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Agrociencia
versión On-line ISSN 2521-9766versión impresa ISSN 1405-3195
Agrociencia vol.41 no.1 Texcoco ene./feb. 2007
Plant protection
A simple method for the multiple detection of citrus viroids
1INIFAP/UANL. Unidad de Investigación en Biología Celular y Molecular. Apartado Postal 128-F. Ciudad Universitaria. 66450. San Nicolás de los Garza, Nuevo León. (rocha.mario@inifap.gob.mx; mrocha@fcb.uanl.mx).
2Texas A&M University. Citrus Center. 312 N. International Blvd. Weslaco, Texas 78596. USA.
RT-PCR for viroid detection is commonly used by certified laboratories in México to determine sanitary quality of citrus plants, when donor trees are to be used to propagate plants in nursery. This paper describes a simple methodology for multiple detection of the viroids Citrus exocortis viroid (CEVd), CVd II and Citrus viroid III (CVdIII) in a single RT-PCR reaction. Nucleic acids were extracted with minimum quantities of tissue (250 mg) and 1% polyvinylpyrrodolidone was added to a saline extraction solution of glycine-phosphate. Detection of the three viroids was successful when the RT reactions were performed with 2.0 μg of RNA, 1.0-1.5 mM of dNTPs, 0.90 μM of the complementary primer (C) for CEVd, and 0.49 μM for the corresponding C primers for CVd II and CVd III, respectively, followed by PCR reactions with 2-4 μL of cDNA from RT and 10, 5, 5 pmols of the set of homologous (H) and C set of primers for CEVd, CVd II and CVd III. The use of less than 1.0 μM of dNTPs and equal quantities of the C primers in the RT reactions and equal quantities of both C and H primers for CEVd and CVd II and CVd III in the PCR reactions provided reliable simultaneous detection for CVd II and CVd III, but erratic results with CEVd.
Key words: Citrus cachexia; citrus exocortis; nucleic acid extraction; polyvinylpyrrolidon
La detección de viroides mediante RT-PCR en México es de uso común en los laboratorios de acreditación para determinar la calidad sanitaria de plantas de cítricos, cuando se van a utilizar árboles madre para propagar plantas de vivero. En el presente trabajo se describe una metodología simple para la detección múltiple de los viroides Citrus exocortis viroid (CEVd), CVd II, y Citrus viroid III (CVd III) en una sola reacción de RT-PCR. La extracción de ácidos nucleicos se efectuó con cantidades mínimas (250 mg) de tejido, y adicionando 1% polivinilpirrolidona en la solución salina de extracción de glicina-fosfato. La detección de los tres viroides fue exitosa cuando las reacciones de RT se efectuaron con 2.0 μg de ARN, 1.0-1.5 mM de dNTP’s, 0.90 μM, del iniciador complementario (C) para CEVd, y 0.49 μM para los correspondientes iniciadores C para CVd II y CVd III, respectivamente, seguidas por reacciones de PCR con 2-4 μL de cADN procedente de RT y 10, 5, 5 pmoles del juego de iniciadores homólogos (H) y C para CEVd, CVd II y CVd III. Al usar menos de 1.0 μM de dNTP’s, así como cantidades iguales de los iniciadores C en las reacciones de RT y cantidades iguales del juego de iniciadores C y H para CEVd and CVd II y CVd III en las reacciones de PCR, proporcionaron detección simultánea confiable para CVd II y CVd III, pero resultados erráticos con CEVd.
Palabras clave: Citrus cachexia; citrus exocortis; extracción de ácidos nucleicos; polivinilpirrolidona
LITERATURA CITADA
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Received: September 2005; Accepted: September 2006
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