Fitociencia

 

Caracterización isoenzimática de nueve variedades botánicas de Tigridia pavonia (L. f.) DC

 

Isozyme characterization of nine botanical varieties of Tigridia pavonia (L. f.) DC

 

Amaury M. Arzate–Fernández*, Alejandra Hoyos–Basurto, Luis M. Vázquez–García y Ma. de Guadalupe Gutiérrez–Martínez

 

Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad Autónoma del Estado de México. Carretera Toluca–Ixtlahuaca. Km 11.5. entronque al Cerrillo. Centro Universitario El Cerrillo. 50200. Toluca, México. *Autor responsable: (amaury1963@yahoo.com.mx)

 

Recibido: Septiembre, 2007.
Aprobado: Mayo, 2008.

 

Resumen

Se estudiaron los patrones de bandeo isoenzimáticos (PBI) de nueve variedades botánicas de Tigridia pavonia (L. f.) DC., especie nativa de México con un alto potencial ornamental. Las variedades fueron recolectadas en tres municipios del Estado de México: Tenancingo (2100 m), Temascaltepec (2250 m) y Temoaya (2600 m). Como fuente de extracción de proteínas se usaron tejidos foliares de cada variedad. En los corrimientos se empleó la técnica de electroforesis horizontal en geles de almidón (SGE). Con SGE fueron ensayadas nueve isoenzimas: aspartato amino transferasa (AAT; EC 2.6.1.1), fosfatasa ácida (ACP; EC 13.1.3.2), catalasa (CAT; EC 1.11.1.6), malato deshidrogenasa (MDH; EC 1.1.1.37), 6–fosfogluconato deshidrogenasa (PGD; EC 1.1.1.44), fosfoglucosa isomerasa (PGI; EC 5.3.1.9), fosfoglucomutasa (PGM; EC 2.7.5.1), fosfohexosa isomerasa (PHI; EC 5.3.1.8) y peroxidasa (POX; EC 1.11.1.7). Se observaron 32 bandas arregladas en 20 PBI: dos para AAT, dos para ACP, dos para CAT, cuatro para MDH, uno para PGD, uno para POX, tres para PGI, tres para PHI y dos para PGM. La isoenzima más polimórfica fue MDH, mientras que PGD y POX no mostraron polimorfismo. Los datos de siete isoenzimas fueron usados para calcular las relaciones genéticas con el método UPGMA. Las variedades de T. pavonia pudieron ser diferenciadas una de otra, excepto las variedades Ángeles de Sandra y Carolina de Dulce, las cuales no pudieron distinguirse con los PBI observados. Las variedades Gloria y Samaria, recolectadas a 2600 m, presentaron mayor variación genética que las recolectadas a 2100 o 2250 m, lo cual podría atribuirse a la altitud. Se concluye que las isoenzimas pueden usarse para la diferenciación genética de variedades de T. pavonia.

Palabras clave: Tigridia pavonia, electroforesis en gel de almidón, caracterización varietal, isoenzima, marcadores bioquímicos.

 

Abstract

Isozyme banding patterns (IBP) were studied in nine botanical varieties of Tigridia pavonia (L. f.) DC., a native species of México that is highly promising as an ornamental. The varieties were collected in three high–altitude municipalities of the state of México. Tenancingo (2100 m), Temascaltepec (2250 m), and Temoaya (2600 m). Leaf tissues of each variety were used as the source for protein extraction. The horizontal starch gel electrophoresis (SGE) technique was used in the runs. With SGE, nine isozymes were tested: aspartate aminotransferase (AAT; EC 2.6.1.1), acid phosphatase (ACP; EC 13.1.3.2), catalase (CAT; EC 1.11.1.6), malate dehydrogenase (MDH; EC 1.1.1.37), 6–phosphogluconate dehydrogenase (PGD; EC 1.1.1.44), phosphoglucose isomerase (PGI; EC 5.3.1.9), phosphoglucomutase (PGM; EC 2.7.5.1), phosphohexose isomerase (PHI; EC 5.3.1.8) and peroxidase (POX; EC 1.11.1.7). Thirty–two bands were observed arranged in 20 IBP: two for AAT, two for ACP, two for CAT, four for MDH, one for PGD, one for POX, three for PGI, three for PHI, and two for PGM. The most polymorphic isozyme was MDH, while PGD and POX did not exhibit polymorphism. The data of seven isozymes were used to calculate genetic relationships with the UPGMA method. T. pavonia varieties could be differentiated from each other, except for the varieties Angeles de Sandra and Carolina de Dulce, which could not be distinguished with the observed IBP. The varieties Gloria and Samaria, collected at 2600 m, had greater genetic variation than those collected at 2100 or 2250 m, possibly attributable to altitude. It is concluded that isozymes can be used to genetically differentiate varieties of T. pavonia.

Key words: Tigridia pavonia, starch gel electrophoresis, varietal characterization, isozymes, biochemical markers.

 

INTRODUCCIÓN

La flor del tigre u Oceloxochitl, Tigridia pavonia (L. f.) DC., es una planta bulbosa nativa de México muy abundante en el país, principalmente en bosques de Pinus y Quercus. Debido a esta extensa distribución, México es considerado su centro de mayor diversidad genética. Por su belleza natural se encuentra en jardines familiares, parques, panteones, y en forma silvestre (Vázquez–García et al., 2001a, 2001b; Vázquez–García y López–Sandoval, 2003).

En México no hay registros de su producción comercial, pero en Europa, Asia y Australia aparece en catálogos de horticultura como planta para jardinería. Así, se extraen plantas silvestres en México, exponiendo el acervo fitogenético a una descontrolada y peligrosa erosión genética (Vázquez–García et al., 2001b).

En el país, la variabilidad fitogenética es necesaria para mantener y mejorar la agricultura, pero se requiere conocerla para su uso y conservación. Por ello, es importante la caracterización morfológica y molecular de variedades. Al respecto, Vázquez–García et al. (2001a) describieron botánicamente nueve variedades de T. pavonia siguiendo el patrón de 17 descriptores. Sin embargo, muchas de las diferencias morfológicas pueden ser alteradas por el ambiente, pero su información genética no cambia, por lo cual se aplican técnicas para identificar variedades usando marcadores genéticos. Pero la literatura sobre marcadores genéticos es muy limitada para el género Tigridia.

Rodríguez y Sytsma (2005) estudiaron la relación filogenética entre 23 especies de la tribu Tigridieae (Iridaceae) usando datos morfológicos y secuenciación de nucleótidos con marcadores ITS (Internal Transcribed Spacer). Aunque los marcadores bioquímicos como isoenzimas son una técnica práctica y reproducible, no han sido reportados para la flor del tigre. Estos marcadores son codominantes (Kephart, 1990), no muestran efectos ambientales (Marquard y Chan, 1995; Booy et al., 1998) y por tanto son apropiados para estimar parámetros poblacionales y construir mapas genéticos. Además de confiables, son relativamente más económicos que aquellos de tipo molecular y permiten obtener información con diferentes tejidos (Vicente y Fulton, 2003). Las isoenzimas han sido reportadas exitosamente en varias especies vegetales: frijol, Phaseolus vulgaris L. (Bassiri y Adams, 1977); arroz, Oryza sativa (Tso y Chen, 1997); tulipán, Tulipa spp. (Booy y Van Raamsdonk, 1998); henequén, Agave fourcroydes (Colunga–Garciamarin et al., 1999); fresa, Fragaria x ananassa (Gálvez et al., 2001); lilies, Lilium spp. (Arzate–Fernández et al., 2005a).

Algunas variedades de T. pavonia son diploides (2n=26, 28) y requieren más de dos años, desde la siembra hasta la floración, para ser propagadas vegetativamente (Molseed, 1970). Así, los materiales recolectados pueden ser mantenidos como clones y por ser de polinización libre, su estructura genómica puede considerarse como heterocigótica.

A pesar de la importancia económica de la especie y la trascendencia de la identidad varietal, no se encontraron estudios de su caracterización isoenzimática. Por tanto, los objetivos de esta investigación fueron: 1) caracterizar molecularmente nueve variedades botánicas de T. pavonia usando nueve sistemas isoenzimáticos, aplicando la técnica de electroforesis horizontal sobre geles de almidón; 2) analizar la posible relación entre la altitud de muestreo y el valor de la diferenciación genética de las variedades evaluadas.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetativo

Se usaron nueve variedades botánicas de T. pavonia (L. f.) DC., recolectadas en tres localidades del Estado de México: la variedad Sandra (SAN) en el municipio de Tenancingo (2100 m); las variedades Ángeles (ANG), Dulce (DUL), Penélope (PEN), Mariana (MAR), Carolina (CAR) y Trinidad (TRI) en el municipio de Temascaltepec (2250 m); las variedades Samaria (SAM) y Gloria (GLO), en el municipio de Temoaya (2600 m). Las nueve variedades fueron cultivadas a 18 °C y HR 60%, en un sustrato de tierra de monte, arena y estiércol vacuno (1:1:1), en un invernadero rústico de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma del Estado de México, (UAEM) situada a 2600 m.

Se usaron dos individuos de cada variedad de T. pavonia. Se tomaron secciones de hoja de cada individuo, entre las ocho y las 12 semanas después de iniciada la brotación. Todas las muestras se procesaron en las instalaciones del laboratorio de Biología Molecular Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la UAEM.

Procedimiento electroforético

Aproximadamente 50 mg de tejido foliar fresco de cada muestra fue homogeneizado usando una barreta de plástico en 50 µL de solución amortiguadora extractora de Tris–HCl (hidroximethil aminometano) 0.1M, EDTA–2Na (etilen diamino tetracético) 2%, glicerol 50.4%, tween–80 3.2% y DTT (ditiotreitol) 0.8%, pH 7.5 (Arzate–Fernández et al., 2005a). Las muestras se conservaron a –20 °C hasta su análisis. Se usaron dos sistemas amortiguadores de histidina–ácido cítrico, pH 5.7 y pH 6.5 (H–AC) y Tris–citrato/Tris–histidina, pH 8.5 (T–C/T–H), según los procedimientos de Glaszmann et al. (1988) y Stuber et al. (1988). Los 18 sistemas isoenzimáticos evaluados fueron: aspartato amino transferasa (AAT; EC 2.6.1.1), fosfatasa ácida (ACP; EC 13.1.3.2), alcohol deshidrogenasa (ADH; EC 1.1.1.1), aminopeptidasa (AMP; EC 3.4.11.1), catalasa (CAT; EC 1.11.1.6), endopeptidasa (ENP; EC 3.4.23.6), esterasa (EST; EC 3.1.1.1), formato deshidrogenasa (FDH; EC 1.2.1.2), glutamato deshidrogenasa (GDH, EC 1.4.1.2), glucosa–6–fosfato deshidrogenasa (G–6–PDH; EC 1.1.1.49), enzima málica (MAL; EC 1.1.1.40), malato deshidrogenasa (MDH; EC 1.1.1.37), fosfoglucosa deshidrogenasa (PGD; EC 1.1.1.44), fosfoglucosa isomerasa (PGI; EC 5.3.1.9), fosfoglucomutasa (PGM; EC 2.7.5.1), fosfohexosa isomerasa (PHI; EC 5.3.1.8), peroxidasa (POX; EC 1.11.1.7) y shikimato deshidrogenasa (SKD; EC 1.1.1.25). Las muestras fueron cargadas en un gel de almidón hidrolizado de papa al 12 % y su electroforesis se hizo a 4 °C, con una duración media de 3 h, 40–50 mA y 100–150 v. Cada muestra se corrió un mínimo de tres veces para verificar su reproducibilidad. Los procedimientos de tinción enzimáticos se realizaron según las técnicas descritas por Torres et al. (1978), Vallejos (1983), Glaszmann et al. (1988), Stuber et al. (1988), Wendel y Weeden (1990) e Ishikawa (1994).

Análisis estadístico

Se elaboró un registro de los patrones de bandeo y a cada banda se asignó en una matriz binaria como ausente "0" o presente "1". Para conocer las relaciones genéticas y la agrupación de las variedades se hizo un dendograma con los datos usando el programa POPGENE (ver. 1.32; Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta and Center for International Forestry Research, AB, Edmonton, Canadá) (Yeh and Boyle, 1999), usando el método UPGMA (modificado del procedimiento NEIGHBOR de la versión 3.5 de PHYLIP) (Felsenstein, 1990), basado en la matriz de distancias genéticas de Nei (Nei, 1972).

Para evaluar la posible relación entre la altitud geográfica de recolección de variedades y el valor de la diferenciación genética (D_G) de cada variedad, se hizo un análisis de correlación simple con el programa estadístico STATGRAPHICS Plus 4.1.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Descripción de los patrones de bandeo

En el presente estudio, las nueve variedades de T. pavonia evaluadas fueron encontradas en estado silvestre y sometidas a un proceso de polinización libre; por tanto, fueron consideradas heterocigóticas, lo cual concuerda con los diversos PBI observados. De las 18 isoenzimas probadas se lograron teñir 12, pero sólo nueve mostraron suficiente resolución y nitidez para su registro y estudio. Algunas bandas fueron omitidas debido a su pobre resolución. Las isoenzimas ACP, MDH, PGI, PHI y PGM presentaron mejor resolución al ser analizadas con el sistema H–AC, pH 5.7; y las isoenzimas AAT y PGD en el mismo sistema, pero a un pH 6.5. En cambio, las isoenzimas CAT y POX lo hicieron en el sistema T–C/T–H. De las isoenzimas seleccionadas se obtuvieron nueve zimogramas donde se identificaron 32 bandas arregladas en 20 PBI: dos para AAT, dos para ACP, dos para CAT, cuatro para MDH, uno para PGD, uno para POX, tres para PGI, tres para PHI y dos para PGM (Figura 1). La mayoría de las variedades pudieron identificarse por su PBI obtenido con cada isoenzima, como se describe a continuación.

Aspartato amino transferasa

La AAT mostró cinco bandas activas (Figura 1A) y se detectaron variedades con cuatro bandas arregladas en dos patrones de bandeo. El patrón 1 se observó en las variedades ANG, CAR, DUL, MAR, PEN, SAN mientras que las variedades GLO, SAM y TRI mostraron el patrón 2 (Cuadro 1).

Fosfatasa ácida

La ACP mostró cuatro bandas activas (Figura 1B) y se detectaron variedades con una o con cuatro bandas, arregladas en dos patrones de bandeo. Las variedades ANG, CAR, DUL, GLO, MAR, PEN, SAN y TRI mostraron el patrón 1 compuesto por cuatro bandas. El patrón 2 tuvo una banda y se observó sólo en la variedad SAM (Cuadro 1).

Catalasa

La CAT produjo dos bandas activas (Figura 1C) y se detectaron variedades con una y con dos bandas, arregladas en dos patrones de bandeo. El patrón 1 con dos bandas se observó en las variedades CAR, DUL, MAR, PEN y SAM. El patrón 2 se observó en las variedades ANG, GLO, SAN y TRI (Cuadro 1).

Malato deshidrogenasa

La MDH mostró seis bandas activas (Figura 1D) y se detectaron variedades con tres y cuatro bandas en cuatro arreglos diferentes para producir cuatro patrones de bandeo. Los patrones 1, 2 y 3 estaban compuestos por cuatro bandas. El patrón 1 se observó en las variedades ANG, CAR, DUL, MAR, SAN y TRI, mientras que las variedades PEN y GLO mostraron los patrones 2 y 3. El patrón 4 tuvo tres bandas activas y se observó en la variedad SAM (Cuadro 1).

Fosfoglucosa deshidrogenasa

La PGD produjo dos bandas activas (Figura 1E) arregladas en un sólo patrón, por lo cual no fue posible diferenciar ninguna de las variedades (Cuadro 1).

Peroxidasa

La POX produjo dos bandas activas (Figura 1F) arregladas en un sólo patrón, por lo cual no fue posible diferenciar ninguna de las variedades (Cuadro 1).

Fosfoglucosa isomerasa

La PGI produjo cuatro bandas activas (Figura 1G) y se detectaron variedades con dos, tres y cuatro bandas arregladas para producir tres patrones de bandeo. El patrón 1 tuvo cuatro bandas y se observó en las variedades ANG, CAR, DUL, PEN, SAM, SAN y TRI. El patrón 2 tuvo tres bandas y se observó en la variedad MAR. El patrón 3 tuvo dos bandas y se observó en la variedad GLO (Cuadro 1).

Fosfohexosa isomerasa

La PHI produjo tres bandas activas (Figura 1H) y se detectaron variedades con dos y tres bandas activas, en tres arreglos, para producir tres patrones de bandeo. El patrón 1 tuvo tres bandas y se observó en las variedades ANG, CAR, DUL, PEN, SAN y TRI. Los patrones 2 y 3 tuvieron dos bandas cada uno. Las variedades GLO y SAM tuvieron el patrón 2 y la variedad MAR el patrón 3 (Cuadro 1).

Fosfoglucomutasa

La PGM produjo cuatro bandas activas (Figura 1I) y se detectaron variedades con tres y cuatro bandas, arregladas en dos patrones de bandeo. El patrón 1 tuvo cuatro bandas y sólo se observó en GLO. El patrón 2 tuvo tres bandas y se observó en ANG, CAR, DUL, MAR, PEN, SAM, SAN y TRI (Cuadro 1).

Como se aprecia en el Cuadro 1, las nueve isoenzimas produjeron bandas polimórficas suficientes para distinguir la mayoría de las variedades de T. pavonia evaluadas. De todas ellas, MDH produjo el mayor número (4) de PBI y por tanto el más alto porcentaje de polimorfismo (18.75%). Con base en los PBI observados la isoenzima permitió diferenciar un mayor número de variedades . Por el contrario, las isoenzimas PGD y POX produjeron sólo un PBI, por lo que no fueron útiles para diferenciar entre las variedades utilizadas.

Análisis estadístico

Se consideraron 29 bandas derivadas de siete isoenzimas: cinco para AAT, cuatro para ACP, dos para CAT, seis para MDH, cuatro para PGI, tres para PHI y cuatro para PGM (Figura 1). De la relación genética entre dichas bandas se generó un dendograma (Figura 2). Con el análisis genético se obtuvo un valor de distancia genética (D_G) promedio de 0.194 entre las nueve variedades de T. pavonia (Cuadro 2). Como se observa en el Cuadro 2, las variedades ÁNG y SAN y las variedades CAR y DUL mostraron un valor D_G de 0.0, apreciándose una similaridad genética y a pesar del número de isoenzimas usadas, no fue posible distinguir tales variedades. En contraste, Vázquez–García et al. (2001a) caracterizaron morfológicamente estas cuatro variedades por la diferencia del color de sus flores en cada una de ellas: blanco–rojo y rojo–amarillo. Las variedades con el valor D_G más alto (0.421) fueron GLOR–MAR, GLO–PEN y MAR–SAM.

Un factor importante que probablemente influye en la diferenciación de variedades de la misma especie, es la altitud donde se localizan naturalmente. Al respecto y de acuerdo con los resultados del presente estudio, se observa en el dendograma dos grupos principales. En el grupo I se ubicaron siete variedades: ANG, SAN, CAR, DUL, MAR, PEN y TRI, que fueron recolectadas a una altitud de 2100 o 2250 m y un promedio de D_G de 0.074. En el grupo II sólo están las variedades GLO y SAM, recolectadas a 2600 m y un D_G de 0.374.

Según Wen y Hsiao (2001) y Arzate–Fernández et al. (2005b), las diferencias genéticas de poblaciones de Lilium podrían estar correlacionadas con la altitud, es decir, individuos recolectados a menores altitudes deberían tener una mayor similitud genética que aquellos de mayores altitudes. En el presente estudio fue posible establecer una estrecha relación entre la distancia genética de las nueve variedades de T. pavonia y las altitudes de recolección. Los resultados de la Figura 2 y del Cuadro 2, y los del análisis de correlación (r=0.762; p<0.01), permiten inferir que la diferencia de altitudes entre los lugares de recolección, puede ser uno de los factores que determinan la agrupación de las variedades Gloria y Samaria, recolectadas a 2600 m y con una mayor variación genética que aquellas recolectadas entre 2100 y 2250 m.

 

CONCLUSIONES

Con la técnica de electroforesis de isoenzimas en gel de almidón fue posible caracterizar isoenzimáticamente nueve variedades botánicas de T. pavonia.

La distancia genética entre las variedades Ángeles–Sandra y Carolina–Dulce fue 0.0, y no fue posible distinguir una de otra con las nueve isoenzimas evaluadas.

Con las isoenzimas 6–fosfogluconato deshidrogenasa y peroxidasa no fue posible identificar las variedades estudiadas.

La isoenzima malato deshidrogenasa permitió diferenciar el mayor número de variedades de T. pavonia, generando cuatro patrones de bandeo.

De las nueve variedades botánicas de T. pavonia, Gloria presentó la mayor variabilidad isoenzimática.

El análisis de correlación mostró una relación estrecha entre la distancia genética de las nueve variedades de T. pavonia y la altitud del lugar donde fueron recolectadas. Las variedades Gloria y Samaria recolectadas a 2600 m tienen una mayor variación genética que aquellas recolectadas a 2100 o 2250 m.

 

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos tanto a la Secretaría de Investigación y Estudios Avanzados de la U.A.E.M. como al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el financiamiento a la presente investigación, a través de los proyectos de investigación con clave UAEM No. 2106/ 2005 y CONACYT No. 52936.

 

LITERATURA CITADA

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