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Introducción
Las especies vegetales han sido utilizadas por el hombre desde la antigüedad para cubrir sus necesidades básicas, entre las que destacan el uso alimenticio y medicinal. Además, desde hace años el uso terapéutico de las plantas se ha vinculado a países con gran base cultural y biodiversidad, como México (Waizel, 2006). En el territorio mexicano, el término “guaje” es utilizado para designar, entre otras acepciones, a una diversidad de especies vegetales que pertenecen al género Leucaena de la familia Fabaceae (Peralta et al., 2017). Estudios etnobotánicos realizados en el estado de Morelos, identifican el uso medicinal de muchas leguminosas, entre ellas L. leucocephala y L. esculenta (guaje blanco y rojo respectivamente), las cuales se consideran, para curar enfermedades infecciosas como las respiratorias o gastrointestianles (Osuna et al., 2005; Quevedo, 2015; Román, 2015).
El género Leucaena, originario de México, está compuesto por 24 especies de árboles y arbustos, distribuidos desde Texas, Estados Unidos hasta Perú. Muchas de las especies han sido utilizadas como alimentación, para la construcción de viviendas y en el área terapéutica de diversas etnias del territorio mexicano (Zárate, 1994). Estudios etnobotánicos y fitoquímicos en México (Orozco et al., 2020; Sepúlveda et al., 2018; Peralta et al., 2017; Zárate, 1987) reportan efectos afrodisíacos, eupépticos, antiparasitarios y antimicrobianos de extractos de hojas y semillas de L. leucocephala y L. esculenta. En cuanto a los estudios antimicrobianos, se reporta actividad antimicrobiana de los extractos de hojas y semillas de L. leucocephala sobre cepas de Vibrio cholerae, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa (Dago et al., 2020; Savita & Preeti, 2015; Mathur et al., 2013; Nwe et al., 2001). Se sabe que la semilla fresca contiene compuestos fenólicos tales como taninos, flavonoides y antocianinas, entre otros metabolitos secundarios (Román et al., 2014); estas biomoléculas tienen propiedades, antimicrobianas, antioxidantes, anticancerígenas, cicatrizantes, entre otros (Ávalos & Pérez, 2009). Sin embargo, algunas plantas del género poseen un alcaloide tóxico al que se le atribuye efecto antimitótico conocido como mimosina, (Shelton et al., 2019). En consecuencia, el estudio se enfocó en evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos metanólicos, acetónicos y hexánicos de semillas de L. leucocephala y L. esculenta sobre diferentes cepas de interés médico. Con la finalidad de recabar datos sobre plantas nativas de México, ya que la mayoría de los reportes antimicrobianos provienen de investigaciones extranjeras.
Materiales y método
Material vegetal y zona de estudio
Las semillas de ambos guajes se recolectaron en la localidad de Tlayacapan, Morelos en julio de 2018 y fueron identificadas por el Biol. Daniel Román Salazar. La zona se encuentra geográficamente ubicada al norte a una latitud de 18°59'34", al sur a 18°53'37", al este a una longitud de 98°55'15" y 99°00'58" a el oeste. Un ejemplar de cada especie (número de registros: MVA118 y MVA119) fue depositado en el “Herbario IZTA” de la Facultad de Estudios Superiores (FES), Iztacala, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Las semillas fueron extraídas de las vainas y el material vegetal se puso a secar por una semana a temperatura ambiente sin luz directa del sol, posterior a sequedad, fueron puestas en un molino manual para triturar el material y que éste estuviera en contacto con los solventes a utilizar.
Obtención de extractos
Los extractos de L. leucocephala y L. esculenta fueron obtenidos mediante la técnica de maceración con solventes de diferente polaridad: hexano, acetona y metanol de forma subsecuente y a partir del mismo material vegetal. Se partió de un total de peso seco de semillas de: 434.34 g del guaje blanco y 458.63 g del guaje rojo colocados en matraces de 1L de capacidad durante 3 días por solvente. El macerado fue reducido cada vez mediante el uso de un equipo de arrastre de vapor a presión reducida acoplado a un rotavapor Heidolph Laborota 4001. El equipo se controla de manera que no sobrepase la temperatura de ebullición de cada solvente (hexano: 60 a 65 °C, acetona: 50 a 60 °C y metanol: 65 a 70 °C). Los extractos son colocados en un desecador y posterior a la evaporación del solvente, es calculado su rendimiento a través de una relación matemática del peso total del material respecto al del extracto obtenido. (Domínguez, 1978; Sierra et al., 2018).
Bioensayos
Cepas utilizadas
Cepas de bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus ATCC 29213, Micrococcus luteus ATCC 10240, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 y Enterococcus faecalis ATCC 14506 (cepas de catálogo); S. aureus FES-C y S. epidermidis FES-C (cepas donadas por el Laboratorio de Microbiología de Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (FES-C), UNAM); S. aureus 23MR, S. aureus CUSI y S. aureus cc (cepas multirresistentes de casos clínicos donadas por el Laboratorio de Análisis de la Clínica Universitaria de Salud Integral (CUSI) de la FES Iztacala, UNAM). Cepas de bacterias Gram negativas: Vibrio cholerae ATCC 39540, Enterobacter gergoviae ATCC 33028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Salmonella typhimurium ATCC 19430, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Serratia marcences ATCC 14756, Salmonella enterica subsp. enterica serovar typhy ATCC 7251, Klebsiella oxytoca ATCC 8724 y Klebsiella pneumoniae ATCC 27853 (cepas de catálogo); Escherichia coli 82MR, E. coli ATCC 25922 y Escherichia coli CUSI (donadas por el Laboratorio de Análisis clínicos de la CUSI de la FES Iztacala, UNAM).
Cepas de hongos levaduriformes: Candida albicans 17MR (donada por el laboratorio de análisis clínicos CUSI, FES Iztacala, UNAM); C. glabrata y C. tropicalis (aisladas de casos clínicos y donadas por el Hospital Ángeles Metropolitano). Cepas de hongos filamentosos: Trichophyton mentagrophytes (CDBB-H1112), Aspergillus niger (donado por el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Unidad de Biotecnología y Prototipos (UBIPRO), FES Iztacala, UNAM); Fusarium moniliforme (CDBBH-265) y F. sporotrichioides (NRLL3299).
Evaluación de la actividad antibacteriana
La actividad antibacteriana de los extractos de semilla de L. esculenta y L. leucocephala fue evaluada mediante el método de difusión en agar (Balouiri et al., 2016; CLSI, 2012b). Se prepararon inóculos bacterianos en 10 mL de caldo Müller-Hinton (Bioxon) y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Los inóculos se ajustaron con solución salina estéril para obtener la turbidez del estándar de McFarland No. 0.5 (108 UFC/mL). Se sembraron inóculos bacterianos en placas de agar Müller-Hinton con un hisopo para el crecimiento del césped microbiano. Sobre la superficie del agar se colocaron discos de papel filtro (Whatman N° 5) de 5 mm de diámetro impregnados 24 horas antes, con 2mg de extracto (por disco). Como control positivo se utilizaron discos impregnados con 25 μg de cloranfenicol y como control negativo discos con 10 μL de solvente (hexano, acetona o metanol). Las placas se incubaron a 37 ºC durante 18 h. Los halos de inhibición se reportan en mm.
La concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB) se estimó, mediante el método de microdilución en caldo (CLSI, 2012a). Se utilizaron diluciones de extractos de semillas de: 0, 125, 250, 750, 1000, 1500, 2000, 3000 y 4000 μg/mL. Los tubos se inocularon con una suspensión de microorganismos de 50µL de 105 UFC/mL en caldo Müller-Hinton (Bioxon) y 50 µL más del extracto de semillas en las placas estériles de 96 pozos. Los valores de CMI se definen como la concentración mínima de extracto que evita el crecimiento bacteriano visible después de 20 h de incubación a 37 °C. El valor de CMB se define como la concentración mínima en la que no hay crecimiento bacteriano alguno, es decir que se destruye el 100% de la población bacteriana, después de 20 h de incubación a 37 °C. Para revelar los resultados se utiliza TTC al 0.08% que indica respiración microbiana. Se utilizó cloranfenicol como fármaco de referencia y como controles negativos únicamente el solvente correspondiente.
La cinética de muerte muestra el efecto antimicrobiano dependiente del tiempo y de la concentración. Se empleó una suspensión bacteriana de 105 UFC/mL en caldo Müller-Hinton y cuatro tubos donde, el primer, segundo y tercer tubo contuvieron el extracto antibacteriano en concentraciones finales de ½CMI, CMI y CMB. El cuarto tubo correspondió al grupo control sin la presencia de extracto vegetal. Los inóculos microbianos (100 µL) se agregaron a cada tubo y se incubaron por 24 h a 37 °C, tiempo durante el cual se tomaron alícuotas de 50 µL a la hora: 0, 2, 4, 6, 8, 12 y 24. Posteriormente, las muestras se sembraron en placas de agar Müller-Hinton e incubaron por 24 h a 37 °C. Finalmente, se realizó el conteo en placa de las UFC, las cuales representaron el número de supervivientes, expresando el resultado en log10 (Balouiri et al., 2016; CLSI, 1998).
Evaluación de la actividad antifúngica
La actividad antifúngica se determinó utilizando el método de difusión en agar para la prueba de susceptibilidad de levaduras (CLSI, 2004). Se prepararon inóculos de levadura en 10 mL de caldo Dextrosa Sabouraud (Bioxon) y se incubaron a 37 ºC durante 24 h. Los inóculos se ajustaron con solución salina estéril para obtener la turbidez del estándar de McFarland No. 0.5 (108 UFC/mL). Los inóculos de levadura se sembraron con un hisopo en placas de agar papa dextrosa (PDA) (Bioxon) para aplicar un césped fúngico. Sobre la superficie del agar se colocaron discos de papel filtro (Whatman N° 5) de 5 mm de diámetro impregnados con 2 mg de extracto (por disco) con 24 horas previas de preparación. Como control positivo se utilizaron discos impregnados con 30 μg de nistatina y como control negativo discos con 10 μL de disolvente. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 24 h. Los halos de inhibición se reportan en mm.
La concentración fungicida mínima (CFM) se estimó con el método de microdilución en caldo. La técnica con cepas levaduriformes se realizó de la misma forma que con las cepas bacterianas (CLSI, 2012a). Se utilizaron diluciones de los extractos metanólicos, acetónicos y hexánicos en concentraciones de 0, 125, 250, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 y 6000 μg /mL. Los tubos se inocularon con una suspensión de microorganismos de 105 UFC/mL en caldo Dextrosa Sabouraud (Bioxon). Los valores de CFM se definen como la concentración de extracto más baja que evita el crecimiento visible de levaduras después de 20 h de incubación a 37 °C. Se utilizó nistatina como fármaco de referencia y como controles negativos únicamente el disolvente correspondiente. (Balouiri et al., 2016).
La prueba de susceptibilidad de hongos filamentosos, se llevó a cabo con el método de inhibición del crecimiento radial (CLSI, 2010). En placas de Petri con agar papa-dextrosa (PDA) fue inoculado el micelio (1 mm de diámetro) en el centro de cada placa. Sobre la superficie del agar se colocaron discos de papel filtro (Whatman N° 5) de 5 mm de diámetro impregnados con 2 mg de extracto, separados tres cm del botón de micelio sembrado, medida que permite el crecimiento adecuado del hongo. Como control positivo se utilizaron discos impregnados con 56 μg de ketoconazol y como control negativo discos con 10 μL de disolvente. Las placas se incubaron a 28 °C durante 72 a 96 h, hasta que el micelio cubrió la superficie del agar. Se consideró que los discos con los extractos que mostraban áreas de inhibición del crecimiento micelial tenían actividad antifúngica y se notificaron como positivos. (Curiel et al., 2017; Balouiri et al., 2016; Scrase, 1995).
La estimación de la concentración fungicida media (CF50) se determinó en placas de 12 pocillos. El extracto a diferentes concentraciones fue incorporado al agar PDA fundido. Posteriormente, se inoculó la placa con una muestra de micelio de 1 mm de diámetro en el centro de cada pocillo. Las placas se incubaron a 28 °C durante 48 - 72 h, hasta que el crecimiento micelial cubrió la superficie del agar en los pocillos de control, lo que representó el 100% de crecimiento del hongo. Se midió el diámetro del micelio de cada pozo a las diferentes concentraciones y con ello se determinó la actividad antifúngica y la CF50 (Curiel et al., 2017; Balouiri et al., 2016). El efecto antifúngico se estimó mediante la siguiente fórmula:
Donde:
Dc = diámetro de crecimiento en la placa de control
Ds = diámetro de crecimiento en la placa que contiene el agente antifúngico ensayado.
Obteniendo el porcentaje, se calculó la CF50, mediante un modelo logarítmico. Se grafica la concentración (eje x) respecto al porcentaje de inhibición o actividad antifúngica (eje y). En la ecuación logarítmica que brinda el programa Excel, se busca el valor (x) de la concentración para un porcentaje de inhibición del 50% (y=50).
Finalmente, cabe resaltar, que todas las técnicas microbiológicas para evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos de semillas de ambas especies de guaje, fueron llevadas a cabo en condiciones de esterilidad en campana de flujo laminar, con equipo y material previamente esterilizado en autoclave Modelo CVQ-B100L y acorde a los procedimientos del CLSI.
Determinación cualitativa de metabolitos secundarios
Los grupos funcionales de los metabolitos contenidos en el extracto se detectaron mediante un análisis fitoquímico cualitativo a partir de una solución estándar de cada extracto de 2 mg/ ml disuelto en metanol. Los compuestos fenólicos se detectaron a través de la prueba de cloruro férrico, observándose una coloración azul o verde. La prueba de taninos utiliza el tubo de solución fenólica positiva más reactivo de gelatina obteniendo un precipitado verde. Los alcaloides se detectaron mediante la prueba de Dragendorff a través de un precipitado rojo, mientras que con el reactivo de Mayer la prueba positiva para alcaloides es un precipitado lechoso. La prueba de glucósidos utiliza como reactivos α-naftol y HCl concentrado, observando un anillo púrpura. La detección de saponinas consistió en espuma que permanece durante al menos un minuto posterior a agitación vigorosa. Respecto a la prueba de cumarinas se utilizó NaOH al 10% y HCl al 10%, con un viraje inicial de amarillo a transparente como prueba positiva. Los triterpenos y esteroides se detectaron a través de la prueba de Lieberman-Buchard mediante una tinción azul o verde para esteroides y para triterpenos coloración roja, violeta o naranja. La prueba de monoterpenos se realiza con vainillina y H2SO4 obteniendo un halo azul, verde, violeta o naranja (Bulugahapitiya, 2018; Miranda & Cuellar, 2001; Domínguez, 1978; Marcano & Hasegawa, 2002).
Análisis estadísticos
Los resultados se expresan como el promedio y desviación estándar, n=3 de los datos de las pruebas cualitativas antimicrobianas realizadas; los valores se calcularon con el programa PAST (2020) versión 4.03. (Hammer et al., 2020). Por otro lado, se realizó un ANOVA de correlación para cada tendencia de crecimiento bacteriano con un α=0.05, para encontrar significancia en las cinéticas de muerte; los valores se calcularon con la versión 3.6.1. de R-Studio (2019) (Ross & Gentleman, 2019). Los valores de CF50 se calcularon mediante el modelo logarítmico utilizando el programa Microsoft Excel versión 19.0 (2018) (Brodie & Simonyi, 2020). La significancia de los valores de la CF50 se realizó con un ANOVA de correlación con un α=0.05.
Resultados
Rendimientos
Los rendimientos de los extractos de semillas obtenidos fueron los siguientes: guaje blanco: hexano 8.48 g (1.95%), acetona 2.94 g (0.67%) y metanol 23.02 g (5.29%); guaje rojo: hexano 19.67 g (4.28%), acetona 2.98 g (0.64%) y metanol 19.82 g (4.32%). Se partió de un total de peso seco de semillas de: 434.34 g del guaje blanco y 458.63 g del guaje rojo.
Actividad antibacteriana
Los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad antibacteriana de los extractos de hexano, acetona y metanol de L. lecucocephala y L. esculenta se muestran en el Cuadro 1.
Cuadro 1 Actividad antibacteriana de los extractos hexánico, acetónico y metanólico L. leucocephala y L. esculenta.
| Cepa | Halos de inhibición (mm) | CMI μg/mL | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Hexano | Acetona | Metanol | Control positivo | Hexano | Acetona | Metanol | Control positivo | |
| L. leucocephala | ||||||||
| E.c. CUSI | na | na | 6.33± 0.6 | 23.00±0.00 | na | na | 2000 | 4.0 |
| E.c. MR | na | na | na | 22.67±0.47 | na | na | na | 4.0 |
| S.a. MR | na | na | 9.33±0.6 | 22.33±0.47 | na | na | 4000 | 7.0 |
| S.a. ATCC | 6.0±0.0 | 6.0±0.0 | 6.0±0.0 | 22.33±0.47 | 3000 | 4000 | 4000 | 2.0 |
| S.a. CUSI | na | 7.0±0.0 | 7.33±0.6 | 22.33±0.47 | na | 4000 | 4000 | 4.0 |
| S.a. FES-C | na | na | na | 22.33±0.47 | na | na | na | 4.0 |
| L. esculenta | ||||||||
| E.c. CUSI | na | na | 6.67±0.58 | 23.00±0.00 | na | na | 3000 | 4.0 |
| E.c. MR | na | na | 6.33±0.58 | 22.67±0.47 | na | na | 3000 | 4.0 |
| S.a. MR | na | na | na | 22.33±0.47 | na | na | na | 7.0 |
| S.a. ATCC | 6.33±0.58 | na | na | 22.33±0.47 | 2000 | na | na | 2.0 |
| S.a. CUSI | na | na | 7.33±1.53 | 22.33±0.47 | na | na | 2000 | 4.0 |
| S.a. FES-C | 6.0±0 | na | 6.0±0 | 22.33±0.47 | 3000 | na | 3000 | 4.0 |
E.H: Extracto hexánico, E.A: Extracto acetónico, E.M: Extracto metanólico, C.p: control positivo, E.c. CUSI: E. coli CUSI, E.c. MR: E. coli 82MR, S.a. MR: S. aureus 23MR, S.a. ATCC: S. aureus ATCC 29213, S.a. CUSI: S. aureus CUSI, S.a. FES-C: S. aureus FES-C. na: no actividad. Control positivo: Cloranfenicol. El control negativo en todos los casos no tuvo efecto alguno sobre las cepas bacterianas.
Se puede observar que 5 de los 6 extractos de semillas de guajes fueron activos para 6 cepas bacterianas, todas del género Staphylococcus y Escherichia. Se aprecia también, que los extractos de L. leucocephala mostraron actividad antibacteriana en un mayor número de cepas. Extracto hexánico: una cepa, extracto acetónico: 2 cepas y extracto metanólico: 4 cepas. Mientras que los extractos de semillas de L. esculenta mostraron actividad solo para el extracto hexánico: 2 cepas y metanólico: 4 cepas. Para la determinación de la CMI mediante la técnica de microdilulción en caldo se observa que el valor más bajo registrado es de 2000 μg/mL para el extracto metanólico de guaje blanco sobre E. coli CUSI y para los extractos hexánico y metanólico del guaje rojo sobre S. aureus ATCC 29213 y S. aureus CUSI respectivamente.
Los resultados obtenidos en las cinéticas de muerte se pueden observar en las Figuras 1, 2 y 3 para la cepa de S. aureus CUSI, la cual fue susceptible a los extractos acetónico y metanólico de ambas especies de guajes. El efecto antibacteriano de los extractos de semillas de ambas especies del género Leucaena fue significativo con un α=0.05 para las CMB evaluadas.
Fig. 1 Cinética de muerte para S. aureus CUSI del extracto acetónico de semilla de L. leucocephala. T: testigo: sin extracto, ½ CMI: 2000 μg/mL, CMI: 4000 μg/mL, CMB: 6000 μg/mL. *Significancia de CMB. α=0.05
Fig. 2 Cinética de muerte para S. aureus CUSI del extracto metanólico de semilla de L. leucocephala. T: testigo: sin extracto, ½ CMI: 2000 μg/mL, CMI: 4000 μg/mL, CMB: 6000 μg/mL. *Significancia de CMB. α=0.05
Fig. 3 Cinética de muerte para S. aureus CUSI del extracto metanólico de semilla de L. esculenta. T: testigo: sin extracto, ½ CMI: 1000 μg/mL, CMI: 2000 μg/mL, CMB: 4000 μg/mL. *Significancia de CMB. α=0.05
En la Figura 1, se observa el efecto bactericida desde la primera hora de exposición de la cepa bacteriana al extracto acetónico de semillas de guaje blanco, ya que eliminó el 99.99% de UFC con una concentración de 6000 μg/mL. En el segundo caso (Fig. 2), la cepa mostró una disminución significativa de UFC respecto al control luego de doce horas de exposición del microorganismo al extracto metanólico de la semilla de guaje blanco a una concentración de 6000 μg/mL. Por otro lado, en la Figura 3 se observa que el microorganismo expuesto al extracto metanólico de semillas de guaje rojo mostró un efecto bacteriostático y una disminución significativa en la población bacteriana en comparación con el grupo control a una concentración de 4000 μg/mL.
Actividad antifúngica
Los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad antifúngica de los extractos de hexano, acetona y metanol de L. lecucocephala y L. esculenta se muestran en el Cuadro 2. Se observó que tanto el extracto metanólico de semillas de guaje blanco como de guaje rojo tuvieron efectos inhibitorios contra C. glabrata. Para la determinación de la CFM se observa que el valor más bajo registrado es de 4000 μg/mL para el extracto metanólico de guaje blanco sobre C. glabrata. Se aprecia que los extractos de L. leucocephala mostraron actividad antifúngica en un mayor número de cepas de hongos miceliados. Extracto hexánico: una cepa, extracto acetónico: 2 cepas y extracto metanólico: 1 cepa. Mientras que los extractos de semillas de L. esculenta mostraron actividad solo para el extracto acetónico: 2 cepas. La CF50 determinada para las diferentes cepas de hongos filamentosos se realizó con una p<0.05, por lo que se demuestra una disminución significativa del crecimiento radial de estos hongos al contacto con los extractos vegetales. Los valores de los controles positivos de la prueba se muestran en el Cuadro 3.
Cuadro 2 Actividad antifúngica de los extractos hexánico, acetónico y metanólico L. leucocephala y L. esculenta.
| Extractos | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Cepa | Halos de inhibición (mm) | CFM μg/mL |
CF50 (mg/mL) | |||||||
| E.H | E.A | E.M | E.H | p | E.A | p | E.M | p | ||
| L. leucocephala | ||||||||||
| C. g. | na | na | 7.33± 0.6 | 4000 | - | - | - | - | - | - |
| T.m. | na | + | na | - | na | - | 2.28 | 2.03e-07 | na | - |
| A.s. | na | na | na | - | na | - | na | - | na | - |
| F.m. | + | na | na | - | 2.94* | 9.04 e-03 | - | - | - | - |
| F.s. | na | + | + | - | - | - | 2.93 | 9.13 e-04 | 4.22 | 4.0 e-04 |
| L. esculenta | ||||||||||
| C. g. | na | na | 6.0±0.0 | 6000 | - | - | - | - | - | - |
| T.m. | na | na | na | - | na | - | na | - | na | - |
| A.s. | na | + | na | - | na | - | 2.72 | 6.82 e-05 | na | - |
| F.m. | na | + | na | - | na | - | 4.69 | 3.21 e-03 | na | - |
| F.s. | na | na | na | - | na | - | na | - | na | - |
Levaduras: C.g. C. glabrata: aislada de un caso clínico donada por el Hospital Ángeles Metropolitano. Hongos filamentosos: T.m. T. mentagrophytes CDBB-H1112. A.s. A. niger (donada por el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la UBIPRO, FES Iztacala), F.m. F. moniliforme (CDBBH-265), F.s. F. sporotrichioides (NRLL3299). E.H: extracto hexánico, E.A: extracto acetónico, E.M: extracto metanólico; + : prueba positiva; - : no aplica. na: no actividad. p: valor de p <0.05. *: CF25 mg/mL. El control negativo en todos los casos no tuvo efecto alguno sobre las cepas bacterianas
Cuadro 3 Actividad antifúngica de los fármacos control.
| Controles positivos | ||||
|---|---|---|---|---|
| Halos de inhibición (mm) | ||||
| Cepa | Nistatina (30 µg/disco) | Ketoconazol (56 µg/disco) | CFM μg/mL | CF50 μg/mL |
| C. g. | 22.00±0.00 | - | 8.0 | - |
| T. m. | - | + | - | 2 |
| A. s. | - | + | - | 15 |
| F.m. | - | + | - | 2 |
| F.s. | - | + | - | 2 |
Levaduras: C.g. C. glabrata: aislada de un caso clínico donada por el Hospital Ángeles Metropolitano. Hongos filamentosos: T.m. T. mentagrophytes CDBB-H1112. A.s. A. niger (donada por el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la UBIPRO, FES Iztacala), F.m. F. moniliforme (CDBBH-265), F.s. F. sporotrichioides (NRLL3299). +: prueba positiva; -: no aplica. na: no actividad.
Los metabolitos secundarios contenidos en los extractos indicaron la presencia de grupos como alcaloides, glucósidos, saponinas, compuestos fenólicos, triterpenos, esteroides y monoterpenos. (Cuadro 4).
Cuadro 4 Grupos de metabolitos secundarios de los extractos hexánico, acetónico y metanólico de L. leucocephala y L. esculenta.
| Grupos de metabolitos secundarios | E.H | E.A | E.M | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| L. l. | L. e. | L. l. | L. e. | L. l. | L. e. | |
| Compuestos fenólicos | - | - | + | - | + | - |
| Taninos | - | - | - | - | - | - |
| Alcaloides (Dragendorff) | - | + | - | - | - | - |
| Alcaloides (Mayer) | + | + | + | + | - | - |
| Glicósidos | - | - | - | - | + | + |
| Saponinas | - | - | - | - | + | + |
| Cumarinas | - | - | - | - | - | - |
| Triterpenos y esteroides | + | + | + | + | - | - |
| Monoterpenos | + | + | + | + | - | - |
E.H: extracto hexánico, E.A: extracto acetónico, E.M: extracto metanólico; L. l. L. leucocephala. L. e. L. esculenta; +: prueba positiva; -: prueba negativa
Discusión
El mayor rendimiento, corresponde a los extractos metanólicos de ambas especies de guaje, lo que sugiere que la mayoría de los metabolitos contenidos en estas plantas son de naturaleza polar, como fenoles, taninos o saponinas, entre otros. Trabajos realizados por Savita & Preeti (2015) con tres extractos diferentes de hojas de L. leucocephala reportaron que el extracto metanólico tuvo un rendimiento de 2.43% en comparación con los extractos obtenidos con acetona y cloroformo (1.05 y 0.96% respectivamente). Un estudio de Román et al. (2014) reporta un mayor contenido de lípidos en las semillas del guaje rojo (3.65%) con respecto al guaje blanco (2.11%), lo que podría explicar un alto rendimiento con el extracto hexánico, ya que los compuestos lipídicos son solubles en disolventes apolares.
El efecto de los extractos metanólicos del guaje blanco y rojo sobre las cepas bacterianas, muestra diámetros de inhibición mayores respecto a los demás extractos. Reda et al. (2015) indica que gran parte de la actividad antimicrobiana se debe a flavonoides, compuestos fenólicos y saponinas los cuales están relacionados con solventes de alta polaridad, como etanol, metanol o agua. Asimismo, se observó que el efecto inhibitorio fue mayor en los extractos de guaje blanco (L. leucocephala) en comparación con los extractos de semillas de guaje rojo (L. esculenta) para estudios bacterianos. Por su parte, los extractos de hexano pueden contener metabolitos de naturaleza no polar como triterpenos o esteroides, los cuales han sido reportados por Aderibigbe et al. (2011) por poseer actividad antimicrobiana. Este mismo autor indica en un estudio realizado con las semillas del guaje blanco, halos de inhibición dependientes de la concentración para bacterias Gram positivas y negativas, como S. aureus con halos de inhibición de hasta 12 mm promedio y para E. coli de hasta 18 mm promedio. Nwe et al. (2001) reporta actividad antibacteriana en cepas de S. aureus con halos de inhibición de 26 mm promedio para extractos alcohólicos de hojas de L. glauca, sin embargo otros autores como Reda et al. (2015) y Mathur et al. (2013) reportan que los extractos polares de hojas de L. leucocephala fueron activos para cepas de S. aureus y E. coli con diámetros de inhibición de 10 mm a 15 mm, rangos muy similares obtenidos por la presente investigación para esas cepas en el caso de extractos de semillas.
Un estudio realizado por Abu et al. (2016) donde se analizaron las propiedades antimicrobianas cuantitativas del extracto acuoso de hojas de L. leucocepahala para dos cepas del género Staphylococcus, reportó valores de CMI superiores a los reportados para este trabajo: CMI para S. aureus: 1250 μg / mL, mientras que para S. epidermidis: 6250 μg / mL. En el presente trabajo, las diferentes cepas de S. aureus reportaron valores de CMI de 2000 a 4000 μg / mL. Un informe de Savita & Preeti (2015) obtuvo los siguientes datos de CMI para E. coli para 3 disolventes diferentes a partir del extracto de hojas de L. leucocephala, extracto metanólico: 620 μg / mL, acetona: 5000 μg / mL y finalmente para el clorofórmico 1250 μg / mL. Los valores reportados por este autor son inferiores a los de la presente investigación, donde solo se obtuvieron para el extracto de hexano de la semilla: CMI> 3000 μg / mL.
Se obtuvieron tres cinéticas de muerte de la cepa S. aureus CUSI donde se apreció un efecto significativo de la CMB en la disminución de la población bacteriana. Para L. leucocephala, la CMB de 6000 μg / mL del extracto acetónico mata al 99.9% de las bacterias en la primera hora del tratamiento, en tanto que la CBM del extracto metanólico disminuye las UFC/mL a partir de las 12 horas de exposición. Respecto a L. esculenta, la CMB de 4000 μg / mL para el extracto metanólico marca un decremento significativo de la población bacteriana en la décimo segunda hora de tratamiento, observándose un efecto de tipo bacteriostático. Dado lo anterior, el efecto antibacteriano puede deberse a la participación de diferentes metabolitos secundarios de naturaleza polar y una disminución significativa de UFC de S. aureus CUSI entre las primeras doce horas de exposición a los extractos de semillas de ambos guajes.
El efecto de los extractos del guaje rojo y blanco sobre las diferentes cepas de hongos mostró en el caso de levaduras, que de las 3 cepas con las que se trabajó, únicamente una fue susceptible: C. glabrata con halos de 6 y 7 mm de diámetro. Estos datos se asemejan a lo reportado por Mulaudzi (2015), con baja o nula acción del extracto acuoso de hojas de L. leucocephala con diámetros de 9 mm en promedio para C. albicans. Mathur et al. (2013) y Abu et al. (2016) no registran actividad del extracto acuoso ni del alcohólico sobre C. albicans ni C. tropicalis. Por otro lado, Reda et al. (2015) en su investigación, reporta halos de inhibición de 14 mm para el extracto crudo de hojas de L. leucocephala sobre C. albincans. Por lo que los extractos polares de L. leucocephala y L. escuelenta presentan baja efectividad sobre las diferentes cepas de levaduras probadas.
Por otro lado, al aplicar los diferentes extractos de L. leucocephala y L. esculenta a las cepas de hongos miceliados, se encontró que los extractos acetónicos fueron efectivos para más cepas. Como en el caso de las cepas bacterianas, se demostró también que el guaje blanco es más efectivo que el guaje rojo para inhibir el crecimiento de las cepas de hongos filamentosos. Reda et al. (2015) indica que el extracto de hojas de L. leucocephala tuvo efecto sobre A. niger. A pesar de este reporte otros dos estudios indican efecto inexistente del extracto de guaje blanco sobre A. niger (Abu et al., 2016; Aderibigbe et al., 2011).
Posterior al análisis exploratorio, fue determinada la Concentración Fungicida Media (CF50), la cual se define como la concentración de un extracto o compuesto que disminuye la población en un 50%. Se hace mención que para obtener estas curvas, la actividad de los antifúngicos al igual que la de los antibacterianos depende de una serie de factores como son: la temperatura de incubación, el pH y el medio de cultivo, cuya influencia viene determinada por su incidencia en la velocidad de crecimiento del hongo (Cantón & Pemán, 1999). La actividad cuantitativa sobre las cepas de hongos filamentosos mostró valores de CF50 significativos para todos los casos, por lo que existe efecto inhibitorio de las poblaciones de hongos miceliados por parte de los extractos de semillas de ambos guajes. Cabe resaltar que no hay reportes de evaluaciones cuantitativas de CF50 para las cuatro cepas utilizadas en la literatura científica existente hasta la fecha, sin embargo, un trabajo con una leguminosa del género Lupinus mostró nula inhibición de extractos acuosos de las hojas con base de liofilizados, probándolos en cepas de T. rubrum. Argumenta el autor, la importancia del proceso de extracción ya que el efecto fungicida que se adjudica a los alcaloides contenidos en las hojas puede perderse en el proceso de obtener los extractos (Coloma, 2009).
La investigación sobre antimicrobianos mostró que hay diferencia significativa en el uso de extractos metanólicos y acetónicos de ambos guajes, sobre ciertas cepas microbianas, que si bien no equipara a la actividad de los fármacos control se demostró su efectividad en términos estadísticos. Es importante considerar que un extracto es una mezcla de compuestos y estos pueden tener cierta actividad biológica con menor efecto que un compuesto aislado o un fármaco como los controles positivos utilizados (Ávalos & Pérez, 2009).
La variabilidad de los datos puede deberse a las condiciones del medio al que están sometidas las especies vegetales. Bhalla et al. (2005) indica que la concentración, presencia o efecto de metabolitos secundarios varía respecto a condiciones como depredación, polinización o relaciones de simbiosis, entre otros factores. Además, las condiciones ambientales adecuadas como la incidencia de luz, temperatura, presión, altitud, humedad y tipo de suelo, entre otros, son elementos importantes a considerar en el efecto de los extractos vegetales sobre las actividades biológicas, ya que son los metabolitos especializados los que proporcionan principalmente los resultados esperados.
Se debe considerar además del efecto de los extractos, los mecanismos de acción de los antimicrobianos y las diferencias estructurales y fisiológicas entre las cepas utilizadas. Los agentes antimicrobianos actúan por una serie de mecanismos que son muy diferentes entre sí y cuyas dianas se encuentran en diferentes regiones de la célula, en general estas dianas son: la pared, la membrana celular, la síntesis proteica por inhibición de funciones ribosómicas, la síntesis de ácidos nucleicos o la inhibición de otras vías metabólicas (Errecalde, 2004; Murray et al., 2017).
El guaje rojo y el guaje blanco pertenecen a la familia de las leguminosas; se ha investigado que cantidades apreciables de aminoácidos tóxicos y sustancias como taninos y saponinas existen frecuentemente en las hojas y semillas de esta familia. Las saponinas, son capaces de inhibir el crecimiento bacteriano, como se reporta en semillas de Acacia auriculiformis (Yik et al., 2011). La mimosina, un alcaloide reportado para plantas del género Leucaena, contiene en las hojas, tallos y semillas de L. leucocephala cantidades de aproximadamente 30 mg / g (D’Mello, 1992). Asimismo, Yik et al. (2011) indica la presencia del alcaloide mimosina en semillas de L. leucocephala de 23 mg / g de peso seco. Compuestos fenólicos fueron reportados en hojas, flores, tallos, semillas y raíces, como: taninos, flavonoides, antocianinas o cumarinas, además de otros metabolitos como glucósidos, terpenos y esteroides con potencial antimicrobiano (Reda et al., 2015; Savita & Preeti, 2015). Finalmente, Aderibigbe et al. (2011) evidenciaron la presencia de triterpenos y esteroides de semillas de L. leucocephala, además de otros glicolípidos y carotenoides.
Cabe señalar que en las pruebas coloridas no se obtuvieron resultados positivos para los taninos, sin embargo la literatura reporta estos metabolitos secundarios, este resultado podría deberse al tipo de solvente utilizado, la cantidad de extracto y la cantidad de metabolitos secundarios contenidos en el muestras, ya que tienden a estar en cantidades ínfimas para dar resultados positivos (Ringuelet & Viña, 2013) y que al tener un contenido de taninos muy bajo, el viraje de color es invisible a simple vista dando falsos negativos.
Conclusiones
Los extractos metanólicos y acetónicos de semillas de ambos guajes presentaron una mayor actividad biológica sobre cepas de S. aureus y E. coli (bacterias) y Trichophyton mentagrophytes y Aspergillus niger (hongos miceliados). Por otro lado, los valores de CMB y CF50 fueron significativos inhibiendo el desarrollo microbiano. Además, se propone que los metabolitos involucrados en la actividad antimicrobiana son de naturaleza polar, como saponinas, alcaloides, compuestos fenólicos, entre otros. El presente estudio contribuye a validar el uso en la medicina popular de L. leucocephala y L. esculenta para tratar algunas enfermedades infecciosas.
