Protección vegetal

 

Caracterización de un hongo asociado a la planta macho del pochote (Ceiba aesculifolia (H.B. & K.) Britten & Baker f. subsp. parvifolia (Rose) P.E. Gibbs & Semir) en Tehuacán–Cuicatlán, México

 

Characterization of a fungus associated with Ceiba aesculifolia (H.B. & k:) Britten & Baker f. subsp. parvifolia (Rose) P:E. Gibbs & Semir) planta macho in Tehuacan–Cuicatlan, Mexico

 

Aidé Avendaño–Gómez¹, Rafael Lira–Saade¹, Patricia Dávila–Aranda¹, Alejandro Casas–Fernández², Rodolfo De La Torre–Almaraz¹

 

¹ Laboratorio de Recursos Naturales. UBIPRO. FES. Iztacala, Universidad Nacional Autónoma de México. Avenida, de los Barrios No. 1, Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla. 54090. Estado de México. (aaide3@hotmail.com).

² Centro de investigaciones en Ecosistemas, Universidad Nacional Autónoma de México. Campus Morelia. Apartado Postal 27–3 (Santa María de Guido), Morelia Michoacán, 58190 México.

 

Recibido: Octubre, 2006.
Aprobado: Julio, 2007.

 

Resumen

El pochote (Ceiba aesculifolia subsp parvifolia) es una especie arbórea silvestre cuyas semillas se consumen y comercializan por las comunidades del Valle de Tehuacán, Puebla. Pero esta actividad se ha reducido debido a la presencia de árboles con proliferación de flores, pudrición y deformación de frutos, que son reconocidos como pochotes macho. Esto causa pérdidas económicas importantes para los pobladores que dependen de este recurso natural. Por tanto, los objetivos de este trabajo fueron identificar al agente causal relacionado con este síndrome y establecer los factores climáticos y de manejo que determinan su incidencia y distribución en la región. La revisión del interior de los frutos reveló la destrucción de semillas por la abundancia de esporas de color café–rojizo de un hongo, que no produjo micelio ni esporas en cultivos axénicos. La comparación y alineamiento de las secuencias de los productos de la PCR de la región ITS1–ITS2 del gen rADN 18S obtenidos del ADN de las esporas aisladas de los frutos de pochote macho, con secuencias disponibles en el Genbank, mostró una identidad nucleotídica de 87 a 75% con los géneros Crinipellis y Moniliophthora. Así, es posible que las esporas encontradas en los frutos del pochote macho pertenezcan a una especie de estos hongos. Se determinó que la distribución e incidencia del pochote macho, están relacionadas directamente con el grado de uso por los habitantes locales y no por los factores climáticos evaluados.

Palabras clave: Etnobotánica, moniliasis, recursos naturales.

 

Abstract

Pochote (Ceiba aesculifolia supsp. parvifolia) is a wild tree species whose seeds are consumed and sold by communities of Valle de Tehuacán, Puebla. But these activities have decreased because a large number of trees have appeared with a proliferation of flowers and fruit rot and deformation. This condition is known as pochote macho and causes major economic losses for the population that depends on this natural resource. Therefore, this study was conducted to identify the causal agent related to this syndrome and to establish the climate and management factors that determine its incidence and distribution in the region. Examination of fruit interior revealed destruction of seed by abundant reddish–brown spores of a fungus that did not produce mycelium nor spores in axenic cultures. Comparison and alignment of PCR product sequences of the ITS1–ITS2 region of the rDNA 18S gene obtained from DNA of spores isolated from pochote macho fruits with sequences available in the Genebank, showed 87 to 75% nucleotide identity with the genera Crinipellis and Moniliophthora. It is thus possible that the spores found in pochote macho fruits belong to a species of these fungi. Distribution and incidence of pochote macho was determined. This was directly related to the degree local inhabitants used it and not to the evaluated climatic factors.

Key words: Ethnobotany, moniliasis, natural resources.

 

INTRODUCCIÓN

El pochote (Ceiba aesculifolia subsp parvifolia) es una especie manejada principalmente en comunidades vegetales naturales del Valle de Tehuacán, México, encontrada junto con maíz (Zea mays L.), frijol (Phaseolus vulgaris L.), chile (Capsicum annum L.) y calabaza (Cucurbita pepo L.) en el registro histórico en las Cuevas de Coxcatlán (Casas et al., 2001; Avendaño et al., 2006). Sus semillas se consumen y comercializan en los mercados locales. Pero esta actividad se ha reducido debido a la presencia entre sus fenotipos (morado, verde–cenizo y verde–rojizo) de árboles con proliferación de flores y frutos (Figura 1), que se debe al acortamiento de entrenudos en las ramas reproductivas, y que dan la apariencia de agruparse en racimos (síntoma de la enfermedad llamada escoba de bruja). El fruto afectado es globoso o esférico con engrosamiento de su cáscara y pudrición seca; al abrirse hay una gran cantidad de un polvo seco, café rojizo, fácilmente desprendible (moniliasis) y semillas destruidas (Avendaño et al., 2006). Estas características contrastan con la producción de inflorescencias solitarias o en pares (Figura 1) y la forma oblonga–elipsoide de los frutos descritos para la especie (Gibbs y Semir, 2003).

Los árboles con estas irregularidades son reconocidos, en Coxcatlán, Puebla, como pochotes macho, por la ausencia en sus frutos de semillas aptas para el consumo y porque dañan la economía de los habitantes que dependen de este recurso natural (Avendaño et al, 2006). Dado que no se encontraron antecedentes sobre el origen del síndrome del pochote macho y por su importancia económica para ciertos sectores sociales de la región, los objetivos de este estudio fueron identificar y caracterizar al agente causal relacionado con las anormalidades del pochote macho, evaluar sus efectos en la calidad, producción y comercialización de la semilla, establecer la distribución de este tipo de árboles en las zonas de aprovechamiento y precisar algunos factores climáticos y de manejo que la condicionan.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio

El Valle de Tehuacán–Cuicatlán, Puebla, México, está localizado a una altitud de 800 a 1400 m, el clima en la región es semiárido BShw"(w)(e)g con una precipitación media anual de 440 mm, temperatura media anual de 23.8 °C, oscilando entre 16.5 °C en enero y 24.2 °C en mayo. El principal tipo de vegetación en la zona es el matorral xerófilo considerado como una de las reservas naturales con la mayor riqueza, diversidad y endemismo florístico en el mundo (Rzedowski, 1978; Valiente–Banuet et al., 2000; Casas et al., 2001).

Las poblaciones de pochote se localizan en tres altitudes: 800 a 1000 m, donde hay casas, huertos familiares y campos de cultivo; 1000 a 1200 m y más de 1400 m en los montes cercanos a las comunidades. La mayor concentración de árboles de pochote está en las comunidades de Coxcatlán, San Rafael y San José Tilapa, municipio de Coxcatlán, Puebla (Avendaño et al., 2006).

De 2003 a 2005, en cada una de estas comunidades se localizaron y analizaron, en cada piso altudinal, plantas y frutos de pochote macho. Se marcaron 30 árboles al azar de diferente fenotipo y se recolectaron sus frutos (270 árboles en total). Se recolectaron los frutos de dos a tres ramas por individuo, obteniéndose 929 frutos, de los cuales 819 fueron de árboles normales (159 para el fenotipo morado, 264 para el cenizo y 396 para el verde–rojizo) y 110 de árboles pochote macho (20 para el fenotipo morado, 36 para el verde–cenizo y 54 para el verde–rojizo), que se trasladaron al laboratorio para su análisis.

 

Identificación del hongo asociado con el pochote macho

Aislamiento y cultivo en medios artificiales

Se revisó el contenido de todos los frutos recolectados rompiendo la cáscara por presión manual o con un martillo, separando los frutos sanos de los que contenían esporas de aspecto polvoso de color café–rojizo. De estos últimos se separó con agujas de disección una porción de micelio y esporas, que se montaron en una solución de azul de lactofenol (4 %) o en agua destilada estéril en un portaobjetos y cubreobjetos, para su observación en un microscopio compuesto y determinar sus características morfológicas. Las estructuras observadas fueron fotografiadas con aumentos de 10 X y 40 X (Sarasola y Sarasola, 1975; López, 1981).

Se transfirió con agujas de disección flameadas y frías micelio y esporas de los frutos de pochote en una cámara de flujo laminar a cajas de Petri con medio estéril de papa dextrosa agar (PDA) o extracto de malta agar (EMA) (Merck, Co., Germany) e incubados a temperatura de laboratorio (25 °C/12 h luz) hasta la formación de micelio y esporas (López, 1981).

Se identificó al hongo asociado a los frutos del pochote mediante la observación con microscopio compuesto de esporas, obtenidas por aislamiento en cultivo en medios artificiales o de las obtenidas directamente de los frutos. Su ubicación taxonómica se hizo por comparación con la descripción contenida en diversas claves específicas (Barnett y Hunter, 1972; Hanlin, 1990; Dugan, 2006).

Caracterización molecular por secuenciación de productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se obtuvo ADN total desde 1 g de esporas obtenidas directamente de frutos, uno para cada una de las tres comunidades (Dellaporta et al., 1983; Lee y Taylor, 1990). Se realizó el ensayo PCR para la amplificación de las regiones intergenéticas transcripcionales (ITS1–ITS2) del componente ADN 18S ribosomal de hongos, que incluye la región 5.8 del rADN. Los oligonucleótidos utilizados fueron ITS4 (5'–TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC–3') e ITS5 (5'–GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G–3'). El programa de amplificación consistió de: 1 ciclo 95 °C, 1 min; 30 ciclos a 95 °C, 1 min, 57 °C, 1 min, 72 °C, 1 min; 1 ciclo a 72 °C, 12 min (White et al., 1990; Mugnier, 1998).

Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 1.0% en solución amortiguadora de boratos pH 8.0, teñidos con bromuro de etidio para su documentación. Los productos de la PCR fueron tomados directamente del gel y purificados con Wizar SV (Promega, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los fragmentos fueron secuenciados directamente en un GeneticAnalyzer 3100 (Applied Biosystem, USA). Las secuencias nucleotídicas obtenidas se depositaron en el GenBank para obtener su número de acceso. Las secuencias se compararon por alineamiento con secuencias disponibles en la base de datos del GenBank (NCBI, 2007), usando el método BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/) y se compararon usando Clustal W (Sogin, 1990).

Incidencia y distribución del pochote macho en las zonas de aprovechamiento y su relación con algunas variables climáticas

Se determinó el porcentaje de incidencia del pochote macho contando el número de individuos con esta anomalía y dividiéndolo entre el numero total de árboles marcados para multiplicarlo por 100, por localidad y por gradiente altitudinal, obteniendo su distribución.

Se realizó un análisis bioclimático para determinar si alguna de estas variables están correlacionadas con la presencia del pochote macho en la zona de estudio, utilizando el Software del programa Bioclim (Pearce y Lindenmayer, 1998).

Se obtuvieron las coordenadas geográficas de los sitios donde se encontraban los individuos muestreados utilizando un GPS. Del estudio se identificaron 19 variables climáticas (Cuadro 1) que incluyen índices de temperatura y precipitación, los cuales se introdujeron en una matriz de 19 columnas (variables bioclimáticas) y 160 hileras (sitios donde se encuentran los individuos muestreados). La información se analizó por componentes principales (Rohlf, 1997), para buscar posibles agrupaciones entre las zonas de estudio debidas a sus características ambientales y relacionarlas con la presencia del pochote macho.

Evaluación de los efectos de la presencia del Pochote macho en fruto y en la producción y comercialización de las semillas

Se utilizaron los porcentajes de incidencia del pochote macho por fenotipo, el análisis morfológico de sus frutos y las pruebas de germinación para evaluar las pérdidas biológicas y económicas causadas por este síndrome.

Análisis morfológico de los frutos

Se midieron 13 características morfológicas de los frutos recolectados (Cuadro 2), con los que se calculó el promedio y la desviación estándar. Las diferencias significativas de las características morfológicas, entre los individuos machos y los árboles sanos, se obtuvieron con un análisis de varianza con el programa SYSTAT 7.0 (SYSTAT, 1997).

Para evaluar la asociación entre las características de los frutos y su estado de salud se elaboró una matriz de 270 columnas (árboles) y 13 hileras (características morfológicas analizadas), la cual se analizó por componentes principales (ACP) (Rohlf, 1997). Los eigenvectores resultantes se usaron para identificar las características que contribuyeron significativamente a la separación de los individuos.

Efecto del hongo en la germinación de semillas de pochote

Se seleccionaron 10 semillas de frutos sanos y deformes de cada uno los tres fenotipos de pochote, las que se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 2 %, se lavaron con agua destilada estéril y se transfirieron con pinzas de disección a cajas de Petri con papel filtro humedecido con agua destilada estéril. Las cajas se mantuvieron a temperatura de laboratorio (25 °C/12 h luz) hasta la germinación de las semillas.

Cálculo de pérdidas económicas

Se calcularon las posibles pérdidas económicas considerando el grado de incidencia de los individuos macho encontrados, así como en la producción y el precio comercial de las semillas.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Identificación del hongo asociado con el pochote macho

Aislamiento y cultivo en medios artificiales

Se observó en el interior de todos los frutos clasificados como pochote macho la presencia de una masa pulverulenta de color rojo ladrillo, con destrucción de semillas, que contrastó claramente con el desarrollo normal de las semillas de los frutos fusiforme sanos, donde no se observó este tipo de polvo rojizo.

La observación de las preparaciones al microscopio reveló la presencia de un hongo con esporas libres, unicelulares hialinas a amarillentas, globosas, ovaladas y de cojín, con un tamaño de 38 a 45 µm (N=83), truncadas y en ocasiones con una pequeña prolongación de la pared gruesa de la espora (Figura 2a). Las esporas se produjeron en cadenas cortas de micelios cortos y hialinos.

Este hongo no produjo micelio o esporas en ningún medio usado, por lo que cabe la posibilidad que sea un saprófito estricto que crece sólo en ciertos sustratos o bien un parásito desconocido. No se observó otra clase de cuerpos fructíferos o esporas diferentes a las descritas fuera o dentro de las flores, frutos o ramas de los árboles analizados. Es posible que en el pochote macho se presente únicamente una fase asexual o anamórfica de un hongo, y que la fase teleomórfica (sexual) ocurra sólo bajo ciertas condiciones climáticas y en alguna época desconocida.

Caracterización molecular por secuenciación de productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se obtuvieron tres secuencias de los productos de la PCR del hongo de los frutos de pochote macho, una por localidad, que se depositaron en el Genbank (No de acceso EF593115, San Rafael; No de acceso EF593116, Tilapa; No de acceso EF593117, Coxcatlán). Los resultados del alineamiento y comparación de las tres secuencias obtenidas de las esporas separadas del interior de los fruto del pochote macho, con las disponibles en el GenBank, mostraron una identidad de 87 a 75 % únicamente con los hongos Crinipellis roreri var. roreri (No de acceso AY230254.1) y Moniliophthora roreri (Número de acceso DQ222927.1). Sin embargo, a pesar de que el registro fue bajo y el error del alineamiento muy alto, se puede señalar que los porcentajes de identidad obtenidos son suficientes para establecer una relación taxonómica del hongo del pochote macho con estas dos especies.

Crinipellis pertenece a un gran orden de Basidiomycetes, los Euagaricales, con pocos patógenos conocidos. Producen cuerpos fructíferos del tipo basidiocarpo, mientras que M. roreri se consideró mucho tiempo como un anamorfo de ascomycetes, que produce sólo esporas (moniliasis) y ningún cuerpo fructífero conocido. A pesar de las aparentes diferencias físicas entre ambos hongos se ha confirmado que ambas especies están estrechamente relacionadas (http://www.ars.usda.gov/Research/docs.htm?docid=12661).

En las plantas de cacao, C. roreri vive dentro de las ramas y produce los síntomas de escoba de bruja (proliferación de flores y frutos) y eventualmente emergen basidiocarpos de color rosa de las ramas. M. roreri cubre los frutos del cacao con una capa algodonosa compuesta de micelio y esporas (pudrición gris o moniliasis) y nunca produce cuerpos fructíferos (Griffith et al., 1994). Es posible que esporas del hongo encontrado en el interior de los frutos del pochote, descrito como pochote macho, pertenezcan a alguna especie relacionada con los géneros Crinipellis y Moniliophthora, por los daños observados en las plantas de pochote en campo (proliferación de flores y frutos, moniliasis o producción excesiva de esporas en el interior de frutos) y a la identidad de las secuencias obtenidas del hongo presente en sus frutos.

Establecimiento de la distribución del Pochote

Macho en las zonas de aprovechamiento y su relación con algunas variables climáticas

Se observó que en el segundo nivel altitudinal se concentra la mayoría de los árboles de pochote macho (Cuadro 3). El análisis de ACP de los datos bioclimáticos de las zonas estudiadas reveló que no hay una diferenciación entre comunidades, pero sí entre gradientes altitudinales. Los dos primeros niveles son los más parecidos entre sí, por sus temperaturas más elevadas y menores precipitaciones (Figura 3).

Análisis morfológico de los frutos

El análisis morfológico mostró que los individuos macho son significativamente diferentes en siete de los 13 caracteres del fruto evaluados (Cuadro 2). Lo anterior se confirmó por el análisis de ACP, donde el componente uno, separa a los individuos por su estado de salud, mientras que el componente dos lo hace por su fenotipo (Figura 4), confirmando los resultados anteriormente descritos sobre la variación fenotípica (Avendaño et al., 2006). En el primer componente, los individuos macho se concentran del lado derecho de la gráfica, mientras que todos los sanos están en el lado izquierdo (Figura 4). Entre las características que diferencian a los frutos de los árboles machos, están su mayor grosor y diámetro en las cáscaras y frutos, semillas de menor tamaño y diámetro (Figuras 2 b, c y d) y pedúnculos más gruesos (Cuadro 4).

Efecto del hongo en la germinación de semillas de pochote macho

Se observó que las semillas de planta macho de los tres genotipos no germinaron. En contraste, el porcentaje de germinación obtenido para las semillas de los árboles normales fue 43% para el fenotipo verde– rojizo y 8% y 17% para los fenotipos verde pálido y morado.

Pérdidas económicas

Se determinó que el número de frutos es mayor en los individuos enfermos: en vez de uno o dos frutos por rama se presentaron de cuatro a ocho, pero éstos no son usados para el consumo ni comercialización de semillas. Dado lo anterior y que de cada árbol hembra o sano se recolectan cerca de 80 frutos, y si cada fruto produce en promedio 15 g de semilla (Cuadro 1), se perderían 1200 g de semillas por árbol macho. Se calculó por tanto que de cada diez árboles enfermos se pierden aproximadamente $ 600 pesos al mes (Avendaño et al., 2006).

La distribución de los pochotes macho sugiere que la incidencia en los dos primeros niveles altitudinales depende más de las actividades humanas que de las características climáticas. Así, a pesar de que los dos primeros pisos altitudinales son muy parecidos, los pochotes macho de los tres fenotipos son más abundantes en el segundo nivel (Cuadro 3), principalmente porque en el primer piso se cortan, por considerarlos peligrosos para la salud y por ser inútiles para el consumo de la semilla (Avendaño et al., 2006). En contraste, en el segundo nivel, donde se localizan las comunidades vegetales naturales (transformadas por la introducción de animales de carga y de pastoreo), se conservan los árboles macho como fuentes de leña. Ocasionalmente se cortan y queman los frutos en racimo para evitar que contagien a otros árboles.

En el tercer nivel altitudinal la frecuencia de los pochotes macho es muy baja, así, como la interacción del hombre con la especie y el medio donde se localiza debido a la distancia (2 h caminando) y a lo inaccesible de la zona. Según Avendaño et al. (2006), lo anterior sugiere que posiblemente las personas sean las causantes de la introducción y dispersión de los pochote macho, a través del aprovechamiento y manejo sobre la especie y el medio. Este supuesto se apoya también en lo reportado por Harlan (1995) de que las personas y los cambios climáticos han sido factores fundamentales en la inserción y distribución de enfermedades en los ambientes manejados (Crain y Pratt, 1995; Anderson et al., 2004). Este fenómeno, conocido como contaminación patogénica, es además un indicador del estrés y disfuncionalidad de un ecosistema, el cual afecta no solo a los servicios que se obtienen de ellos, sino también la conservación de las especies silvestres (Crain y Pratt, 1995).

Las poblaciones naturales de Pochote pueden afectarse por la falta de viabilidad en las semillas de los pochotes macho, en su mayoría atrofiadas, de poco peso y tamaño (Figura 3d). Hasta el momento se desconocen los efectos en la estructura de la población en las zonas de mayor incidencia de los pochotes macho. En cuanto a las pérdidas económicas, la cifra de $600 pesos mensuales calculada como pérdida, puede considerarse baja, pero adquiere significado cuando se relaciona con el hecho de que la mayor parte de la población de la región estudiada se mantiene con ingresos de aproximadamente dos salarios mínimos, por lo que obtiene ingresos y complementa su dieta a través de los productos de recolección, un ejemplo de los cuales es el pochote (Avendaño et al., 2006).

 

CONCLUSIONES

Se determinó que la proliferación de flores y frutos, así como la deformación de frutos y destrucción de semillas, que la gente reconoce como pochote macho, están asociados con la presencia de un hongo no descrito previamente en esta planta, el cual no produce cuerpos fructíferos conocidos, ni crece en medios de cultivo artificiales. El alineamiento y comparación de secuencias obtenidas por PCR de las regiones ITS1–ITS2 del ADN obtenido directamente de las esporas presentes en las plantas macho, mostró que este hongo tiene una identidad nucleotídica del 87 al 75% con los géneros Crinipellis y Moniliophthora, que en cacao causan síntomas similares a los encontrados en el pochote macho.

Se encontró que la viabilidad de las semillas de las plantas macho es nula. El monto de las pérdidas económicas ocasionadas por la inutilidad de las semillas para la comercialización es relativamente bajo, pero tiene alto impacto en los ingresos y la dieta de la población.

Se determinó que la distribución del pochote macho está relacionada con el manejo de la especie y no con los factores ambientales evaluados.

 

LITERATURA CITADA

Anderson, P. K., A. Cunningham, N. Paten, F. Morales, P. Epstein and P. Dazzat. 2004. Emerging infectious diseases of plants, pathogen pollution, climate change and agrotechnology drivers. Trends in Ecol. and Evol. 19 (10): 535–545.        [ Links ]

Avendaño, A., A. Casas, P., Dávila, and R. Lira. 2006. Use forms, management and commercialization of "Pochote" Ceiba aesculifolia (H.B. & K.) Britten & Baker f. subsp. parvifolia (Rose) P.E. Gibbs & Semir (Bombacaceae) in the Tehuacán Valley, Central, México. J. Arid Environ. 67: 15–35.        [ Links ]

Barnett, H.L., and B. B. Hunter. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS. St Paul, Minnesota. 240 p.        [ Links ]

Casas, A., A. Valiente–Banuet, J. Viveros, J. Caballero, L. Cortés, P. Dávila, R. Lira, and I. Rodriguez. 2001. Plant resources of the Tehuacán–Cuicatlán Valley, Mexico. Econ. Bot. 55 (1): 129–166.        [ Links ]

Crain, J. R., and Jr. Pratt. 1995. The relationship between ecosystem health and delivery of ecosystem services. In: Rapport, D., J. Gaudet, and P. Calow. (eds). Evaluating and monitoring the health of large–scale ecosystem. Springer– Verlag. Berlin, Heidelberg. pp: 273–294.        [ Links ]

Dellaporta, S. L., J. Woods, and J.B. Hicks. 1983. A plant minipreparations, version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1:19–21.        [ Links ]

Dugan, M. F. 2006. The Identification of Fungi. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota. USA. 176 p.        [ Links ]

Galindo, J. 1986. Enfermedades del cacao, importancia económica en América. Rev. Mex. Fitopatol. 4 (1): 76–88.        [ Links ]

Gibbs, P., and J. Semir. 2003. A taxonomic revision of the genus Ceiba Mill (Bombacaceae). Anales del Jardín Botánico de Madrid 60 (2) :295.        [ Links ]

Griffith, G., E. Bravo, F. Wilson, D. Lewis, and J. Hedger. 1994. Autecology and evolution of the witches' broom pathogen (Crinipellis perniciosa) of cocoa. In: Ecology of Plant Pathogens Oxon: CAB International. pp: 245–267.        [ Links ]

Harlan, J. 1995. The living fields. Cambridge University press. Cambridge. United Kingdom. 288 p.        [ Links ]

Hanlin, T. R. 1990. lIIustrated Genera of Ascomycetes. Vol. II. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota. USA. pp: 146–148.        [ Links ]

Lee, B. S., and J.W. Taylor. 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores. In: Innis, M. A., Gelfand, J. J., Sninsky, and T. J., White, (eds). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press. San Diego. USA. pp: 282–287.        [ Links ]

López, A. G. 1981. Manejo de Hongos Fitopatógenos. Departamento Parasitología Agrícola. UACH. México. 135 p.        [ Links ]

Mugnier, J. 1998. Molecular evolution and phylogenetic implications of ITS sequences in plants and in fungi. In: Bridge, P., Y. Couteaudier, and J. Clarkson (eds). Molecular Variability of Fungal Pathogens. CAB International. pp: 253–277.        [ Links ]

National Center for Biotechnology Information. http://www.ncbi.n/m–moj.gov/BLAST/. 19 Noviembre 2007.         [ Links ]

Pearce, J., and D. Lindenmayer. 1998. Bioclimatic Analysis of Helmeted Honeyeater. Restoration Ecology. Vol 6(3): 238–243.        [ Links ]

Rzedowski, J. 1978. Vegetación de México. Limusa. México. 432 p.         [ Links ]

Rohlf, J. 1997. Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (NTSYS) version 2.0, Manual Applied Biostatistics Inc., USA.        [ Links ]

Sarasola, A. A., y Ma R. De Sarasola. 1975. Fitopatología. Curso Moderno. Hemisferio Sur, Buenos Aires. Argentina. pp: 189–204.        [ Links ]

Sogin, L. M. 1990. Amplification of ribosomal RNA genes for molecular evolution studies. In: Innis, M.A., Gelfand, Sninsky, J.J., and White, T.J. (eds). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press. San Diego.USA. pp: 307–314.        [ Links ]

SYSTAT. 1997. Systat, version 7.0. SPSS Inc. Chicago, IL, USA.        [ Links ]

Valiente–Banuet, A., A. Casas, A. Alcántara, P. Dávila, N. Flores–Hernández, M del C. Arizmendi, J. Villaseñor, and J. Ramírez. 2000. La vegetación del Valle de Tehuacán. Boletín de la Sociedad Botánica de México. México. D.F. pp: 25–74.        [ Links ]

White, J.T., T. Bruns, S. Lee, and J. Taylor. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M.A., Gelfand, Sninsky, J.J., and White, T.J. (eds). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press. San Diego. USA. pp: 315–322.        [ Links ]