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Introducción
El género Piper (Piperaceae) es un género pantropical de amplia distribución en el Neotrópico (Jaramillo & Manos, 2001; Quijano-Abril et al., 2013). En la flora peruana existen más de 700 especies de dicho taxón distribuidos principalmente en la selva peruana (Brako & Zarucchi, 1993). El genero presenta una amplia variedad de componentes químicos, como sesquiterpenos, monoterpenos, fenilpropanoides, benzenoides, flavonoides y alcaloides (Maia et al., 1987; Martins et al., 1998; Parmar et al., 1998; Pessini et al., 2003; Lock & Rojas, 2004; Soto-Vásquez, 2015), por lo que son medicinalmente importantes y han mostrado tener actividades antibacteriana, antioxidante y antifúngica (Tirillini et al., 1996; Lentz et al., 1998; Kloucek et al., 2005). En el Perú, una de las especies más utilizadas en la medicina tradicional de la Amazonia peruana es Piper aduncum L., conocida con los nombres vulgares de “matico” o “cordoncillo” (Soukup, 1987), es un pequeño árbol de 4 m de altura de tallo verde, glabro, hojas alternas, simples de forma ovada, oblicuamente atenuada en la base, con nervadura pinnada y asimétrica. Inflorescencia en espigas de forma alargada y curvada hacia el ápice de las ramas, de color blanco y fruto tipo drupa (Mejía & Rengifo, 2018). La especie tiene una amplia distribución en una variedad de ambientes de la selva del país, desde los 50 hasta los 2800 m y se comercializa en los mercados locales del país (Mejia & Rengifo, 2018; Silva-Alarcón et al., 2019), tiene propiedades como neuroprotectora (Zaa et al., 2012), gastroprotectora, antitumoral (Arroyo et al., 2013, 2014) y cicatrizante (Paco et al., 2016). P. aduncum contiene una variada composición en alcaloides, compuestos fenólicos, especialmente flavonoides, taninos y aceites esenciales (Lock & Rojas, 2004; Soto-Vásquez, 2015). Son importantes los aportes de los estudios anatómicos especializados en las especies de valor medicinal del género Piper, incluyendo el reconocimiento microquímico de sustancias (Nascimento & Vilhena-Potiguara, 1999; Silva & Machado, 1999; Pessini et al., 2003; Souza et al., 2004; Albiero, de Souza, et al., 2005; Albiero, Paoli, et al., 2005; Albiero et al., 2006; dos Santos et al., 2015, 2018; de Oliveira Machado et al., 2017). Para P. aduncum se tiene un primer reporte de Vianna y Akisue (1997, citado por (Pessini et al., 2003) quienes tratan la morfología y estructura interna de la especie. Dousseau et al. (2014), en un estudio referido a plantas umbrófilas de ambientes boscosos, caracterizaron anatómicamente la hoja de P. aduncum como bifacial e hipoestomática, con presencia de estomas tetracíticos e idioblastos oleíferos, realizando algunas pruebas histoquímicas de las hojas. En ambos trabajos no se realizaron mediciones morfométricas de los tejidos foliares y sus resultados difieren en algunos detalles de la estructura interna foliar descrita como la naturaleza de la capa subepidérmica, además de no incluir el estudio de la anatomía caulinar y radical de la especie. No hay estudios anatómicos de los órganos vegetativos de especímenes de P. aduncum procedentes de su hábitat natural en la Amazonía peruana. Los estudios anatómicos revelan la influencia que puede ejercer el medio ambiente en la morfología y estructura interna de las plantas (Artiaga de Santiago et al., 2001; Dousseau et al., 2014). Se requiere verificar las características diagnósticas de nuestros ejemplares nativos de P. aduncum debido a que estas son especialmente relevantes para el reconocimiento farmacognóstico e identidad de la especie y evidencia su potencial como fitomedicamento. El objetivo del presente estudio fue determinar las características histológicas e histoquímicas en los órganos vegetativos, raíces, tallos y hojas de especímenes de P. aduncum que crecen en la selva peruana, que puedan servir para su reconocimiento y ser incorporadas en un futuro control de calidad de la droga vegetal.
Materiales y métodos
Colecta del material
Material fresco consistente en cinco muestras de las raíces laterales y cinco ramas de tallos con hojas de Piper aduncum fueron recolectadas de 3 especímenes procedentes de áreas abiertas de la cuenca baja del río Tulumayo, Distrito de la Merced, Provincia de Chanchamayo, Departamento de Junín, a una altitud promedio de 1259,6 m y entre las coordenadas geográficas 11° 21' 59.6'' latitud sur, 75 °16' 15.04'' longitud Oeste y 11° 18' 17.61’ latitud sur, 75° 18' 22.70'' longitud Oeste. La identificación de la especie se realizó mediante la consulta de la literatura especializada (Trelease, 1950; Vásquez et al., 1997) y la comparación con muestras existentes en el Herbario de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (USM).
Estudio histológico
Cinco muestras representativas de la parte media de raíces laterales, entrenudos de tallos y hojas adultas intermedias de tres individuos de la especie, se fijaron en FAA (formaldehído, ácido acético glacial, etanol al 96% y agua 10:5:35:50) conservándose posteriormente en etanol al 70%. Se realizaron cortes a mano alzada, transversales y longitudinales radiales de tallos y raíces, cortes transversales y paradermales de hojas, todos ellos fueron aclarados en hipoclorito de sodio 50%, lavados, colocados en hidrato de cloral 5%, lavados y teñidos ya sea con safranina o con azul de toluidina, ambos al 1% (D’ Ambrogio de Argüeso, 1986). Para el reconocimiento de elementos vasculares y esclerenquimáticos del tallo se empleó el método de Jeffrey, sumergiendo fragmentos de tallos en una mezcla a 50° C en partes iguales de ácido nítrico y ácido crómico al 10%, lavados y teñidos con safranina al 1% (D’ Ambrogio de Argüeso, 1986). Para la observación de la epidermis y la vascularización foliar se realizaron diafanizados de hojas utilizando hidróxido de sodio al 5% (Dizeo de Strittmatter, 1973), los que fueron teñidos con azul de toluidina al 1%. Para el cálculo del índice de empalizada, que determina la cantidad de células del parénquima en empalizada subyacentes a grupos de cuatro células epidérmicas (Albrecht et al., 2005), en las hojas diafanizadas se hizo el recuento por triplicado de células parenquimáticas clorofilianas en empalizada comprendidas en grupos de 4 células epidérmicas y el valor es expresado en número de células del parénquima por célula epidérmica. Para la determinación en las hojas del número medio de estomas por milímetro cuadrado de epidermis foliar y el índice de estomas, que es el porcentaje de células epidérmicas transformadas en estomas (Evans, 1991), fueron en medidos en 10 campos visuales a 400 aumentos por triplicado. Para la caracterización morfométrica de las estructuras internas de los órganos vegetativos se hicieron por individuo 10 mediciones microscópicas de los tejidos por triplicado, con datos promedios y desviación estándar. Se tomaron microfotografías a 100 y 400 aumentos en microscopio con cámara incorporada Leica modelo CME (Leica-Microsystem, Wetzlar, Germany). La descripción del patrón de nervadura foliar según la literatura especializada (Hickey, 1973; Ash et al., 1999).
Reconocimiento fitoquímico preliminar y pruebas microquímicas en tejidos
Para la preparación del extracto etanólico procedentes de las hojas, se colectaron 5 kg de material fresco, se estabilizaron en estufa a 40 C° por cinco días (Lock, 1994), una vez secos y trozados, 50 g del material fueron puestos a macerar en etanol al 96% por ocho días. Con el residuo del extracto filtrado y desecado en estufa a 40 °C (5g), se procedió a la aplicación de diferentes pruebas químicas para el reconocimiento preliminar de metabolitos secundarios: alcaloides (pruebas de Dragendorff y Mayer), flavonoides (prueba de Shinoda), saponinas (prueba de espuma), taninos (pruebas de cloruro férrico y gelatina), quinonas (prueba de Bornträger), esteroles (prueba de Liebermann) y aceites esenciales (aroma), todas estas pruebas se realizaron según Lock (1994). Para el reconocimiento histoquímico de metabolitos de interés en tejidos de raíces, tallos y hojas al estado fresco, se realizaron cortes transversales de los mismos y se ensayaron los reactivos de Lugol (almidón), floroglucinol (lignina), cloruro férrico 1% (taninos), ácido sulfúrico (esteroles), Sudán III (lípidos) y Dragendorff (alcaloides), todos los ensayos según D’Ambrogio (1986) y Lock (1994).
Resultados
Anatomía radical
La raíz lateral presenta una estructura secundaria en transición marcada por el desarrollo del tejido vascular secundario, una capa epidérmica suberizada en la superficie externa y una zona cortical con agrupaciones variables de braquiesclereidas de forma irregular ubicadas hacia la parte externa de la corteza (Fig. 1B). Parénquima cortical con escasos almidones simples de forma poliédrica de 18 µm de diámetro. Idioblastos secretores de formas oblongas a elipsoidales y de 100 µm de diámetro mayor, de contenido amarillento y aromáticos, estos se presentan abundantes en la corteza y otros de menor tamaño, pero escasos son visibles en el floema secundario (Fig. 1C). El tejido vascular es delimitado externamente por una delgada capa endodérmica, presenta un floema secundario con pequeñas agrupaciones de fibras floemáticas y escasos idioblastos, de menor tamaño que los corticales; el cambium vascular siguiendo un contorno ondulado y un fuerte desarrollo del xilema secundario, con predominio de vasos de amplio diámetro. En sentido radial, hacia la zona medular, se presentan radios pluriseriados de una amplitud variable, 4 a 8 filas de células correspondientes al parénquima xilemático, de carácter reservante con abundantes almidones simples de forma poliédrica. Escasos vasos del xilema primario se presentan reducidos y colapsados en el límite interno con la médula. En el centro de la raíz, la zona medular es estrecha y sus células presentan rasgos de lignificación en sus paredes (Fig. 1D).
Fig. 1 Anatomía radical de Piper aduncum : A, vista general de la planta. B, Sección transversal de la raíz secundaria. C, idioblastos y braquiesclereidas en la corteza radical. D, detalle del xilema secundario y la zona medular. Epidermis suberizada (Eps); parénquima (Pa); braquiesclereidas (Esc); idioblasto (Id); fibras floemáticas (Fb); xilema secundario (Xi2°); xilema primario (Xi°); radio medular (Rm). Barra A, 20 cm. B-D, 20 µm.
Anatomía caulinar
El tallo presenta en sección transversal una forma cilíndrica y estructura primaria con desarrollo atípico del tejido vascular, en la forma de doble hilera de haces vasculares colaterales (Fig. 2A). Epidermis uniestratificada de paredes externas de contorno convexo y con una gruesa cutícula su pared externa, Con tricomas tectores pluricelulares escasos. Corteza con varias capas de parénquima clorofiliano, escasos idioblastos secretores e idioblastos con rafidios de oxalato cálcico. Almidones simples y pequeños se observan hacia el interior de la corteza. Paquetes alargados de células colenquimáticas, con engrosamiento en las aristas celulares Agrupaciones alargadas de fibras de esclerénquima, subyacentes al colénquima en la corteza interna (Fig. 2B). Tejido vascular en doble hilera, uno externo, compuesto de grandes haces vasculares colaterales periféricos, alargados que alternan en tamaño y otro interno, formado numerosos haces vasculares internos mas pequeños, hacia la zona medular. En el tejido vascular externo el floema se dispone en la parte externa, con escasos agrupamientos de fibras floemáticas, esclereidas e idioblastos secretores más parénquima floemático. Presencia de una delgada capa de tejido meristemático y desarrollo de una gruesa zona de xilema primario con fibras xilemáticas, de un contorno sinuoso hacia la parte interna, en la periferia con la zona medular. Radios medulares pluriseriados, de 5 células parenquimáticas, lignificadas y de 300 µm de diámetro en el anillo periférico principal y de 7 a 9 células parenquimáticas y 227,2 µm de diámetro en los haces medulares. Haces vasculares medulares dispuestos en forma de un anillo periférico interno hacia el límite de la zona medular y con vasos xilemáticos de un mayor diámetro comparado con los vasos de los haces vasculares externos (Fig. 2C). La zona medular es muy amplia, con presencia de células parenquimáticas de paredes delgadas, escasos idioblastos cristalíferos ubicados entre las células del parénquima medular, conteniendo finos cristales aciculares (rafidios) de oxalato cálcico de 4 µm de longitud e idioblastos secretores, de paredes engrosadas y 72,5 µm de diámetro (Fig. 2D).
Fig. 2 Anatomía caulinar de Piper aduncum: A, Sección transversal del tallo. B, detalle de la porción externa del tallo. C, haces vasculares medulares (Hvm). D, zona medular del tallo. Epidermis (Ep); corteza (Co); colénquima (Col); fibras corticales (Fc); braquiesclereidas (Esc); haz vascular principal (Hv); floema (Fl); xilema (Xi); idioblasto secretor (Id); rafidios (Ra); parénquima medular (Pm). Barra, A-D, 20 µm.
En los macerados del tallo se reconocieron elementos esclerenquimáticos de tipo braquiesclereida, de paredes secundarias engrosadas y punteaduras ramificadas (Fig. 3A). Dos tipos de fibras, unas de corta longitud, de paredes delgadas y abundantes puntuaciones (Fig. 3B ) y otras de gran longitud, gruesas paredes y escasas puntuaciones (Fig. 3C), siendo la primera destacable por su mayor abundancia en los macerados. Vasos uniperforados de xilema de tipo anillados, espiralados, escaleriformes y punteados (Figs. 3 D-F), siendo abundantes los tres últimos. Las dimensiones morfométricas de los principales elementos esclerenquimáticos y xilemáticos en el macerado del tallo se presentan en la Tabla 1.
Fig. 3 Elementos celulares en el macerado del tallo de Piper aduncum: A, braquiesclereidas (Esc). B, fibra xilemática (Fx). C, fibra cortical (Fc). D, vasos anillados (Va) y espiralado (Vesp). E, vaso escaleriforme (Vesc). F, vaso punteado (Vp). Barra A-F, 20 µm.
Tabla 1 Mediciones de los principales elementos celulares en el macerado del tallo de Piper aduncum.
| Elementos celulares | Ancho | Longitud |
|---|---|---|
| Vasos reticulados | 64,1 ± 8,2 | 911,4 ± 61,2 |
| Vasos escaleriformes | 38,2 ± 6,4 | 1083,3 ± 121,1 |
| Fibras corticales | 15,0 ± 2,7 | 2364,0 ± 594,9 |
| Fibras xilemáticas | 12,2 ± 2,1 | 2300,0 ± 578,8 |
| Vasos espiralados | 25,9 ± 7,9 | - |
| Esclereidas | - | 50,6 ± 18,5 |
| Parénquima xilemático | - | 109,6 ± 16,2 |
| Idioblastos | - | 38,3 ± 5,8 |
Anatomía foliar
En corte transversal la lámina foliar presenta una estructura bifacial de 212,5 µm de espesor, con una cutícula delgada (1,8 µm) y una epidermis uniestratificada con células de formas variables; las células epidérmicas adaxiales de formas alargadas y estrechas, de mayor tamaño (10,3 µm) que las células abaxiales de forma cuadrangulares alargadas (6,7 µm). Presencia de tricomas pluricelulares en ambas superficies foliares: tectores y glandulares; los primeros de forma cónica, tamaño variable y predominantes a nivel de la nervadura central (Fig. 4B); los segundos, de forma globosa o sacciformes, se presentan escasamente en la lámina (Fig. 4E). Capas subepidérmicas de células, sin plastidios, ubicadas hacia ambas superficies: la superior, situada por debajo de la epidermis adaxial, formado por una doble hilera de células cuadrangulares de 11,8 µm de ancho. La inferior, adyacente a la epidermis abaxial, está formada por una hilera de células alargadas y de tamaño irregular. Estomas presentes sólo en la superficie abaxial y están a ubicados mismo nivel que las células epidérmicas. El mesófilo está compuesto por una doble capa de parénquima clorofiliano en empalizada hacia el lado superior y dos a tres estratos de parénquima clorofiliano esponjoso hacia el lado inferior. Haces conductores colaterales cerrados en el medio del mesófilo. Idioblastos secretores de 22,7 µm de diámetro, con un contenido amarillento, se localizan en la parte media e inferior del mesófilo (Fig. 4C). La nervadura principal presenta hacia ambas superficies externas refuerzos subepidérmicos de colénquima angular y en la parte central se disponen de 2 a 3 haces conductores colaterales de forma convexa rodeados de escasas fibras; cristales aciculares de oxalato cálcico se presentan abundantes en el parénquima de la nervadura central (Fig. 4B).
En la vista paradermal, las células epidémicas adaxiales son de formas poligonales y 20,1 µm de diámetro (Fig. 4D). Células epidérmicas abaxiales tienen forma de polígonos irregulares de 19,8 µm de longitud (Fig. 4E). Los estomas tuvieron 15 µm de diámetro mayor y fueron de 2 tipos: a) anomocítico y b) tetracítico. El número medio de estomas fue de 760 estomas/mm2 y el índice estomático de 7,84. El índice del parénquima en empalizada fue de 13,3. Los principales caracteres morfométricos de la lámina foliar se resumen en la Tabla 2. El patrón de nervaduras es pinnatinervio, de tipo eucamptodromo (Fig. 4A). Las ramificaciones se presentan en forma anastomosada, con ramificaciones de 1° al 5°orden. Las venas secundarias alternas a la vena primaria y curvada hacia el ápice del limbo, con un espaciamiento entre ellas que decrece gradualmente hacia la base. Venas secundarias basales llegan a ser marginales hacia el exterior de la lámina, recurvándose y formando bucles. Venas terciarias discurren paralelamente entre ellas y son perpendiculares a la vena principal, estas venas cruzan transversalmente a las venas secundarias y sin llegar a ramificarse, forman con las venas de 4to orden aréolas poligonales bien definidas. Vénulas de 5° orden finamente ramificadas e inconclusas, no llegan a los límites de las areolas formadas (Fig. 4F).
Fig. 4 Anatomía foliar de Piper aduncum: A, vista general de la hoja. B-C, corte transversal de la lámina. D-E, vista paradermal de la lámina. B, nervadura principal de la lámina. C, Mesófilo. D, superficie adaxial. E, superficie abaxial. F, detalle de la nerviación anastomosada y venas de 3° a 5°. Rafidios (Ra); Haz vascular (Hv); colénquima (Col); tricoma tector (Tt); epidermis adaxial (Ead); epidermis abaxial (Eab); estoma (Est); mesófilo (Me); capa subepidpérmica (Cs); idioblasto secretor (Id); tricoma glandular (Tg); estoma (Est). Barra, A, 1 cm. B-F, 20 µm.
Tabla 2 Caracteres morfométricos foliares de Piper aduncum. (Promedio ± D.E; n = 30)
| Parámetros epidérmicos | Diámetro |
|---|---|
| Células epidérmicas adaxiales (µm) | 20,1 ± 3,6 |
| Células epidérmicas abaxiales (µm) | 19,8 ± 4,3 |
| Células oclusivas del estoma (µm) | 15,0 ± 1,2 |
| Número de estomas (estomas/mm2) | 760,0 ± 74,3 |
| Índice estomático | 7,84 ± 0,63 |
| Índice de empalizada | 13,3 ± 2,2 |
Reconocimiento fitoquímico y microquímico preliminar
En las pruebas fitoquímicas del extracto etanólico de las hojas se reconocieron alcaloides como finos precipitados color naranja (prueba de Dragendorff) o blanquecino (prueba de Mayer). Flavonoides se reconocieron por cambios de coloración rosada efervescente (prueba de Shinoda). Se detectaron cantidades apreciables de esteroles (coloración verde oscura con la prueba de Lieberman), saponinas (cantidad de espuma), aceites (olor sui generis) y taninos (fino precipitado marrón oscuro con el tricloruro férrico); mientras que la prueba para quinonas fue negativa (Tabla 3). En la prueba microquímica con el Lugol se reconocieron finos granos de almidón de color azul en las células corticales y en los radios medulares de raíces (Fig. 5A), así como en el parénquima cortical del tallo (Figura 5B). Con la prueba de floroglucinol se reconocieron positivamente de color rosado en raíces los elementos lignificados: fibras de esclerénquima, braquiesclereidas y elementos del xilema secundario, con la misma prueba en el tallo se reconocieron las fibras corticales y elementos lignificados del xilema; en la zona medular las paredes engrosadas de los idioblastos secretores dieron positivo a la reacción (Fig. 5C). La prueba de Sudán III fue negativa para substancias lipídicas en tallos y raíces mientras que para hoja sirvió para reconocer la cutícula de un color rojizo. Con la prueba de Dragendorff se reconocieron positivamente alcaloides como finas precipitaciones de color naranja en los idioblastos de la zona cortical de raíces (Fig. 5D) e idioblastos del mesófilo y nervadura central de la hoja, mientras que en los tallos la prueba fue negativa. Con el tricloruro férrico se reconocieron taninos como precipitados de coloración oscura en el mesófilo foliar (Fig. 5E), siendo la prueba negativa para tallos y raíces. Con la prueba del ácido sulfúrico se reconocieron esteroles de un color verdoso en el parénquima cortical de raíces, células corticales y parénquima xilemático de tallos (Fig. 5F) y en el mesófilo de las hojas (Fig. 5G); con la misma prueba se reconocieron triterpenoides de un color rojizo-naranja en los idioblastos de la corteza de la raíz (Fig. 5H).
Tabla 3 Fitoquímica del extracto alcohólico de las hojas de Piper aduncum.
| Prueba | Metabolito secundario | Cantidad |
|---|---|---|
| Dragendorff | Alcaloides | ++ |
| Mayer | Alcaloides | +++ |
| Shinoda | Flavonoides | +++ |
| Índice de espuma | Saponinas | + |
| Cloruro férrico | Fenólicos | ++ |
| Olor | Aceites | + |
| Gelatina | Taninos | - |
| Liebermann | Esteroides | + |
| Bornträger | Quinonas | - |
(-) = Ausente (+) = Poca cantidad
(++) = Regular cantidad (+++) = Abundante cantidad
Fig. 5 Reconocimiento microquímico en los órganos vegetativos de Piper aduncum: A, almidones en la raíz. B, almidones en la corteza del tallo. Elementos lignificados en la estructura del tallo. D, alcaloides en idioblasto de la raíz. E, taninos en el mesofilo foliar. F, esteroles en el tallo. G, esteroles en la hoja. H, triterpenoides en idioblasto del tallo. Corteza (Co); floema secundario (Fl2°); xilema secundario (Xi2°); xilema primario (Xi); radio medular (Rm); almidón (Alm); haz vascular principal (Hv); haz vascular medular (Hvm); médula (Me); mesófilo (Me); idioblasto (Id); braquiesclereida (Esc); tricoma glandular (Tg); tricoma tector (Tt); parénquima (Pa). Barra, A-H, 20 µm.
Discusión
El desarrollo secundario de las raíces de Piper aduncum tiene la característica de presentar una epidermis con rasgos suberizados. Esta característica hallada es también mencionada por Vianna y Akisue para la misma especie (1997, citado por (Albiero et al., 2006). Si bien señalan para las Piperaceae la presencia común de peridermis (Metcalfe & Chalk, 1957), en las raíces secundarias, en raíces de P. hispidinervium Piper regnelli y P. crassinervium no se ha reportado su presencia (Nascimento & Vilhena-Potiguara, 1999; Pessini et al., 2003; Albiero et al., 2006). La presencia de una epidermis suberizada en la corteza puede observarse en el desarrollo secundario de algunos tipos de raíces secundarias (Esau, 1977). Las braquiesclereidas de las raíces son constantes para P. aduncum, como lo confirma el reporte de Vianna y Akisue para las raíces de la especie (1997, citado por (Pessini et al., 2003). Los idioblastos secretores en la raíz, con su contenido de color amarillo claro y el aroma característico, están asociados a la presencia de compuestos terpénicos como los reportados por Dousseau et al. (2014) para la hoja de la misma especie. El desarrollo y almacenamiento del almidón así como los radios medulares pluriseriados son comunes en las raíces secundarias de especies arbustivas del género Piper (Albiero, Paoli, et al., 2005; Albiero et al., 2006), en P. aduncum comprobamos que, a diferencia de la corteza, son los radios medulares los que adquieren un carácter marcadamente reservante de almidones simples, cuyas formas poliédricas y dimensiones registradas pueden ser de carácter diagnóstico si los comparamos con otras especies del género. No se encontraron cristales de oxalato cálcico en los tejidos de la raíz, condición que comparte P. aduncum con algunas especies como P. regnelli y P. hispidum (Pessini et al., 2003; Albiero et al., 2006), en tanto otras especies como P. crassinervium si las presentan (Albiero, Paoli, et al., 2005).
A nivel del tallo, uno de los rasgos histológicos más relevantes de P. aduncum lo constituyen los haces vasculares en la zona medular del tallo, los cuales son considerados una evidencia de un crecimiento atípico propio de las Piperaceae y otras familias botánicas (Metcalfe & Chalk, 1957). Las Piperaceae son conocidas anatómicamente por la disposición de su sistema vascular primario en la forma de un doble anillos de haces vasculares que semeja a los tallos de monocotiledóneas y por ello su temprana consideración como una angiosperma basal (Jaramillo & Manos, 2001). Si bien el patrón de doble hilera de haces vasculares es común en los tallos de las especies del género Piper, encontramos que el número de los haces medulares observado en P. aduncum es diferente a los observados para los tallos de especies afines como P. crassinervium, P. gaudichaudianum y P. hispidum (Albiero, Paoli, et al., 2005; Albiero, de Souza, et al., 2005; Albiero et al., 2006); sin embargo, no podría considerarse un carácter diagnóstico debido a que las diferencias en el desarrollo caulinar son atribuidos al grado de madurez y el mayor engrosamiento de los tallos (Evert & Esau, 2008). La presencia de paquetes de fibras corticales observados en P. aduncum resultan constantes en la estructura caulinar de varias especies del género Piper. Albiero et al. (2005) afirman para el tallo de P. gaudichaudianum que estas fibras proceden de la lignificación progresiva de las células colenquimáticas adyacentes. Son también características comunes de P. aduncum con respecto a las especies del clado Enckea, la presencia del colénquima angular, las esclereidas de la zona floemática y los rafidios de oxalato cálcico (Quijano-Abril et al., 2013). En las especies de Piper son comunes en la estructura caulinar la presencia de idioblastos secretores, en P. aduncum este tipo de células ubicadas en la médula presentan sus paredes lignificadas, como lo comprueba la reacción positiva de floroglucinol.
Entre los elementos celulares del macerado del tallo de P. aduncum destacan por sus mayores dimensiones los vasos del xilema punteados y escaleriformes. Entre los elementos esclerenquimáticos se reconocieron a las fibras xilemáticas como aquellas que se presentaron en mayor cantidad y se distinguieron por su menor longitud, menor ancho y mayor cantidad de punteaduras comparadas con las fibras corticales, de tamaño mas largo y mas gruesas. En particular las fibras xilemáticas son típicas del xilema de las plantas y son consideradas caracteres diagnósticos para muchas especies (Evans, 1991; Evert & Esau, 2008). Las escasas braquiesclereidas registradas corresponde a las ubicadas en el floema de la sección transversal del tallo y su presencia es común en la estructura caulinar de las especies del género Piper (Quijano-Abril et al., 2013). No encontramos reportes de este tipo de elementos celulares del tallo por lo que constituyen un primer registro para P. aduncum.
Los tricomas tectores fueron los más abundantes, alcanzando un tamaño variable en su desarrollo, mientras que los glandulares fueron más escasos y uniformes en su forma globosa, esto último concuerda con Dousseau et al. (2014) quien afirma además que los tricomas sacciformes pueden llegan a ser de tipo pedunculados. Los tricomas tectores y glandulares hallados son comunes para varias especies del género (Albiero, de Souza, et al., 2005; Albiero, Paoli, et al., 2005). Es de especial importancia los tricomas glandulares, que conjuntamente con los idioblastos secretores del mesófilo, están en relación a la presencia de compuestos terpénicos, responsables del aroma característico de la especie y que han sido reportados por Dousseau et al. (2014). La hoja bifacial de Piper aduncum es característica de las Piperaceae (Metcalfe & Chalk, 1957). El reporte del parénquima en empalizada biestratificado es consistente con lo reportado para la misma especie por Gogosz et al. (2012), sin embargo, contrasta con Dousseau et al. (2014) quienes mencionan como característico de P. aduncum la presencia de una capa de parénquima en empalizada y le atribuyen mas bien una mayor variabilidad al número de capas del parénquima esponjoso. Especies afines como Piper hispidinervium, P. crassinervium, P. gaudichaudianum, P. hispidum y P. solmsianum presentan una o dos capas celulares en el parénquima en empalizada (Nascimento & Vilhena-Potiguara, 1999; Albiero, Paoli, et al., 2005; Albiero, de Souza, et al., 2005; Albiero et al., 2006; Bertocco et al., 2017), esta diferencia puede ser atribuida a la calidad de la luminosidad en los diferentes hábitats en que se desarrollan las especies y que influyen en la conformación del mesófilo foliar (Gogosz et al., 2012), en ese sentido el registro del índice de empalizada, expresado como la relación del número de células del parénquima clorofiliano en empalizada en función de las células epidérmicas (Evans, 1991), es señalada como una medida morfométrica que puede diferenciar a P. aduncum de las especies afines del género. Metcalfe & Chalk (1957) reportan para las Piperaceae hasta tres tipos de cristales de oxalato cálcico. Para las especies del género Piper, predominan los rafidios (Albiero, de Souza, et al., 2005; Albiero, Paoli, et al., 2005; Bertocco et al., 2017). P. aduncum presenta rafidios a nivel de la nervadura central de la hoja y por ello confirmamos los reportes de Vianna y Akisue (1997, citado por (Dousseau et al., 2014) y Dousseau et al. (2014).
La presencia de las capas sub-epidérmicas hialinas en ambas superficies foliares es una característica de P. aduncum, destacando por su mayor envergadura la capa sub-epidérmica adaxial que es biestratificada. Estas capas sub-epidérmicas han sido descritas tempranamente como una hipodermis para las especies del género Piper (Metcalfe & Chalk, 1957) y su naturaleza uni o biestratificada es registrada por diversos autores que han tratado la anatomía foliar de las especies del género (Nascimento & Vilhena-Potiguara, 1999; Albiero, Paoli, et al., 2005; Albiero, de Souza, et al., 2005; Albiero et al., 2006; Bertocco et al., 2017). En base a un estudio anatómico de ontogenia foliar de especies de Piper, incluyendo P. aduncum,Nakamura et al. (2015) proponen la denominación de hipodermis. A diferencia de nuestro reporte, Dousseau et al. (Dousseau et al., 2014) describe para P. aduncum una capa sub-epidérmica (hipodermis) uniestratificada. Esta capa su-epidérmica es considerada variable en su desarrollo debido a la influencia que ejerce el medio ambiente (Duarte & Siebenrock, 2010; dos Santos et al., 2015, 2018) y también le atribuyen un carácter diagnóstico para las especies de Piper (Nakamura et al., 2015).
En la superficie foliar, la disposición de los estomas hacia la cara abaxial y la presencia de los tipos de estomas anomocíticos y tetracíticos coincide con las observaciones reportadas para P. Aduncum por Vianna y Akisue (1997, citado por (Dousseau et al., 2014), otros reportes para la misma especie sólo reportan estomas tetracíticos. (Dousseau et al., 2014) solo reportan estomas tetracíticos para la especie. Otros tipos de estomas como los ciclociticos y anisociticos han sido reportados para las especies del género Piper como P. diospiryfolium, y P. hispidinervium (Nascimento & Vilhena-Potiguara, 1999; Souza et al., 2004). Todo ello revelan una variabilidad que lo hacen difícil de considerar como carácter diagnóstico. El número estomático en la superficie abaxial de la hoja de P. aduncum (760.0 est/mm2), refleja la alta densidad estomática que presenta esta especie y está en relación a su hábitat húmedo, propio de los bosques secundarios donde se desarrolla habitualmente, sin embargo este valor suele ser afectado por el medio ambiente (Gogosz et al., 2012), por lo que el registro del índice estomático y el índice de empalizada se señalan como características constantes y pueden ser útiles para la identificación microscópica (Evans, 1991). No hay reportes previos de estas medidas morfométricas foliares para P. aduncum, por lo que este estudio constituye su primer registro y permitirá diferenciarlas de las especies afines del género.
El número de haces colaterales de la nervadura central disminuye desde la base hacia el ápice, esto concuerda con las observaciones de Dousseau et al. (2014). El patrón de nervadura eucamptodroma (Ash et al., 1999), a nivel de la nerviaciones de 1° y 2° orden, es consistente en las muestras de hojas estudiadas en varias de las especies del género Piper (Tebbs, 1993), sin embargo es notable en P. aduncum la variabilidad observada a nivel de las nervaduras terciarias, donde el patrón formado por este tipo de nervaduras, dispuestas en ángulo recto con respecto a la vena primaria y cercanamente paralelos entre ellas, es similar a lo reportado para P. aduncum subespecie Ossanum (Abreu Guirado et al., 2012) y marcadamente diferente a lo observado para la misma especie por Dousseau et al. (2014). Se requiere profundizar en los estudios sobre la arquitectura foliar en las especies del género debido a que se reconoce que la morfología en la familia Piperaceae puede llegar a ser muy compleja (Jaramillo & Callejas, 2004).
En este estudio fue verificado el perfil fitoquímico para las hojas y tallos de Piper aduncum con el reconocimiento de alcaloides, esteroles, terpenos, flavonoides y taninos (Tabla 3) lo que concuerda con estudios previos de la especie (Lock & Rojas, 2004; Soto-Vásquez, 2015). Histoquimicamente se corroboró también la presencia de alcaloides en los tejidos de tallos y raíces así como de esteroles y compuestos terpénicos en tallos y hojas, en estos últimos de una forma muy clara y en concordancia con lo reportado por otros autores (Dousseau et al., 2014). Compuestos triterpenoides fueron reconocidos en idioblastos de tallos y raíces, aunque no en las hojas. Los almidones reconocidos fueron de tipo simple y se registraron abundantes en la raíz y en menor cantidad en el tallo. La presencia de elementos esclerenquimáticos y vasos xilemáticos fueron reconocidos positivamente con la prueba de floroglucinol en raíces y tallos. Así mismo con este reactivo se verificó la naturaleza lignificada de las paredes engrosadas de los idioblastos secretores del parénquima medular. La presencia de idioblastos de paredes lignificadas no han sido reportados para P. aduncum, sin embargo (Evert & Esau, 2008) menciona que es este tipo de células suelen presentarse en la medula de tallos.
Conclusiones
En este estudio establecemos, en base a las descripciones y mediciones morfométricas realizadas, el reporte de las características histológicas para los órganos vegetativos de especímenes de Piper aduncum que se desarrollan en la Amazonia peruana, consistente en la presencia de almidones simples de forma poliédrica e idioblastos secretores en las raíces, elementos xilemáticos y esclerenquimáticos en los macerados del tallo así como los índices estomático y del parénquima de empalizada determinados para la hoja, todos los cuales constituyen caracteres diagnósticos que pueden ser empleados en la diferenciación de P. aduncum con otras especies afines del género.
