Biotecnología

 

Recombinación homóloga en un paso en el cromosoma de Bacillus thuringiensis

 

Homologous recombination to Bacillus thuringiensis chromosome in one step

 

Estibaliz Sansinenea–Royano^1,*, Patricia Sánchez–Alonso¹, E. Anastacio Marcelino¹, Jorge Ibarra–Rendón², Gabriela Olmedo–Álvarez² y Candelario Vázquez–Cruz¹

 

¹ Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas del Instituto de Ciencias de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 72570, Puebla, Puebla, México. *Autor responsable: (estisan@siu.buap.mx), E–mail: (canvazq@siu.buap.mx).

² Centro de Investigación y Estudios Avanzados, Campus Irapuato, Irapuato 36000, Guanajuato, México.

 

Recibido: abril, 2009.
Aprobado: octubre, 2009.

 

RESUMEN

Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo gram–positiva utilizada como un bioinsecticida limpio para el ambiente. Aunque se conoce acerca de sus proteínas entomocidas, poco se ha estudiado su genética funcional debido a que la transformación celular es muy díficil. Por tanto, el desarrollo de la recombinación homóloga como herramienta de investigación ayudará a ampliar el conocimiento de su genética, pudiéndose incluso modificarse cepas para el control de plagas. En este trabajo se describe una secuencia cromosomal que funcionalmente sirve como sustrato para la recombinación molecular homóloga en el cromosoma bacteriano de B. thuringiensis var. israelensis IPS82. Se secuenció (Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad del Centro de Investigacion y Estudios Avanzados de Irapuato; Octubre 2007) un fragmento de 1500 pb del locus ihrI y la secuencia se depositó en GenBank (número de acceso GQ476797). Su análisis nucleotídico indica que esta región del genoma de B. thuringiensis var. israelensis IPS82 es muy similar pero no igual a otras secuencias de Bt. Esta secuencia está relativamente conservada en varias cepas de B. thuringiensis, B. cereus y B. anthracis según el análisis informático y experimental.

Palabras clave: bacteria del suelo, integración cromosomal, recombinación homóloga.

 

ABSTRACT

Bacillus thuringiensis is a gram–positive soil bacterium used as a clean bioinsecticide for the environment. Although its entomocide proteins are known, little has been studied of its functional genetic, due to the fact that the cell transformation is very difficult. Therefore, the development of homologous recombination as a research tool will help to broaden the knowledge of its genetics, even making it possible to modify strains for pest control. In this paper a chromosomal sequence is described, which functionally serves as a substrate for the homologous molecular recombination in the bacterial chromosome of B. thuringiensis var. israelensis IPS82. A fragment of 1500 pb of the locus ihrI was sequenced (Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad del Centro de Investigación y Estudios Avanzados of Irapuato; October, 2007), and the sequence was deposited in GenBank (Access number GQ476797). Its nucleotide analysis indicates that this region of the genome of B. thuringiensis var. israelensis IPS82 is very similar but not equal to other sequences of Bt. This sequence is relatively conserved in various strains of B. thuringiensis, B. cereus and B. anthracis according to the computer and experimental analysis.

Key words: soil bacterium, chromosomal integration, homologous recombination.

 

INTRODUCCIÓN

Bacillus thuringiensis es una bacteria de suelo gram–positiva que produce gran cantidad de proteínas entomocidas que se acumulan en el citoplasma para formar inclusiones cristalinas. Las inclusiones proteicas de B. thuringiensis son tóxicas a diversos insectos vectores de enfermedades tropicales (Goldberg y Margalit, 1977; Höfte y Whiteley, 1989) y plagas de cultivos. Debido a su actividad insecticida, se han usado formulaciones con esporas y cristales para el control de plagas. Esta propiedad ha convertido a este microorganismo en una importante herramienta en la biotecnología de la salud.

La integración cromosomal del ADN plasmídico se ha usado en B. subtilis para transformación de fenotipo, regulación de expresión genética o mantenimiento estable de genes. Por ejemplo, Calogero et al. (1989) usaron un vector de integración para expresar un gen de una inclusión de proteína cristalífera de B. thuringiensis en B. subtilis. Sin embargo, la manipulación genética de las cepas de Bt, esencial para su desarrollo como biopesticida, es experimentalmente difícil. Una limitante importante es que las bacterias de la especie B. thuringiensis son recalcitrantes a la transformación, incluso por el método efectivo de electroporación (Bone y Ellar, 1989; Mahillon et al., 1989; Lereclus et al., 1989). Las eficiencias de transformación reportadas para Bt son del orden de 10¹ a 10⁴ transformantes μg^–1, y para algunas cepas la transformación se ha reportado como imposible.

En contraste con el modelo de B. subtilis, donde la recombinación homóloga es fácil y factible (Niaudet et al., 1984; Vázquez et al., 1996), la transformación en Bt es un gran problema y la recombinación molecular mucho más. Sólo se han obtenido las transformantes de Bt o cepas recombinantes utilizando mutagénesis (Delécluse et al., 1991), secuencias de inserción (Lereclus et al., 1992), y con plásmidos cuya replicación es termosensible (Lereclus et al., 1995; Fedhila et al., 2002).

El presente trabajo forma parte de la construcción de un modelo de estudio de recombinación genética, donde se describe la caracterización de una secuencia cromosomal, como un buen prospecto de ADN sustrato para la recombinación homóloga en Bt. Esto podría contribuir a mejorar cepas de Bt para el control de plagas.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Clonación de regiones recombinantes

Se usó la cepa DH5α–F' de E. coli (Invitrogen) para la clonación y la propagación de las nuevas construcciones plasmídicas. Esta bacteria creció en el medio Luria–Bertani (LB) a 37 °C. Los plásmidos fueron aislados de E. coli por el método de extracción alcalina (Birnboim y Doly, 1979). Los procedimientos estándar de ADN recombinante se realizaron según Sambrook et al. (1989). Para explorar la recombinación homóloga fue necesario utilizar un plásmido no–replicativo el cual debe contener fragmentos de ADN cromosomal de Bti para lograr la recombinación molecular. El plásmido suicida pES de 4.6 Kb (Figura 1) se construyó eliminando 2.1 Kb de todo el ori–Bth de 2.9 Kb de pHT3101 (Lereclus et al., 1989) con la enzima de restricción EcoRV. Los derivados recombinantes de E. coli crecieron en medio LB que contenía 100 mg μL^–1 de ampicilina.

La cepa IPS82 de B. thuringiensis var. israelensis creció en medio LB a 28 ºC y las extracciones de ADN genómico de Bt se realizaron con una modificación del método Dubnau y Davidoff–Abelson (1971). El ADN obtenido fue suficientemente puro para electroforesis y digestión por enzimas de restricción. Se usó la enzima EcoRI para digerir el ADN genómico y los fragmentos obtenidos se ligaron mediante la enzima T4 ligasa en el plásmido suicida pES. La mezcla de ligación se usó para transformar E. coli. Asi se obtuvieron diferentes transformantes en E. coli con insertos que variaban en tamaño.

Selección de recombinantes

El plásmido pHT3101, conteniendo una región de replicación del plásmido pHT1030 de B. thuringiensis (Lereclus et al., 1989) y sus derivados, se usaron para transformar Bti por el procedimiento de electroporación y evaluar la eficiencia del proceso. Para ello se inocularon 20 mL de BHI (infusión de cerebro–corazón) (Difco) con 100 μL de esporas (5×10⁷–10⁸ mL^–1) y se incubaron con agitación a 200 rpm a 28 °C para alcanzar OD_600nm=0.30–0.40. Las células se recuperaron por centrifugación durante 5 min a 4000 rpm y a 4 °C; se lavaron dos veces con 20 mL de agua destilada estéril a 4 ºC y una vez con 10 mL de una solución estéril de glicerol al 10 %. Finalmente, se resuspendieron en 400 μLde glicerol al 10 %. Esta suspensión celular se usó inmediatamente después de su preparación. La electroporación se realizó con un Gene Pulser II (Bio–Rad*) acoplado a un selector de resistencia paralelo (controlador de pulso Bio–Rad*). Para la electroporación se mezclaron 200 μL de células de Bti a 4 ºC con ADN plasmídico y se transfirieron a cubetas de plástico de electroporación (0.2 cm ancho). Se aplicaron 1400 V, 25 μF y 400 Ohms, en un pulso. Después de la electroporación las células se recuperaron con 1 mL de BHI y se incubaron 3 h a 28 ºC con agitación suave. Alícuotas de 200 μL de estas células se colocaron en placas con LB más eritromicina (2μg mL^–1). Las transformantes de Bt formaron colonias después de una noche (12 h) de incubación a 28 ºC. Las transformantes resistentes a eritromicina se seleccionaron y se midió la eficiencia de transformación.

Caracterización de recombinantes

Para corroborar la recombinación homóloga, el ADN total de las transformantes de Bt fue extraído y digerido con enzimas de restricción como BamHI, KpnI, EcoRI y HindIII. Los fragmentos de ADN se separaron en un gel de agarosa al 0.8 % por electroforesis, se transfirieron a una membrana de nylon; éstas fueron hibridadas con una sonda marcada con ³²P y se obtuvo la autoradiografía usando películas de rayos X de Kodak^®, según Sambrook et al. (1989).

Se evaluaron algunos efectos secundarios en las recombinantes. Se midió el porcentaje de esporulación creciendo las recombinantes y la cepa silvestre en un medio Tris–G para inducir la esporulación a 28 °C por 3 d. Las esporas fueron contadas como unidades formadoras de colonia (ufc) realizando diluciones y sembrándolas en placas de LB. También se comprobó el efecto de la integración sobre la producción de proteínas realizando geles SDS–PAGE (electroforesis desnaturalizante con dodecil sulfato de sodio en gel de poliacrilamida) de proteínas cristalíferas (Thomas y Ellar, 1983).

Caracterización del fragmento que promueve la recombinación

El fragmento de ADN que promueve la recombinación se mapeó usando diferentes enzimas de restricción, de acuerdo con las instrucciones de cada proveedor. Luego se eliminó un fragmento de 2.8 Kb de pES8 (clona con un inserto de 10 Kb), localizado en el extremo próximo al sitio de clonación múltiple del plásmido vector, con la enzima KpnI para obtener la región mínima necesaria para la recombinación homóloga. Con esta nueva clona denominada pES8ΔKpnI se transformó la cepa IPS82 de Bti como ya se describió, introduciendo pHT3101 como testigo positivo, pES como testigo negativo y pES8. La eficiencia de transformación fue similar a la obtenida con la clona pES8. Para corroborar la recombinación homóloga de estas nuevas transformantes se hizo un Southern blot usando un marcador de ADN (1 Kb plus, Invitrogen).

Para analizar la presencia de este locus ihr en diferentes cepas, se extrajo el ADN total de la cepa silvestre de B. thuringiensis var. israelensis y de la recombinante, se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se separó con un gel de agarosa por electroforesis, se transfirió a una membrana de nylon y se hibridizó con el plásmido pES8 (tamaño ≈15 Kb) en un análisis Southern blot. Después se efectuaron pruebas de transformación de algunas cepas de Bt con pES8. Finalmente, se detectó la presencia de un fragmento interno de 1500 pb del locus ihr en cepas de Bt por PCR. Este fragmento se secuenció en el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad del Centro de Investigación y Estudios Avanzados de Irapuato, la secuencia se analizó con BLAST (herramienta de búsqueda de alineamientos básicos locales) y se comparó usando secuencias provenientes de los genomas con números de acceso AE016877, AE017355, AE016879, CP000485 y CP000903.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Transformación de Bacillus thuringiensis y recombinación homóloga

La transformación en Bt es un proceso difícil a pesar de métodos efectivos como la electroporación que ha permitido introducir plásmidos recombinantes en Bt (Wang et al., 2008). Sin embargo muchos plásmidos introducidos muestran inestabilidad segregacional, por lo que la recombinación homóloga representa una revolucionaria técnica de ingeniería del ADN para el mejoramiento de cepas de manera estable.

Sin embargo la dificultad de transformar Bt ha causado que esta técnica haya sido poco estudiada en Bt (Xia et al., 2009) e incluso la integración de nuevos genes al cromosoma de Bt (Thamthiankul et al., 2004) se realiza por el método de Lereclus et al. (1992). Por ello la recombinación homóloga en vivo en un solo paso es una propuesta prometedora para introducir nuevos genes en el ADN cromosomal de B. thuringiensis de forma estable, y la cepa IPS82 es el organismo seleccionado para desarrollar un modelo molecular. Esto abre la posibilidad de modificar cepas de Bt de suelo para su mejoramiento en el tratamiento de plagas de cultivos.

Para ello varias secuencias genómicas de Bti fueron clonadas en pES para obtener clonas con insertos de tamaño que variaban entre 4 y 10 Kb. Algunas de estas clonas fueron transformadas en B. thuringiensis var. israelensis por electroporación, incluyendo pHT3101 como testigo positivo y pES como testigo negativo. La eficiencia de transformación de pHT3101 fue 4.8×10⁴ transformantes μg^–1 ADN. Sólo una clona con un inserto de 10 Kb, llamada pES8, produjo transformantes (fenotipo de resistencia a eritromicina) con una eficiencia de transformación de 2×10² transformantes μg^–1 ADN, es decir 100 veces inferior a la del testigo positivo, correspondiente a una inserción cromosomal de pES8. La frecuencia de transformación tan baja observada por la integración de un plásmido no–replicativo es el resultado de la internalización del ADN en la célula y el evento de la recombinación homóloga entre dos fragmentos cromosomales homólogos.

En la Figura 1 se muestran los mapas de restricción simplificados de las regiones seleccionadas del ADN cromosomal de Bti IPS82 después de su integración. El vector pES se representa por una línea discontinua; el ADN cromosomal se muestra como una caja abierta.

Caracterización de las recombinantes

La integración del plásmido pES8 al cromosoma se verificó molecularmente por medio de digestión con diferentes enzimas y electroforesis del ADN total con posterior hibridación Southern blot usando la sonda del replicón pHT3101. La digestión BamHI fue elegida para verificar la integración al cromosoma (Figura 2). Como se esperaba, un fragmento BamHI de 1.4 Kb fue encontrado en la transformante de pES8 (Figura 2A, carril 6) como resultado de la inserción de una parte del plásmido. La sonda también hibridizó con otros dos fragmentos BamHI de tamaño aproximado de 4.0 Kb y 9.0 Kb (Figura 2A, carril 6), indicando que el fragmento contenía un sitio de restricción BamHI. Las bandas de 1.4 Kb y 4.0 Kb provienen de la integración del plásmido suicida pES, no aparecen en la cepa silvestre (Figura 2A carril 7) e indican la integración cromosomal. El ADN control fue el plásmido pHT3101 que tenía dos sitios de restricción BamHI; por tanto, la digestión con esta enzima generaba dos fragmentos con tamaño de 3.3 y 3.4 Kb (Figura 2A, carril 8). La digestión fue parcial, por lo que aparece la banda de 6.7 Kb producto de pHT3101 sin digerir.

Las cepas silvestre y recombinante fueron probadas para determinar alguna posible alteración en la formación de la espora; sin embargo, no se observó alteración alguna en la eficiencia de esporulación en la cepa recombinante. Un análisis mediante geles SDS–PAGE (datos no mostrados) indicó que la cepa recombinante producía las mismas proteínas cristalíferas que la cepa silvestre; por tanto, el fragmento que promovía la recombinación no afectaba la esporulación ni la producción de cristales.

Análisis de restricción del locus ihr y recombinación con el fragmento KpnI

La clona transformante contiene un inserto de aproximadamente 10 Kb que presenta pocos sitios de corte para enzimas de uso frecuente, pero contiene un sitio EcoRV, tres sitios StyI y un sitio KpnI. La secuencia de nucleótidos del segmento de ADN de Bti IPS82 que permite la integración al ADN por recombinación homóloga se denominó ihrI y está presente en otras cepas tipo de B. thuringiensis var. kurstaki.

Para localizar la región mínima en el fragmento, esencial para la recombinación homóloga y para valorar la posibilidad de que la recombinación pudiera ser dependiente del tamaño del inserto, se probaron algunas supresiones específicas con algunas enzimas de restricción presentes en el locus. Sin embargo, sólo fue posible realizar una supresión KpnI de 2.8 Kb en un extremo del fragmento (Figura 1). La supresión de un segmento de 2.8 Kb con la enzima KpnI produjo una clona con un inserto de 7.2 Kb (pESΔKpnI) que retiene la capacidad para transformar a Bti, lo que confirma que la clona consistentemente lleva a cabo recombinación con el mismo ADN cromosomal de Bti y que la recombinación no es dependiente del tamaño del inserto.

En la Figura 2B se muestra la diferencia en tamaño del ADN cromosomal de la clona completa y la suprimida (Figura 2B, carriles 3 y 5) relacionada a los fragmentos de 9.0 y 6.2 Kb, mientras que los fragmentos BamHI de 1.4 y 4.0 Kb mostraron señal con la parte de la sonda que corresponde al plásmido vector (Figura 1). El ADN testigo fue el plásmido pHT3101 que tenía dos sitios de restricción BamHI; por tanto, la digestión con esta enzima generaba dos fragmentos de 3.3 y 3.4 Kb (Figura 2B, carril 2).

Secuenciación del locus ihrI y su comparación con genomas conocidos

El ADN del locus recombinante fue sujeto a una secuenciación de nucleótidos parcial. Para ello se secuenció la clona pES8ΔKpnI, por el extremo KpnI y luego en una región interna de 1500 pb (ver Figura 3B) cuya secuencia se depositó en el GenBank (número de acceso GQ476797). Esta secuencia se analizó mediante BLAST y ClustalW y se determinó que tiene 99 % de identidad con una sección incompleta del cromosoma de Bti (número de acceso NZ_AAJM01000054), 93 % de identidad con Bt var. Kurstaki (número de acceso NZ_ACND01000049), 93 % con Bt var. Konkukian (número de acceso AE017355), y 90 % con Bt Al Hakam (número de acceso CP000485). Además muestra 90–97 % de identidad con los cromosomas secuenciados de cepas de B. cereus, siendo más similar a la cepa 14579 (número de acceso AE016877). Asimismo, posee 90 % de identidad con una sección de 6.4 Kb de B. anthracis Ames (número de acceso AE016879) y 88 % con un segmento corto del cromosoma de B. weihenstephanensis KBAB4 (número de acceso CP000903). La comparación de las secuencias analizadas pone de manifiesto que está altamente conservada con variaciones puntuales, incluso con una inserción adicional de 5 Kb presente en el cromosoma de B. anthracis Ames. La organización transcripcional teórica de la secuencia de Bti mostró que un marco de lectura grande está interrumpido; esto sugiere que puede tener relación con la recombinación homóloga en el locus ihrI.

Ubicuidad y recombinación del locus ihrI completo en otras cepas de Bt

Considerando la ventaja de una exitosa transformación en un solo paso observada para B. thuringiensis var. israelensis mediante un locus recombinante, parecía prometedor expandir la estrategia a otras variedades de B. thuringiensis. Primero fue necesario determinar la presencia del locus completo ihrI en el cromosoma de las cepas elegidas para la transformación, debido a que la recombinación homóloga necesitaba un ADN similar como substrato para lograr el intercambio molecular. Este análisis se centró en las cepas de B. thuringiensis var. kurstaki, HD–1 y HD–73. Los patrones de hibridación resultantes se muestran en la Figura 3A y el locus fue detectado en ambas cepas, confirmando su presencia en ellas.

Se determinó la presencia del fragmento interno de 1500 pb secuenciado y aislado dentro del locus recombinante en nuestra colección de cepas. Se realizaron reacciones de PCR utilizando el ADN genómico de varias cepas de Bt como templado, e inesperadamente el fragmento de 1500 pb se amplificó para todas las cepas (Figura 3B).

Esto indica que las cepas se podrían transformar con el plásmido recombinante por poseer el ADN substrato. Por tanto se usó el plásmido recombinante pES8 para electroporarlo en las cepas de B. thuringiensis var. kurstaki y otras cepas de bacillus de suelo. El plásmido pHT3101 se usó como testigo positivo y el plásmido pES como testigo negativo. Sólo HD–1 y una cepa de suelo, denominada 47–IV, pudieron ser transformadas con el vector de testigo positivo pHT3101 en un número de transformantes inferior, comparado con la cepa de B. thuringiensis var. israelensis IPS82, y no se pudo transformar la cepa HD–73. A pesar de obtener transformantes con el testigo positivo, pES8 no se pudo transformar. Por tanto, es posible que cambios de nucleótidos en la secuencia del locus ihrI fueran decisivos para la recombinación.

 

CONCLUSIONES

Se logró la recombinación homóloga cromosomal de B. thuringiensis var. israelensis en un solo paso.

El análisis de la secuencia de nucleótidos del locus ihr indicó que esta región del genoma de B. thuringiensis var. israelensis IPS82 es semejante a otras secuencias reportadas de Bt. Pero un cambio puntual provoca que la organización transcripcional teórica de la secuencia de Bti muestre un marco de lectura grande interrumpido, lo cual sugiere que puede tener relación con la recombinación homóloga en el locus ihrI.

 

AGRADECIMIENTOS

Al Gobierno de México, Secretaría de Relaciones Exteriores y al CONACyT SEP–2004–C01–47120 por las becas y los recursos otorgados para la realización del proyecto. A Alberto Chantes Guerra por su asistencia técnica.

 

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