendt), (Raja et al., 2006).

 

Identificación del patógeno

Con base en las características morfológicas descritas a continuación el hongo fue identificado como A. tenuissima (Kunze ex Pers.) Wiltshire (Neergaard, 1945; Ellis, 1971; Simmons, 1990; Simmons, 1999). Se observaron conidióforos solitarios o en grupos, simples o ramificados, rígidos o flexuosos, más o menos cilindricos, septados, pálido o con la mitad pálido marrón, lisos, con una o varias cicatrices de conidios, mayores de 115 μm de longitud, 4 a 6 μm de ancho; conidios solitarios o en cadenas cortas de 3 a 5 conidios rectos o curvos, obtuso clavado o con el cuerpo del conidio elipsoidal ahusado gradualmente hacia el pico casi hasta la mitad del conidio, usualmente corto, algunas veces afilado en la punta pero con frecuencia hinchado en el ápicce en donde puede haber varias cicatrices, pálido con la mitad marrón oro pálido, generalmente liso, algunas veces minuciosamente verrugoso, generalmente con 4 a 7 septos transversales o varios septos longitudinales o levemente oblicuos, o constreñidos en los septos, de 22 a 95 (54) μmde longitud, 8 a 9 μm de ancho y 13.8 μmen su región más amplia, con pico de 2 a 4 μmde grosor, con el apéndice hinchado y 4 a 5 μm de ancho. Las características morfológicas señaladas distinguen a esta especie de las 44 especies reconocidas del género Alternaria (Ellis, 1971). De acuerdo con Roten (1994), esta especie corresponde al grupo Brevicatenatae por tener cadenas cortas de 3–5 conidios con cuellos cortos. La identificación taxonómica de A. tenuissima fue confirmada con 99 % de homología de la secuencia del DNAr–ITS, con número de acceso bankit 1419070 HQ711617, y al compararla con la secuencia de A. tenuissima en el GenBank–NCBI (número de acceso DQ323698).

Desarrollo de Alternaria tenuissima en medios de cultivo

Los cinco medios de cultivos usados en el estudio propiciaron tiempos diferentes de esporulación. En PDA y HC la esporulación se observó 24 h después de incubadas las siembras a 25 °C; en ET se observó a los 24 d después. Singh et al. (2000) reportan esporulación en PDA, albumen más citrato de sodio y albumen más agua destilada, después de 18 h a 25 ± 2 °C. Según Rahman et al. (2003), hay una gran cantidad de conidios en PDA con 6 d de cultivo y las primeras esporas después de 3 a 36 h en los medios de cultivo con extracto del hospedero. En contraste, en el presente estudio en el medio de cultivo con extracto de tallo de S. bonplandiaa, el desarrollo de conidios se observó hasta 24 h después. Rahman et al. (2003) también observaron que en cultivo Czapek's las primeras esporas se formaron después de 40 h. Sin embargo, en las condiciones y durante el tiempo que duró el presente estudio, en el medio Czapek's sólo se observó el crecimiento de micelio; en EM las primeras esporas se observaron a las 24 h. Andersen et al. (2002) utilizaron este medio para estudios químicos y morfológicos de varias especies de Alternaria, entre ellas A. tenuissima, y los conidios fueros usados para el estudios después de 7 d de incubación a 25 °C, con ciclos alternos de luz fría (8 h) y oscuridad (16 h).

Patogenicidad de A. tenuissima

En las lesiones de ramas de S. bonplandiana en las que se aplicó la suspensión de conidios los daños se mostraron 11 d después de la inoculación. Rotem (1994) indica que varias especies patogénicas de Alternaria pueden penetrar la cutícula y epidermis directamente, pero otras entran a través de estomas o heridas. Similarmente Skiles (1953) menciona que las heridas son necesarias para que se produzca la infección por A. alternata y A. tenuissima en hojas de cebolla. Asimismo, Shortt et al. (1982) señalan que la infección de A. tenuissima en vainas de soya está asociada a los daños por alimentación del escarabajo Cerotoma trifurcata Forster. En contraste, Blodgett y Swart (2002) indican que A. tenuissima infecta y coloniza las hojas de Amaranthus hybridus L. penetrando por los estomas sin requerir de heridas para ello. Los resultados derivados de la presente investigación concuerdan con los reportados por Rotem (1994), Skiles (1953) y Shortt et al. (1982), ya que sólo en las ramas donde se realizaron heridas se observó el desarrollo de síntomas, como la cancrosis, producidos por la infección y colonización de A. tenuissima en las ramas. Según Thomma (2003), A. tenuissima produce toxinas especificas en sus hospederos que puede ser la razón de la formación del cancro en sauce. Los síntomas desarrollados en las heridas inoculadas con agua destilada estéril pudo deberse a que A. tenuissima es un hongo endofítico extremadamente común en el ambiente, cuyos conidios pueden permanecer latentes sobre el hospedero hasta que las condiciones sean propicias para infectar (Blodgett y Swart, 2002). En las ramas correspondientes a T3 no se observaron síntomas de la enfermedad durante el periodo de estudio. Los síntomas de la cancrosis en las lesiones inoculadas con la suspensión de conidios ocurrió después de 11 d de la inoculación (DDI) y se manifestó en 48.3 % de las heridas. En contraste sólo 8.3 % de lesiones inoculadas con agua destilada estéril presentaron síntomas (Figura 2). Sin embargo, Rahman et al. (2003) observaron desarrollo de lesiones 72 h después de inocular la suspensión de esporas germinadas de A. tenuissima sobre hojas de haba. En T1 (lesiones inoculadas con el hongo) el desarrollo de síntomas sucedió 29, 31 y 33 DDI, en 94.2, 95.8 y 97.5 % de las heridas inoculadas, mientras que en T2 (lesiones tratadas con agua estéril) las heridas con desarrollo de síntomas fue 72.5, 80 y 81.7 % (Figura 2).

En todas las fechas de muestreo hubo diferencias significativas en el número de lesiones que desarrollaron los síntomas de cancrosis por A. tenuissima (Cuadro 1). En los muéstreos 11,13 y 15 DDI las diferencias entre T2 y T3 no fueron significativas (p > 0.05) pero silo fueron (p≤0.05) respecto alas más altas (en Tl). La misma tendencia se mantuvo durante las otras fechas de muestreo (Cuadro 1).

 

CONCLUSIONES

Los postulados de Koch permitieron mostrar los mismos síntomas en lesiones de ramas inoculadas con una solución de 1X10⁶ conidios mL^–1 del hongo Alternaria tenuissima. Entonces hay evidencias suficientes para proponer que la cancrosis en ramas de Salix bonplandina es causada por este hongo. El presente estudio es el primer reporte que describe los síntomas y patogenicidad de Alternaria tenuissima sobre Salix bonplandiana.

 

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