Fitociencia

 

Herencia de capsaicinoides en chile manzano (Capsicum pubescens R. y P.)

 

Inheritance of capsaicinoids in manzano hot chili pepper (Capsicum pubescens R. and P.)

 

Hermilo Sánchez–Sánchez¹, Víctor A. González–Hernández¹*, Ana B. Cruz–Pérez¹, Mario Pérez–Grajales², María A. Gutiérrez–Espinosa¹, Alfonso A. Gardea–Béjar³, Miguel Á. Gómez–Lim⁴

 

¹ Campus Montecillo, Colegio de Postgraduados. Km 36.5 Carretera México–Texcoco. 56230. Montecillo, Estado de México. *Autor responsable: (vagh@colpos.mx).

² Universidad Autónoma Chapingo. Km 38.5 Carretera México–Texcoco. 56230. Chapingo, Estado de México.

³ Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C. Km 0.6 Carretera a la Victoria. 83000. Hermosillo, Sonora, México. (gardea@ciad.mx).

⁴ Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Irapuato. Km 9.6 libramiento norte carretera Irapuato–León. 36500. Irapuato, Guanajuato. México. (mgomez@ciea.ira.cinvestav.mx).

 

Recibido: Septiembre, 2009.
Aprobado: Mayo, 2010.

 

RESUMEN

Los capsaicinoides son alcaloides importantes en la salud humana, alimentaria y farmaceútica, y sólo son producidos por plantas del género Capsicum. En este estudio se analizó la herencia del contenido de los tres principales capsaicinoides causantes del picor (nordihidro–, dihidro– y capsaicina), en 25 materiales genéticos de chile manzano (Capsicum pubescens R. y P.), que incluyen a cinco poblaciones (Huatusco, Zongolica, Tacámbaro, Puebla y Perú) más sus 20 cruzas interpoblacionales posibles en F1. El análisis dialélico con el Método I de Griffing permitió determinar los efectos de aptitud combinatoria general y específica (ACG y ACE), así como los efectos maternos (EM). Se usó un diseño completamente al azar con tres repeticiones. Sólo en la nordihidrocapsaicina hubo efectos significativos de la ACG, mientras que la ACE fue significativa para los tres capsaicinoides evaluados. Las cruzas Puebla×Tacámbaro, Tacámbaro×Perú, y Huatusco×Zongolica destacaron por tener alta ACE y los frutos más picosos. Se detectaron EM positivos en el picor, los cuales representan 45% de la variación en los materiales genéticos en capsaicinoides totales. Las poblaciones Zongolica y Perú poseen EM en los tres alcaloides, mientras que Puebla sólo los tiene en dihidro– y capsaicina. En contraste, en los progenitores Tacámbaro y Huatusco predominan los EM negativos. El análisis de los resultados permite concluir que el picor en frutos de los materiales de chile manzano aquí estudiados, está regulado principalmente por genes de efectos dominantes más que por genes de efecto aditivo, y que también está influenciado significativamente por genes extranucleares, lo cual no se había reportado con anterioridad.

Palabras clave: Capsicum pubescens, capsaicinoides, efectos maternos.

 

ABSTRACT

Capsaicinoids are alkaloids that are important for human health, as food and pharmaceuticals, and are produced only by plants of the genus Capsicum. This study analyzes the inheritance of the content of the three main capsaicinoids that cause the burning sensation (pungency) (nordihydro–, dihydro– and capsaicin) in 25 genetic materials of manzano hot pepper (Capsicum pubescens R. and P.), that include five populations (Huatusco, Zongolica, Tacámbaro, Puebla and Perú) plus their 20 possible inter–population F1 crosses. The diallel analysis with the Griffing Method I permitted us to determine the effects of general and specific combining ability effects (GCA and SCA) as well as maternal effects (ME). A completely randomized design was used with three replications. Only in nordihydrocapsaicin there were significant effects of GCA, while SCA was significant for the three capsaicinoids evaluated. The crosses Puebla×Tacámbaro, Tacámbaro×Perú, and Huatusco×Zongolica were outstanding for their high SCA and for having the most pungent fruits. Positive ME on pungency was detected, accounting for 45% of the variation in total capsaicinoids due to the genetic materials. The Zongolica and Perú populations possess ME in the three alkaloids, while the Puebla population has ME only in dihydrocapsaicin and capsaicin. In contrast, in the progenitors Tacámbaro and Huatusco negative ME are predominant. The analysis of the results suggests that fruit pungency of the manzano chili materials used in this study is regulated mainly by dominant genes, more than by additive effect genes, and that extra–nuclear genes also have a significant influence, a result that had not been previously reported.

Key words: Capsicum pubescens, capsaicinoids, maternal effects.

 

INTRODUCCIÓN

El chile (Capsicum spp.) produce un grupo único de alcaloides llamados capsaicinoides que le confieren picor al fruto (Kobata et al., 1998). Los capsaicinoides tienen relevancia en la salud humana (Antonious y Jarret, 2006) y se usan en productos farmacológicos, cosméticos y alimenticios (Rosa et al., 2002). El picor se debe a siete alcaloides de los cuales la dihidro– y capsaicina son responsables del 90% (Govindarajan y Sathyanarayana, 1991; Vázquez–Flota et al., 2007). Los capsaicinoides se sintetizan y acumulan en la placenta de los frutos de Capsicum (Fujiwake et al., 1982; Cruz–Pérez et al., 2007), específicamente en la vacuola celular (Blum et al., 2003).

La cantidad de capsaicinoides acumulados en la placenta depende del ambiente, los genes y su interacción (Zewdie y Bosland, 2000). El locus C simple, ahora denominado pun 1, es un gen recesivo que codifica a una supuesta aciltransferasa, que está ubicado en el cromosoma 2 y es esencial para el control de la producción de capsaicinoides; el alelo picoso es dominante sobre el no picoso, pun 1 (Blum et al., 2002; Lefebvre et al., 2002; Stewart et al., 2005). Además Blum et al. (2003) reportan que el QTL cap ubicado en el cromosoma 7 explica 34 a 36% de la variación total de capsaicinoides y está asociado con efectos ambientales. Otros QTL detectados en los cromosomas 2, 3 y 4 se han relacionado con la variación de capsaicinoides en frutos de Capsicum (Ben–Chaim et al., 2006). Algunos de estos genes podrían estar asociados con la producción de capsaicinoides (Blum et al., 2003). En la síntesis de capsaicinoides también se ha reportado al gen AT3, perteneciente a la súper familia BADH de las aciltransferasas (Stewart et al., 2005); y al gen recesivo pun 1², el cual junto con el dominante Pun 1 controla la formación de las vesículas de la placenta donde se acumulan los capsaicinoides en la placenta en C. chínense, ya que la ausencia de vesículas resulta en carencia total de picor (Stewart et al., 2007).

En el citoplasma ocurre la biosíntesis de capsaicinoides mediante el metabolismo de ácidos grasos y la ruta del fenilpropanoide (Ochoa–Alejo y Gómez–Peralta, 1993). En ambas rutas actúan numerosas enzimas de las cuales se conoce poco respecto a su efecto en la variación fenotípica. Aluru et al. (2003) reportan tres genes, Acl, Fat y Kas, que codifican enzimas en la ruta sintética de los ácidos grasos necesarios para el desarrollo de la placenta, de los cuales sólo el alelo dominante KAS está correlacionado positivamente con el picor. Curry et al. (1999) aislaron genes que codifican para la aminotransferasa 3–ceto–acil–ACP–sintasa. Kim et al. (2001) aislaron 39 cADN de la placenta de frutos de chile e identificaron genes que codifican a las enzimas capsaicinoide sintetasa SB2–66, aminotransferasa SB2–149, y 3–ceto–acil–ACP sintasa SB1–58.

Los métodos de Griffing (1956) para análisis dialélicos se usan para selección en plantas (Zhan y Kang, 1997) porque generan información sobre el comportamiento de las cruzas y sus progenitores, así como sobre la acción génica (dominancia o aditividad), heterosis o depresión endogámica (Murray et al., 2003). Con los diseños I y II se puede evaluar la magnitud de efectos de herencia materna (Sentz, 1971). La ACG explica la varianza genotípica debida a los efectos genéticos aditivos, y la ACE la varianza genotípica de dominancia (Gutiérrez et al., 2002).

En chile manzano (C. pubescens R. y P.) se encontró heterosis para el contenido de capsaicinoides al evaluar cruzas directas de cuatro poblaciones criollas (Huatusco, Zongolica, Puebla y Chiapas). Los contenidos fueron bajos (4000 a 6000 SHU) en fruto completo (Pérez et al., 2004), aunque en otro estudio la población Huatusco tuvo más de 10 000 SHU (Cruz–Pérez et al., 2007). El objetivo de esta investigación fue estimar, con el diseño dialélico tipo I de Griffing (1956), la herencia del picor mediante el análisis de híbridos de chile manzano generados con cuatro poblaciones mexicanas (Huatusco, Zongolica, Puebla y Tacámbaro) y una peruana. La hipótesis fue que la herencia de los capsaicinoides puede tener efectos maternos debidos a genes extranucleares.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Producción de híbridos simples en invernadero

Se sembraron 20 semillas de las variedades Puebla, Huatusco, Zongolica, Perú y Tacámbaro en charolas con sustrato Growing Mix® No. 2. Cuando las plántulas tenían cuatro hojas (30 d de edad), se trasplantaron a vasos de unicel (240 mL) donde se mantuvieron hasta tener 12 hojas (90 d de edad). Se trasplantaron a bolsas de polietileno negro (40 cm ancho; 45 cm alto); cada bolsa contenía 50% de tezontle grueso en la parte inferior, 25% Growing Mix y 25% de tezontle fino en la parte superior. De 15 plantas de chile manzano, cinco se usaron para producción de semilla de los progenitores mediante autofecundación porque esta especie es considerada autógama; otras cinco plantas se usaron como progenitores femeninos para producir la semilla de los híbridos de cruza directa; y otras cinco como progenitores masculinos para las cruzas recíprocas. Todos los cruzamientos se hicieron planta a planta, sin mezcla de polen. La unidad experimental fue una planta.

Para hacer los cruzamientos entre progenitores, los botones florales de las plantas hembras se emascularon y se cubrieron con bolsas de papel "glassine" para evitar cruzamientos no deseados. La polinización controlada se inició 90 d después del trasplante (ddt) en los primeros botones del tercer nudo. La polinización se efectuó en cinco flores por planta por semana, durante un mes, con polen de dos plantas macho. Después de cada polinización, las flores se cubrieron con bolsas de papel "glassine", las cuales se retiraron cuando el fruto había cuajado (2 mm diámetro). En cada caso se dejó una etiqueta de identificación y la fecha de la cruza.

Se obtuvieron 20 cruzas dialélicas, 10 directas y 10 recíprocas. De estas cruzas F1 y de los cinco progenitores se trasplantaron 15 plantas por cada material genético, de las cuales se utilizaron cinco plantas para el análisis de capsaicinoides (nordihidro–, dihidro– y capsaicina) en frutos.

Extracción y cuantificación de capsaicinoides

De cinco plantas de cada material genético se recolectaron 10 frutos de 76 ± 5 d de desarrollo, seleccionados al azar en forma masiva entre los frutos marcados. Cada muestra se etiquetó y congeló en N líquido y se almacenó a —20 °C hasta su análisis químico.

La determinación de los tres principales capsaicinoides (dihidro–, nordihidro– y capsaicina) se hizo en 1 g de materia seca tomada al azar de la biomasa resultante de los 10 frutos completos muestreados, que se procesó para obtener los extractos de capsaicinoides conforme a la metodología de Collins et al. (1995), mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en un cromatógrafo Agilent^® mod. HP–1100 equipado con un detector de UV y una columna Hypersil ODS^® (25 cm×4.6 mm, 5 μm). El eluyente fue una mezcla de acetonitrilo y agua (40:60), flujo de 1.0 mL min^–1 y el tiempo de corrida por muestra fue 30 min. La concentración de cada capsaicinoide en unidades de picor Scoville (SHU, Scoville heat units) se calculó con las ecuaciones del método oficial de la AOAC (1998):

N = (Pn / Ps) × (Cs / Wt)×(10 / 0.98) ×9300

D = (Pd / Ps) ×(Cs / Wt)×(10 / 0.93) ×16 100

C = (Pc / Ps) ×(Cs / Wt)×(10 / 0.89) ×16 100

donde, N = nordihidro–; D = dihidro–; C = capsaicina; Pn, Pc, y Pd = área del pico para nordihidro–, dihidro– y capsaicina; Ps = área del pico del estándar correspondiente; Cs = concentración de la solución estándar (mg mL^–1); Wt = peso de la muestra (g). Los capsaicinoides totales se calcularon como la suma de cada compuesto (N + C + D). En la conversión de unidades se consideró que 1 μg capsaicinoides g^–1 = 15 SHU.

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico se usó el diseño dialélico de Griffing (1956) método I, en un diseño experimental completamente al azar con tres repeticiones. Se estimaron los efectos de aptitud combinatoria general (ACG) de cada progenitor y la aptitud combinatoria específica (ACE) de cada cruza, así como el efecto materno de los progenitores. El modelo fue el siguiente:

Y_ijk = m + g_i + g_j+ s_ij+ (M_i – M_j) + r_ij + e_ijk

donde, Y_ijk= cada una de las observaciones del modelo; μ = media general de todas las observaciones; g_i = aptitud combinatoria general de la línea i; g_j = aptitud combinatoria general de la línea j; s_ij= aptitud combinatoria específica (i, j); (M_i – M_j) = efecto materno directo de la cruza; r_ij = efecto materno recíproco de la cruza (i, j); e_ijk= efecto ambiental aleatorio de cada observación. Además se consideró que la suma de efectos maternos directos y recíprocos [(M_i – M_j) + r_ij] corresponde a los efectos maternos totales. Se usó el programa reportado por Zhan y Kang (1997) para el análisis estadístico con SAS (SAS Institute, 2000).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Análisis dialélico

Se detectaron diferencias (p<0.10) entre los materiales genéticos (conjunto de poblaciones progenitoras y sus 20 cruzas) en los contenidos de cada capsaicinoide evaluado, así como en la suma o el total (Cuadro 1). Los efectos de ACE fueron significativos (p<0.05) para los tres alcaloides, mientras que la ACG sólo fue significativa para nordihidro–capsaicina. Es decir, la variación observada entre los materiales estudiados estuvo más asociada con efectos de dominancia relacionados con heterosis, que con efectos aditivos.

Zewdie y Bosland (2000) también reportan heterosis positiva en la producción de capsaicinoides, así como diferencias varietales en ACG. Un aspecto sobresaliente del análisis dialélico aquí realizado es que en los tres alcaloides hubo efectos maternos significativos (p<0.05). Esto implica que los genes que codifican este conjunto de productos naturales están ubicados en el ADN nuclear y también en el ADN extranuclear, ya sea en cloroplastos o en mitocondrias.

Efectos de aptitud combinatoria general (ACG) en progenitores

El hecho que la ACG sólo haya sido significativa (p<0.01) para nordihidrocapsaicina (Cuadros 1 y 2), indica que los otros capsaicinoides estarían influenciados mayormente por genes dominantes y epistáticos. Al respecto, Cruz–Pérez et al. (2007) reportan mayor cantidad de capsaicinoides en híbridos que en progenitores. Aquí se encontró que las poblaciones progenitoras Tacámbaro y Zongolica presentaron los valores positivos más altos de ACG, por lo que son las más adecuadas para conferir mayor picor del fruto al considerar los tres alcaloides; el progenitor Huatusco también confiere picor vía dihidrocapsaicina (Cuadro 2).

Efectos de aptitud combinatoria específica (ACE)

En cuanto a la ACE para capsaicinoides totales, las cruzas Pue×Tac, Tac×Per, Hua×Zon y Hua×Per destacaron por sus valores positivos (p<0.01) y por formar los frutos más picosos, como se mostrará adelante. En cambio, las cruzas menos picosas, Tac×Hua y Per×Zon, presentaron valores negativos de ACE, aunque Pue×Hua, Pue×Zon y Tac×Zon también dieron ACE negativas. Estas cruzas podrían usarse como variedades para consumo en fresco, por ser menos picantes. La ACE en capsaicinoides totales se debió principalmente a dihidro– y capsaicina en las cruzas Tac×Per y Hua×Zon, mientras que en la cruza Tac×Per se debió fundamentalmente a la nordihidrocapsaicina (Cuadro 3).

Efectos maternos

Todos los progenitores mostraron efectos maternos (EM) significativos en contenido de capsaicinodes, excepto para nordihidrocapsaicina (Cuadro 4). Los progenitores Zongolica, Puebla y Perú tuvieron EM positivos (p<0.01) para el picor total y en los dos alcaloides predominantes, lo que indica que estos progenitores darían lugar a híbridos más picosos cuando se usen como progenitores femeninos. En contraste, en los progenitores Tacámbaro y Huatusco predominan los EM negativos. El hecho de que el progenitor Zongolica mostrara la mayor magnitud de EM positivos explicaría que dos de sus cruzas, donde fungió como hembra, presentaran altos contenidos de capsaicinoides totales.

Se infiere entonces que las poblaciones progenitoras Zongolica, Perú y Puebla son las que confieren mayores efectos genéticos extranucleares para alto picor en chile manzano. Pero en la población Tacámbaro, cuyos EM fueron negativos en los tres alcaloides, deben predominar los genes extranucleares con efectos de bajo picor. Por tanto, la producción de capsaicinoides está regulada por genes nucleares, y además influenciada por genes extranucleares.

La síntesis de capsaicinoides tiene lugar en el citosol y culmina en una fracción de la vacuola (Sokrasno y Yeoman, 1993). Hay otros genes del picor (Kas, Acl y Fat) no relacionados con el locus C dominante (Blum et al., 2002), que son necesarios para el desarrollo de la placenta en frutos de Capsicum y para la producción de capsaicinoides (Aluru et al., 2003). Así, además de los efectos ambientales reportados por Zewdie y Bosland (2000), en la célula hay interacción de los genes extranucleares para la producción de capsaicinoides en chile manzano, y estos efectos representan 45% de la suma de cuadrados total debida a materiales genéticos (Cuadro 1).

Contenido de capsaicinoides

Los contenidos de capsaicinoides totales en el fruto de chile manzano fluctuaron ampliamente entre genotipos, de 4032 a 36 712 SHU. El picor de los cinco progenitores aquí evaluados mostró el siguiente orden: Zongolica>Huatusco>Perú>Tacámbaro>Puebla. Zongolica superó a los demás progenitores en 26.7, 28.2, 38.8 y 82.9%, y el progenitor Puebla mostró el menor picor (Cuadro 5).

Entre los híbridos destacó Zongolica×Huatusco por su alto picor, tuvo como progenitor femenino al más picoso, superó en 35.7% al progenitor Zongolica (el más picoso) y además mostró los efectos más altos de ACG y de EM para picor. Esta cruza fue la segunda más alta en ACE, después de Puebla×Tacámbaro; esta última fue la segunda más picosa, atribuible a su alta ACE, pues aunque de mínimo picor Puebla posee efectos maternos positivos.

El picor total del fruto de chile manzano se debió a la nordihidro– (5–10%), dihidro– (50–60%) y a la capsaicina (30–40%). Los porcentajes de los tres alcaloides estimados están directamente relacionados con su grado de picor, ya que según Govindarajan y Sathyanarayana (1991) la capsaicina y dihidro– explican 90% del picor de frutos de chile manzano.

 

CONCLUSIONES

El picor de los frutos de chile manzano estudiados presentó variación en efectos aditivos de los genes (ACG) y en efectos genéticos de dominancia (ACE), así como en efectos maternos (EM) ubicados en genes extranucleares. Los EM representaron 45% de la suma de cuadrados total para capsacinoides, y ésta es la primera vez que se reportan efectos maternos en la herencia de estos compuestos en Capsicum pubescens (R. y P.). Los EM positivos en capsaicinoides ocurrieron en los progenitores Zongolica, Puebla y Perú, mientras que en Tacámbaro y Huatusco fueron negativos. Zongolica fue también el progenitor con más picor entre los cinco evaluados, y una de sus cruzas (Zongolica×Huatusco) produjo 35.7% más capsaicinoides que su progenitor femenino (Zongolica), lo cual se asocia con sus altos valores de ACG y ACE.

 

LITERATURA CITADA

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