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Introducción
El cultivo de cacao (Theobroma cacao L.) de importancia agroalimentaria, por ser fuente comercial para la elaboración de chocolate y manteca, que derivan de sus semillas (Sánchez et al., 2019), produce sus flores en el tronco principal y en ramas laterales durante todo el año. Las flores son hermafroditas de ovario supero y nacen agrupadas en sectores denominados cojines florales. El botón floral se abre en un periodo de 25 a 30 días después de su emergencia y su apertura inicia por la tarde, para que a la mañana siguiente esté completamente viable para la polinización. La flor que no es fecundada se cae del árbol en un periodo de 48 horas (Batista, 2009). La polinización es entomófila realizada por dípteros de la familia Ceratopogonidae destacándose el género Forcipomyia ssp. (Alvarado Aguayo et al., 2018, Adjaloo & Oduro, 2013) los cuales son atraídas por el color de los estaminodios y transfieren el polen de las anteras al estigma, penetrando la flor sin ninguna dificultad.
Los frutos de cacao, son el resultado de la maduración del ovario en la fecundación de la flor. Posterior a ello, el desarrollo del fruto y la diferenciación de las estructura que conforma el fruto de cacao, se presenta en las 18 semanas siguientes (Ten Hoopen et al., 2013, Rangel-Fajardo et al., 2012, Cerri & Reale, 2020). Los frutos formados posteriores a la antesis floral, que son infectados por M. roreri, no culminan su desarrollo. La pérdida de frutos de cacao se presenta en las primeras doce semanas de desarrollo, oscila entre 60 y 80%, donde la causa principal es la infección de patógenos fúngicos (Phillips-Mora & Wilkinson, 2007, Torres de la Cruz et al., 2013, Espinosa-García et al., 2015).
La moniliasis del cacao, considerada como la enfermedad fúngica más perjudicial, provoca pérdidas económicas para los productores de cacao (Correa Álvarez et al., 2014). Moniliophthora roreri es considerado el agente causal de esta enfermedad e infecta específicamente a frutos en diferentes estados fenológicos de desarrollo (Phillips-Mora et al., 2005).
Basado en observaciones generales a plantaciones de cacao establecidas, la presencia de frutos enfermos de moniliasis posterior al amarre de los frutos y en las primeras cuatro semanas de desarrollo del fruto (Phillips-Mora & Wilkinson, 2007), hace pensar que el proceso de infección con conidios de M. roreri se llevó a cabo en la etapa de fecundación del óvulo durante la polinización y que el proceso de incubación recurrente fue de tres semanas.
Los objetivos de este trabajo de investigación fueron determinar el mecanismo de formación de frutos enfermos en las primeras etapas fenológicas con infección endógena de ovarios de flores de Theobroma cacao, con M. roreri y el efecto antifúngico del extracto de polen de flor de cacao.
Materiales y métodos
Establecimiento del experimento. La investigación se realizó en una plantación productiva de cacao de tipo trinitario de la variedad Costa Rica (información proporcionada por el productor), ubicada en el Municipio de Cacahoatán, Chiapas a 461 msnm cuyas coordenadas geográficas son N14°54.539 W092°10.897. Está en una zona que es templado - húmedo, con nubosidad variante donde la temperatura oscila de 17 a 33 °C, con una precipitación al año de 304 mm. Con árboles que oscilan de 17 años de edad (todos clones) con una distancia de siembra de 2 x 2.5 m (información proporcionada por el productor), acompañados de árboles maderables.
Infección de la flor de cacao, con Monilliophthora roreri . Para el inóculo se utilizó una cepa clasificada como GNov32 de M. roreri proporcionada por el Instituto de BioCiencias. Se utilizaron 21 árboles en etapa de floración (antesis) en los cuales se seleccionaron flores semi-abiertas receptoras las cuales fueron protegidas para evitar fecundación y contaminación por esporas, y se seleccionó flores donadoras. Se establecieron ocho tratamientos (Cuadro 1). Los ovarios de las flores receptoras se inocularon con conidios de Moniliophthora roreri 1x106mL-1 utilizando una micropipeta (Fig. 1-Izquierda). A cada una de las flores receptoras se le aplicó 20 µl de la solución de conidios, posteriormente se polinizaron de forma manual (Figura 1-Derecha). Se seleccionó la flor donadora con un polen viable de color amarillo crema (menor madurez) o amarillo (maduro). Se quitaron los sépalos y pétalos para que las anteras quedarán libres. Posterior a la inoculación (5 min), las anteras fueron frotadas en el ovario para la colocación de granos de polen sobre la flor receptora. Para evitar contaminación de polen extraño se encerró la flor en un dispositivo transparente, amarrado con listón al tronco o ramas de cada planta procurando no dañar las flores. En la parte apical del dispositivo se colocó una tela, malla tipo mosquitera para permitir el paso del oxígeno, luz y agua que procediera del ambiente, evitando que estas se almacenarán en el dispositivo, y evitar que insectos interfirieran en la polinización. Se monitorean cada semana para revisar la presencia de fruto y determinar que existió fecundación.
Cuadro 1 Tratamientos establecidos en campo.
| Tratamientos | Condición | Polinización | Código |
|---|---|---|---|
| 1 | Inoculación | Con polen crema* | IPC |
| 2 | No inoculación | Con polen crema | SPC |
| 3 | Inoculación | Con polen amarillo ** | IPA |
| 4 | No inoculación | Con polen amarillo | SPA |
| 5 | Inoculación | No polinización | ISP |
| 6 | No inoculación | No polinización | SIP |
*: Menor grado de madurez, **: Mayor grado de madurez
Se determinó el tiempo en que se presentó el primer síntoma en los frutos de cacao, por cada tratamiento, denominado tiempo de incubación (Ti) y la incidencia inicial (Yo). La incidencia de la enfermedad para cada edad (semanas) de la fruta se calculó según la fórmula de incidencia, donde I: es incidencia, nFE: es número de frutos enfermos y nFT: es el total de frutos.
Efecto de antifúngico del extracto alcohólico del polen. Para determinar si el polen que fecunda la flor de cacao tiene alguna propiedad inhibitoria hacia la espora de M. roreri, se estableció lo siguiente: se colectaron flores abiertas del campo con estaminodios cerrados (CER, condición donde no se puede polinizar el ovario) y flores abiertas con estaminodios abiertos (AB, condición donde se puede polinizar el ovario) (Fig. 2). Se colectó el polen de cada condición de la flor, el cual fue de color crema (CREM) y amarillo (AMARI), se presentan en el Cuadro 2. Estos se almacenaron en tubos Eppendorf con 1 mL de alcohol al 70% y se macero con un agitador de vidrio. En medi o de cultivo con ADP a pH de 6 en cajas Petri, se colocaron 100 µL de la solución alcohólica de polen por mL de medio. Se realizó por triplicado y a cada placa se inoculó con 1x106 conidios mL-1 del hongo GNov32 M. roreri., proporcionado por el cepario del Instituto de Biociencias. Se midió diariamente el crecimiento de la colonia con un vernier.
Cuadro 2 Tratamientos establecidos para determinar el efecto antifúngico del extracto de polen en el crecimiento de M. roreri (AB: abiertos, CER: cerrados, CREM: crema, AMARI: amarillo).
| Estaminodios | Color de polen |
|---|---|
| AB | CREM |
| AB | AMARI |
| CER | CREM |
| CER | AMARI |
Análisis estadístico. Se realizó un análisis de varianza a las variables amarre de frutos, incidencia, Yo, Ti e inhibición microbiana, y donde se observaron diferencias se realizó una comparación de medias por Tukey (alfa=0.05). Se aplicó una prueba de “t Student” (p= 0.05) en tratamientos donde existieron frutos enfermos. Se utilizó el software Infostat v. 2015.
Resultados
El grado de madurez del polen en el proceso de fecundación de ovarios de cacao, es un factor importante para el amarre de frutos (F: 6.34, p<0.0138), tal como se observa en el Cuadro 3. El valor obtenido de fecundación de flores en los tratamientos 2 y 4, muestra que el polen amarillo sin presencia de inoculo genera un 8.5% de frutos comparado con el valor de 3.66% del polen crema (una diferencia de 4.84 % entre ellos). En flores inoculadas y con polinización, el amarre de frutos fue de 7.69% con polen amarillo y de 2.92 con polen crema (una diferencia de 4.77 % entre ellos). La presencia de inóculo de M. roreri en la entrada del ovario, no interfirió en el amarre de los frutos (F: 0.54, p=0.4646, Cuadro 4).
Cuadro 3 Porcentaje de fecundación e incidencia de las flores evaluadas por tratamientos.
| Tratamientos | N° F | % Fe total | % I total | TEPS (s) |
|---|---|---|---|---|
| IPC | 205 | 2.92 b* | 33.33 | 3 y 4 |
| SPC | 273 | 3.66 b | 0 | |
| IPA | 195 | 7.69 a | 40.0 | 2, 3 y 4 |
| SPA | 200 | 8.5 a | 0 | |
| ISP | 205 | 0 | 0 | |
| SIP | 273 | 0 | 0 |
F: Flores, Fe: Fecundación, I: Incidencia de frutos enfermos, TEPS: Tiempo en expresarse el primer síntoma,
s: semanas. *letras iguales no hay diferencias significativas.
Cuadro 4 Análisis de varianza de frutos amarrados en la polinización manual, por tipo de polen.
| F.V. | SC | gl | CM | F | p-valor |
|---|---|---|---|---|---|
| Modelo. | 3.82 | 3 | 1.27 | 2.52 | 0.0639 |
| Tipo polen | 3.2 | 1 | 3.2 | 6.34 | 0.0138 |
| Condición | 0.27 | 1 | 0.27 | 0.54 | 0.4646 |
| Tipo polen*condición | 0.34 | 1 | 0.34 | 0.68 | 0.4126 |
| Error | 40.42 | 80 | 0.51 | ||
| Total | 44.24 | 83 |
Condición: inoculación y no inoculación.
La presencia de frutos enfermos en el primer estado fenológico (jovenes-infantil, Fig. 3) es el resultado de la presencia de conidios de M. roreri en la entrada del ovario antes de realizar el proceso de fecundación. La sanidad fue mayor en frutos sin inocular (Cuadro 3, porcentaje de incidencia). El tratamiento polinizado con polen crema presentó un 6.67 % menos incidencia que el tratamiento polinizado con polen amarillo. Acorde a la comparación realizada entre el tipo de polen (t:-1.58, p=0.1217), se determinó que no afecta al proceso de infección de M. roreri en la etapa de amarre del fruto.
Fig. 3 Frutos jóvenes - infantiles enfermos de los tratamientos inoculados (I) y no inoculados (S) de las flores de cacao polinizadas con polen (P) de color crema (C) e amarillo (A) (a: IPC a la 3ra semana; b: IPA a la 3ra semana; c: SPC a la 4ª semana; d: IPA a la 3ra semana; e: IPC a la 4ª semana y f: SPA a la 5ª semana).
Fig. 3 Esquema de sitios donde se estaciona la espora de M. roreri en el ovario de la flor de Theobroma cacao. (1: Próximo al cuello de entrada, 2: en la base del ovario, a: zona donde queda la espora de M. roreri).
La presencia de síntomas en todos los frutos analizados, fue la generación de un color amarillo seguido de una necrosis cercana al pedúnculo o en la parte apical de los frutos infantiles, observado a partir de la tercera y cuarta semana de desarrollo (Cuadro 3). En frutos con síntoma externo, el análisis de daño al tejido interno expuso una necrosis u oxidación del tejido que se origina en el interior del fruto correspondiente a la zona del ápice y cercana al pedúnculo, que avanza al exterior (Fig. 3a, b, d y e). Con lo anterior se proponen los sitios donde se estaciona el conidio después que acompaña (adherido) al tubo germinativo en el proceso de fecundación en el ovario (Fig. 4). Es probable que posterior a la germinación de los conidios se da el avance del micelio en el tejido conforme se desarrolla del fruto.
Efecto de antifúngico del extracto alcohólico del polen
Existió un retrasó en el crecimiento micelial de M. roreri a la exposición de extractos alcohólicos para ambos tipos de polen de flores con estaminodios cerrados (F: 5626.75, p: <0.0001, Cuadro 5), a diferencia del polen de flores con estaminodios abiertos (Fig. 4). El extracto de polen de flor de cacao que mayor efecto inhibitorio ejercio en el crecimiento de la colonia de M. roreri, fue el amarillo (F: 85.98, p: <0.0001). El retraso observado de cuatro días en la formación de la colonia de M. roreri, con extractos de polen de flores con estaminodios cerrados, se traduce a que existió un efecto fungistático.
Fig. 4 Cinética de crecimiento de colonia de M. roreri en presencia de extractos alcohólicos de polen de flores de cacao, alfa = 0.05. (AB: estaminodios abiertos, CER: estaminodios cerrados, CREM: crema y AMARI: amarillo).
Cuadro 5 Análisis de varianza del efecto inhibitorio de los extractos alcohólicos a M. roreri.
| F.V. | SC | gl | CM | F | p-valor |
|---|---|---|---|---|---|
| Modelo. | 292.89 | 44 | 6.66 | 919.31 | <0.0001 |
| Condición | 81.48 | 2 | 40.74 | 5626.75 | <0.0001 |
| Tipo de polen | 0.62 | 1 | 0.62 | 85.98 | <0.0001 |
| Días | 184.88 | 8 | 23.11 | 3191.64 | <0.0001 |
| Condición*Tipo de polen | 0.45 | 1 | 0.45 | 62.66 | <0.0001 |
| Condición*Días | 24.23 | 16 | 1.51 | 209.13 | <0.0001 |
| Tipo de polen*Días | 0.96 | 8 | 0.12 | 16.53 | <0.0001 |
| Condición*Tipo de polen*Días. | 0.26 | 8 | 0.03 | 4.54 | 0.0001 |
| Error | 0.65 | 90 | 0.01 | ||
| Total | 293.54 | 134 |
Discusión
La generación de frutos enfermos de cacao en las primeras semanas de desarrollo, fueron ocasionados por la infección de ovarios maduros con conidios de M. roreri durante el proceso de polinización. La presencia de frutos de cacao enfermos en las primeras semanas de desarrollo coinciden con lo reportado por Phillips-Mora et al., 2005, Phillips-Mora et al., 2006, Sánchez-Mora & Garcés-Fiallos, 2012. La presencia de frutos enfermos en las primeras semanas, podría explicarse por la infección constante en el proceso de polinización que mantiene la prevalencia de la enfermedad en estas edades de desarrollo.
El tiempo de incubación que tuvo M. roreri desde la fecundación del ovario y que generó los síntomas de la moniliasis en los frutos ya formados (osciló de 2 a 4 semanas), depende de la capacidad del conidio para germinar y de la capacidad para penetrar la pared del ovario durante el proceso de transformación a fruto (amarre). El tiempo de incubación de dos semanas difiere de lo reportado por Sánchez-Mora & Garcés-Fiallos, (2012) quienes indican que el tiempo mínimo es de tres semanas. La diferencia en el tiempo de incubación podría explicarse por las características del tejido, donde posiblemente entre menos diferenciación presente existirá un menor el tiempo de incubación.
Nosotros proponemos, basados en los resultados obtenidos, que la infección del ovario de la flor de cacao, durante el proceso de polinización, sucedió cuando el estigma fue contaminado por conidios de M. roreri. La llegada de estos conidios al estigma, podría llevarse a cabo de forma natural por el viento e insectos que visitan la flor (Torres de la Cruz et al., 2013, Adjaloo & Oduro, 2013), o incluso llegar el polen ya contaminado (Bucio Villalobos et al., 2010).
La infección interna probablemente se debió a que los conidios viajaron adheridos al tubo polínico y según el movimiento de estos últimos, el rozamiento con las paredes internas del ovario provoca el desprendimiento del mismo (este evento sucede por cada tubo polínico que fecunda a cada óvulo, acorde al proceso de fecundación descrito por Somarriba Chávez et al., 2010).
Proponemos, basados en los resultados obtenidos que la necrosis interna del fruto en estado juvenil (ápice y cercano al pedúnculo) se relaciona con el alojamiento de los conidios en el ovario durante el proceso de fecundación de los óvulos en el amarre del fruto. Los conidios alojados en la base del lóculo, que provocan mayor daño al fruto, presentan mayor frecuencia comparado con los que se alojaron en la zona próxima a la entrada de los lóculos. La presencia de daño en la parte próxima al pedúnculo del fruto podría explicarse por el efecto de gravedad que atrae a los conidios desprendidos del tubo polínico al fondo del lóculo y probablemente el tegumento interno que cubre a los óvulos y a los lóculos, no permiten la adherencia de los conidios durante el proceso de fecundación. El daño interno (necrosis) del fruto de cacao es ocasionada por el desarrollo de M. roreri avanzando del interior al exterior del pericarpio, descrito por Bailey et al., (2013). Esta necrosis interna se presenta en todas las edades de desarrollo con posterior indicativo de síntoma externo y en algunas ocasiones no se expresa síntoma externo (Sánchez-Mora & Garcés-Fiallos, 2012, Phillips-Mora & Wilkinson, 2007).
La infección con conidios de M. roreri en el proceso de polinización y fertilización del ovario de la flor del cacao, no impide la fecundación de los óvulos y la formación del fruto de cacao. Las propiedades que pueda contener el polen maduro, no afectan la germinación del conidio ni tampoco lo inactivan. Lo anterior se traduce a que conforme presenta más grado de madurez el polen de la flor de cacao, menores compuestos con actividad antifúngica contiene, similar a lo observado por Albores-Flores et al., (2021), donde los extractos de polen estudiados ejercieron un efecto antifúngico mínimo del 16% y máximo del 65% sobre el crecimiento del hongo Colletotrichum gloeosporioides. La calidad del polen y del proceso de polinización es un factor que favorece la fecundación de las flores de cacao (Frimpong-Anin et al., 2014), donde probablemente la contaminación microbiana podría ser favorecida por los vectores que lo transportan, tal como lo explica Laraba et al., (2019). La relación de la pérdida de frutos de cacao en las primeras semanas de desarrollo no depende en su totalidad por infección de M. roreri, siendo la falta de nutrientes en el árbol el otro factor que provoca pérdida de frutos recién formados (Frimpong-Anin et al., 2014).
Conclusiones
La presencia de conidios de M. roreri en el proceso de polinización de flores de cacao y el grado de madurez del polen utilizado en el proceso de la fecundación de los ovarios influyen directamente en la presencia de frutos enfermos.
Con el polen de color amarillo, el de mayor madurez, se generó necrosis en los frutos juveniles de cacao una semana antes que en los frutos generados por la fecundación de flores con polen color crema (menor madurez).
El polen proveniente de flores con estaminodios cerrados, independiente del color, ejerció un efecto reductor en el desarrollo del crecimiento de micelio de M. roreri, a diferencia del polen proveniente de flores con estaminodios abiertos.
