Colecta del material y preparación de los extractos

Se recolectaron diferentes tejidos de las especies A. ochroleuca S., S. rostratum D., D. stramonium L., M. parviflora L., P. icosandra L. y E. arvense L. (Cuadro 1). Para su certificación taxonómica se preparó un ejemplar de herbario de cada especie y se depositó en el Herbario-Hortorio “Jorge Espinoza Salas” de Preparatoria Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo (Cuadro 1).

Análisis fitoquímico

Se detectó cualitativamente por cromatografía en capa fina (CCF) la presencia de alcaloides, flavonoides y terpenoides en los extractos metanólicos y hexánicos de cada especie vegetal mediante la aplicación de 1 µL de extracto en cromatoplacas de gel de sílice 60 F 254 (Merck). Para la identificación de alcaloides se usó como eluyente metanol:diclorometano (8:2% v/v) y el agente cromogénico fue el reactivo Dragendorff (^{Wagner & Bladt, 1996}). Para la identificación de flavonoides se empleó como eluyente una mezcla de butanol:ácidoacético:agua (BAW) en una proporción de 40:10:50% (v/v), los agentes cromogénicos fueron 2-aminoetil difenilborinato (NP) y polietilenglicol 4000 (PEG) (^{Wagner & Bladt, 1996}). Para la identificación de terpenoides se utilizó como eluyente una mezcla de tolueno:acetato de etilo (85:15% v/v), el agente cromogénico empleado fue vainillina a 1% v/v en etanol y ácido sulfúrico al 10% v/v en etanol (^{Wagner & Bladt, 1996}).

Aislamiento de C. gloeosporioides

El hongo se aisló de frutos de papaya cv. Maradol con síntomas característicos de antracnosis (lesiones superficiales, hundidas, redondas o angulares, con masas de conidios de color rosa salmón a oscuras) (^{Bailey & Jeger, 1992}), provenientes de dos estados de la República Mexicana (Colima y Morelos). Fracciones pequeñas ( 1 x 1 cm) de tejido sintomático del fruto se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo de Papa Dextrosa Agar (PDA, BD Bioxon®), la incubación se realizó a 28 ± 2 ºC por 3 días en oscuridad (^{Acosta Ramos et al., 2002}). Posteriormente, se tomó una muestra del hongo en desarrollo para obtener un cultivo monoconidial según la técnica descrita por (^{Leslie & Summerell, 2006}) con la finalidad de obtener inoculo puro (IP) proveniente de una sola colonia.

Identificación Molecular

La extracción de ADN se realizó con CTAB a 2% (^{Doyle & Doyle, 1990}) para la identificación del hongo (IP). La técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) para los aislamientos se llevó a cabo utilizando los iniciadores ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (^{White et al., 1990}), que permitieron amplificar los espacios internos transcritos y el gen 5.8S del ADN ribosomal (región ITS). Los fragmentos amplificados por PCR fueron analizados en un secuenciador ABI PRISM® 3700 Genetic Analyzer en el Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Méx.

Evaluación del control de C. gloeosporioides in vitro

Para la evaluación in vitro se utilizó el método de medio de cultivo envenenado modificado (^{Guerrero-Rodríguez et al., 2007}). En una caja de Petri (unidad experimental; UE) con medio de cultivo PDA se agregó 1ml de cada extracto para cada concentración (10, 25 y 50%), se distribuyó uniformemente en la superficie. Luego se tomó un disco de medio de cultivo de PDA (8 mm de diámetro) con el inoculo y se colocó en el centro (UE) de los medios modificados. Las UE se incubaron a 27 ± 2 ºC y en oscuridad. Se consideraron un testigo absoluto (agua esterilizada) y dos testigos comerciales: 1 mL de Merivon® (Fluxapyroxad + Piraclostrobina) (0.5 g L^-1) y 1 mL de Progranic®Mega extracto de Larrea tridentata comercial (7.5mL L^-1). Se realizaron cuatro repeticiones por tratamiento en un diseño completamente al azar; cada tratamiento correspondió a una concentración por extracto (hexánico y metanólico) de cada especie vegetal, con los tres tratamientos de los testigos sumaron un total de 36 tratamientos. Después de 12 días se midió el diámetro de inhibición del crecimiento (cm) del micelio; el porcentaje de inhibición se calculó con la fórmula: % I= (diámetro de crecimiento tratamiento/ diámetro de testigo) *100. La efectividad biológica de los tratamientos se calculó mediante la fórmula de Abbott: ET= [(IT - it) / IT] * 100, donde: ET=Efectividad del tratamiento; IT= porcentaje de inhibición del testigo positivo; it= porcentaje de inhibición de cada tratamiento.

Cultivo de papaya a campo abierto

En un semillero de unicel con sustrato (peatmoss + agrolita en una proporción 2:1) se establecieron las semillas viables de papaya cv. Maradol adquiridas en una casa comercial. Se realizaron tres riegos por día de manera automática mediante microaspersores con un caudal de 27 L h^-1y una duración de 10 min. Las plántulas de papaya, a los dos meses de la germinación, fueron trasplantadas a una parcela de la Comunidad de Chinameca, Morelos, México región que se localiza a 1400 msnm, con clima cálido subhúmedo, precipitación y temperatura media anual de 800 mm y 24 °C (^{García, 2004})

Evaluación del control del hongo en flores de papaya

Las plantas establecidas en campo se inocularon con inóculo puro (IP) de C. gloeosporioides a una concentración 1x10⁵ UFC mL^-1. Se eligieron al azar 120 flores de 16 plantas y fueron asperjadas con el extracto que presentó mayor efectividad in vitro a los 6, 10 y 14 días después del inicio de floración con ayuda de una aspersora de mochila motorizada (Echo SHO-800) a 120 psi. La medición de la variable respuesta se realizó a los 10, 14 y 20 días después de la aspersión del extracto. El experimento se estableció bajo un diseño de bloques completos al azar con cuatro repeticiones (5 flores por repetición) por tratamiento. Los seis tratamientos fueron: extracto P. icosandra en tres concentraciones (10, 25 y 50%), se consideraron: un testigo positivo (agua esterilizada) y dos testigos negativos: Merivon® (0.5 g L^-1) y el Extracto de Larrea tridentata comercial Progranic® mega (7.5 mL L^-1). Se midió el diámetro de inhibición del crecimiento micelial en las flores. La incidencia se evalúo por triplicado como el número de flores que mostraron síntomas típicos de la enfermedad con respecto al número total de flores muestreadas. Con los datos obtenidos de la incidencia se determinó la efectividad mediante la fórmula ^{Abbott (1925)}.

Evaluación del control del hongo en frutos poscosecha

Los frutos de aproximadamente 1.5-2.0 kg en madurez fisiológica y asintomáticos fueron obtenidos del cultivo de papaya establecido en campo (Chinameca, Morelos, México), con la finalidad de garantizar que estos no tuviesen ningún tratamiento adicional. Los frutos fueron desinfestados con detergente biodegradable y por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio a 2% por 5 min, después en agua estéril. Se realizaron 10 heridas de 5 mm de profundidad en cada fruto con un palillo estéril, donde se depositó una suspensión de conidios (1 x 10⁵ conidios mL^-1) de C. gloeosporioides. Posteriormente, se aplicaron los diferentes tratamientos por inmersión total de los frutos en cada solución por 5 min. Se consideraron seis tratamientos: un testigo positivo (agua esterilizada); dos testigos negativos: Merivon® (0.5 g L^-1) y el Extracto de Larrea tridentata comercial (7.5 mL L^-1); y tres concentraciones de Phytolacca icosandra (10, 25 y 50 %). Los frutos se mantuvieron en condiciones de almacenamiento a 25 ± 2 °C. El experimento se estableció bajo un diseño de bloques completos al azar con cuatro repeticiones (fruto por repetición). A los 8 y 12 días se evaluaron las variables siguientes: severidad (diámetro de la lesión que presento cada fruto) de acuerdo a la fórmula de ^{Townsend & Heuberger (1943)} y a la escala de severidad de ^{Solano & Arauz (1995)}; la efectividad se calculó mediante la fórmula de ^{Abbott (1925)}.

Análisis Estadístico

Los datos obtenidos de cada variable se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) con comparación de medias Tukey (P ≤ 0.05), mediante el programa estadístico Statistical Analysis System (^{SAS, 2003}).

Caracterización de C. gloesporioides

Los primers ITS1 / ITS4 permitieron la amplificación de 450 pb, reportado para la misma especie por (^{Tapia-Tussell et al., 2008}) quienes caracterizaron a este patógeno como el agente causal de antracnosis. El análisis de secuencia de los ITS por BLAST permitió observar una homología de similitud de 97% con C. gloesporioides (Fig. 1). ^{Talhinhas et al. (2002)} caracterizaron el agente causal de antracnosis en Lupinus spp. reportando la misma cantidad de pares de bases para C. gloeosporioides.

Fig. 1 Amplificación de la región correspondiente al espacio transcrito interno del DNA ribosomal de 450 pares de bases (bp) aproximadamente. MP: Marcador de peso molecular de 1KB ( - ): Control negativo. Carril 1: Muestra obtenida por aislamiento monoconidial. Carril 2: Muestra obtenida por aislamiento realizado por punta de hifa. 

Fig. 2 Árbol filogenético construido con el método de Máxima Parsimonia, para la confiabilidad de los nodos (se consideraron1000 repeticiones bootstrap). 

Análisis fitoquímico

El rendimiento del extracto metanólico de P. icosandra fue mayor (40.1g 100 mg^-1p. s.) en comparación con los extractos de las especies restantes (datos no mostrados). La identificación cualitativa del tipo de metabolito por CCF (Cuadro 2) permitió formar tres grupos de extractos vegetales por la actividad biológica observada. En el primer grupo se encontraron los extractos de S. rostratum y E. arvense que presentaron menor actividad, en los que se identificó únicamente la presencia de flavonoides, este tipo de metabolitos se caracterizan principalmente por sus propiedades medicinales y antioxidantes (^{Mimica-Dukic et al., 2008}). El segundo grupo comprendió a los extractos metanólicos de las especies D. stramonium, M. parviflora y A. ochroleuca que mostraron actividad media; en estos extractos se identificó la presencia de alcaloides, lo que podría explicar la actividad media observada en estos extractos. Los alcaloides presentan diversa actividad biológica, principalmente en humanos (^{Boumba et al., 2004}; ^{Gupta et al., 2010}); sin embargo, existen pocos trabajos en los que se destaca la actividad contra hongos fitopatógenos. La variabilidad del perfil de alcaloides en diversas especies vegetales constituye un mecanismo de defensa, lo que explica la diferente actividad entre especies que los sintetizan (^{Wink, 1992}; ^{Aniszewski, 2015}). Principalmente, los alcaloides del grupo quinolizidínicos y tropánicos han sido los más estudiados por su actividad fungicida (^{Wink, 1992}, ¹⁹⁹³). ^{Pérez-Laínez et al. (2008)} reportaron la actividad fungicida de alcaloides quinolizidínicos presentes en Calia secundiflora contra Alternaria solani, Fusarium oxysporum y Monilia fructicola.^{Usha et al. (2009)} señalaron la actividad de D. stramonium contra Fusarium mangiferae debido a los alcaloides tropánicos presentes en diversas partes de la planta; así como, ^{Haiyan et al. (2005)} reportaron su actividad contra Alternaria sp. Los alcaloides del tipo isoquinolínico y terpenoides se han reportado en A. ochroleuca (^{Brahmachari et al., 2013}; ^{Fletcher et al., 1993}) y su actividad antifúngica contra algunos hongos fitopatógenos (Alternaria alternata, A. brassicae, A. cajani, Bipolaris sp., Curvularia lunata, Curvularia sp., Colletotrichum musae, Fusarium udum, Helminthosporium sp., H. pennisetti y H. speciferum) (^{Singh et al., 2010}). En M. parviflora se ha señalado la presencia de alcaloides y la de otros metaboliltos (compuestos fenólicos y flavonoides) (^{Farhan et al., 2012}). ^{Pérez-Laínez et al. (2008)} señalaron que los alcaloides afectan varios sitios a nivel molecular (inhibición del ADN y ARN, inhibición de la biosíntesis de proteínas y alteración de la estabilidad de membranas en microorganismos y células animales y la inhibición del crecimiento celular) (^{Brahmachari et al., 2013}). En el tercer grupo se ubicó únicamente al extracto de la especie P. icosandra, en este extracto se identificó la presencia de terpenoides. ^{Hernández et al. (2013)} reportaron la actividad fungicida de otra especie del género Phytolacca (P. tetramera) en C. gloesporioides, atribuida a la presencia de saponinas (terpenoides). Existen diversos reportes de la actividad antifúngica de saponinas que han demostrado ser una opción viable para el control de algunos hongos; al respecto, ^{Segal & Schlösser (1975)} estudiaron el efecto de las saponinas contra los hongos Botrytis cinerea y Rhizoctonia solani.^{Barile et al. (2007)} señalaron el efecto de algunas agliconas (sapogeninas) de saponinas identificadas como aliogenina y neoagigenina, aisladas de bulbos de Alliummin utiflorum contra diversos hongos fitopatogenos (A. alternata, A. porri, Botrytis cinérea, F. oxysporum, F. oxysporum f. sp. lycopersici, F. solani, Pythium ultimum y R. solani). No se ha reportado la acción fungicida de saponinas contra C. gloesporioides. El mecanismo de acción de las saponinas, en particular de estructura triterpénica como las identificadas en P. icosandra (^{Galarraga et al., 2014}; ^{Saleri et al., 2017}) se debe principalmente a daño de membranas celulares por la naturaleza anfipática de estos metabolitos, la cual consiste en una estructura hidrofóbica (sapogenina) y un carbohidrato hidrofílico, que provoca la fuga de materiales celulares, lo que conduce a la muerte celular (^{Hussain et al., 2019}; ^{Mshvildadze et al., 2000}), actividad que podría explicar en el presente trabajo la actividad observada del extracto de P. icosandra en el control de C. gloesporioides.

Control del hongo C. gloeosporioides in vitro

El extracto hexánico de las seis especies evaluadas no mostro actividad contra C. gloeosporioides (datos no mostrados) debido posiblemente a la baja polaridad de los componentes presentes en los extractos hexánicos de cada especie y poca afinidad con los componentes polares de la pared celular del hongo. El análisis estadístico de la evaluación in vitro de los extractos metanólicos de las seis especies mostraron diferencias significativas (P ≤ 0.05) en la inhibición del crecimiento micelial entre extractos y testigos. El extracto metanólico de P. icosandra a la concentración más baja (10%) fue el que presentó mayor efecto de inhibición de crecimiento micelial en comparación con los extractos metanólicos de las especies restantes a la misma concentración (Cuadro 3). Sin embargo, de igual forma sucedió con la concentración más alta (50%), P. icosandra resultó más efectivo que los extractos restantes y también al extracto de Larrea tridentata (Progranic®Mega), pero con menor % de efectividad que el fungicida sintético (Cuadro 3).

El efecto observado desde la menor concentración del extracto metanólico de P. icosandra se podría deber a la presencia de terpenoides (Cuadro 2). No se ha reportado la actividad fungicida de P. icosandra en C. gloeosporioides, pero algunos autores mencionan la actividad insecticida del extracto de P. icosandra (^{Ángeles et al., 2011}; ^{Hernández-Villegas et al., 2011}); así como, la actividad molusquicida por la presencia de saponinas (^{Treyvaud et al., 2000}).

Control del hongo en flores de papaya

El extracto metanólico de P. icosandra superó en efectividad a los extractos hexánicos y metanólicos de las especies restantes en la evaluación in vitro; por lo tanto, fue el único que se evaluó en etapa de floración después de los 120 d desde la germinación. En cada intervalo de medición (10, 14 y 20 d) se eligieron flores nuevas. Del número total de flores evaluadas, 43, 38 y 35 flores presentaron síntomas de la enfermedad (necrosis y pudrición) a los 10, 14 y 20 d, respectivamente (Fig. 3); estas flores no fueron capaces de producir frutos. La efectividad del extracto metanólico de P. icosandra aumentó a los 14 y 20 días de la medición, pero fue inferior a la de los fungicidas comerciales, lo que explicó más síntomas del hongo en las flores en comparación con los testigos comerciales (Cuadro 4). El extracto de P. icosandra y el extracto comercial presentaron menor inhibición del halo de crecimiento micelial al mayor tiempo de exposición (20 d) que el fungicida sintético, se le atribuye a una posible degradación de los fitoquímicos, características de los extractos vegetales evaluados en campo por factores ambientales (^{Ángeles et al., 2011}; ^{Regnault et al., 2004}). Es importante mencionar que no existen reportes en la literatura sobre la evaluación del control de C. gloeosporioides en flores de papaya cv. Maradol en campo.

Fig. 3 Número de flores con síntomas típicos de antracnosis en la evaluación a los 14 d después de la inoculación y aplicación del extracto: A) Extracto metanólico de P. icosandra a 50%; B) Testigo absoluto; C) Merivon®; D) Progranic®Mega (extracto de Larrea tridentata). 

Control del hongo en frutos de papaya en poscosecha

El extracto metanólico de P. icosandra a 50% mostro una efectividad significativamente (P ≤ 0.05) similar desde los 10 d de la aplicación del extracto (Fig. 4) en la inhibición del crecimiento micelial con respecto al testigo comercial extracto de Larrea tridentata. Sin embargo, las tres concentraciones (10, 25 y 50%) del extracto de P. icosandra mostraron severidades menores a las del testigo absoluto (agua destilada), la misma tendencia se observó a los 12 d después de la inoculación (Cuadro 5). Cabe mencionar que hay muy pocas investigaciones realizadas con extractos vegetales para el control de antracnosis en frutos poscosecha. Al respecto, ^{Baños Guevara et al. (2004)} reportaron que los extractos de ajo y de eucalipto (45 y 41.7%, respectivamente) redujeron la severidad de antracnosis en frutos de papaya almacenados a 25 °C. De igual manera, los extractos de hojas de anona roja (Annona reticulata); de hoja y semilla de papaya (Carica papaya) combinadas con quitosano (2.5%) como recubrimiento del fruto redujeron el crecimiento del hongo en 20% (^{Baños et al., 2002}). La explicación de la variación de la respuesta en el control del crecimiento micelial depende del perfil químico de los extractos de cada especie vegetal (^{Ángeles et al., 2011}; ^{Regnault et al., 2004}) en el caso de P. icosandra posiblemente por la presencia de terpenoides (^{Ángeles et al., 2011}; ^{Hernández-Villegas et al., 2011}; ^{Treyvaud et al., 2000}), como las saponinas de naturaleza triterpénica reportada en diferentes especies del género Phytolaccaceae (^{Galarraga et al., 2014}; ^{Saleri et al., 2017}), sustancias que forman parte del mecanismo de defensa de algunos vegetales contra patógenos y herbívoros (^{Hussain et al., 2019}). Las características estructurales de estos metabolitos permiten explicar su diversa actividad biológica (bactericida, citotóxica, anticancerígena, insecticida) (^{Galarraga et al., 2014}; ^{Hussain et al., 2019}; ^{Saleri et al., 2017}).

Fig. 4 Frutos de papaya cv. Maradol con la aplicación a los 12 días de: A) extracto metanólico de P. icosandra a 50%; B) Testigo positivo; C) Merivon®; D) Porgranic®Mega (extracto de Larrea tridentata).