Introducción

Raphanus sativus es una planta dicotiledónea que se utiliza en cultivos de hortalizas en todo el mundo. Su número haploide es de 9 cromosomas (^{Hasterok, y otros, 2006}). Se conoce más del 76% del genoma de esta especie, el que contiene aproximadamente 61.500 genes. Se ha estudiado la secuencia del ADN mitocondrial (^{Tanaka, Tsuda, Yasumoto, Yamagishi, & Terachi, 2012}) y el ADN de los cloroplastos de R. sativus. Actualmente hay cinco "BioProjects" activos informados en Genome (NCBI) que se llevan a cabo en Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Science; Myongji University, Corea y Kazusa DNA Research Institute, Japón. Se reconocen al menos ocho líneas puras cuyos polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) se han identificado. El mapa genético de referencia para esta especie, se ha comenzado a construír (^{Mun, y otros, 2015}).

El origen evolutivo de Raphanus sativus, probablemente está en la divergencia simultánea de Raphanus y Brassica nigra a partir de un ancestro común hexaploide. La divergencia ha sido posterior a un evento de triplicación del genoma completo (^{Cheng, Liang, Cai, Cai, Wu, & Wang, 2017}). Se considera que sus semillas presentan dormición en ciertas condiciones. Sin embargo, no hay análisis concluyentes aún que permitan establecer cuál es el tipo de dormición que correspondería atribuirles (^{Baskin & Baskin, 2004}) (^{Baskin & Baskin, 2005}) (^{Tricault, Matejicek, & Darmency, 2018}). ^{Vercellino, Pandolfo, Cerrota, Cantamutto & Presotto (2019)} describieron en su trabajo reciente que las semillas frescas de R. sativus silvestres no presentan dormición. Se conocen muchos otros aspectos de su biología como por ejemplo el tamaño de los poros de la pared celular en las células de las raíces que mide de 37 a 38 Ångström descripto por ^{Carpita, Sabularse, Montezinos, & Delmer (1979)}. Este hecho permite predecir la posibilidad de que ciertas nano-partículas artificiales atraviesen la pared celular y se acumulen en los tejidos, afectando las vías metabólicas en el citoplasma y en el núcleo celular. La comprensión de la interacción de las sustancias tóxicas (especialmente de los nano-materiales sintéticos) y su posible rol en la germinación de semillas es un tema de preocupación a nivel global. Desde 1990 se han propuesto test de germinación de semillas comparativos para la evaluación de fitotoxicidad de diversas fuentes. Se han hecho, entre otros, análisis de las aguas contaminadas por metales pesados usando test de germinación de semillas (^{Wang & Keturi, 1990}) (^{Pirdosti, Movahedi, & Rostami, 2018}).

La literatura relacionada al efecto que tienen las AgNPs (nanopartículas de plata) ha sido revisada (^{Tripathi, y otros, 2017}). Dichos autores han mostrado que las mismas afectan importantes procesos metabólicos en las plantas. Aún quedan por describir detalladamente los efectos que producen sobre la germinación y así poder modelizar estas semillas y su germinación. Aquí se consideró a la germinación definida como la emergencia de la radícula a través de la cubierta de la semilla y que se corresponde con la fase temprana del complejo proceso de germinación que se observa por la ruptura de la testa (^{Bewley, Seed Germination and Dormancy, 1997}), (^{Copeland & Mc Donald, 2001}), (^{Weitbrecht, Müller, & Leubner - Metzger, 2011}).

Se han determinado efectos macroscópicos perjudiciales ocasionados por nano-materiales que se manifiestan en inhibición del crecimiento de las plántulas y la floración (^{Rico, Majumdar, Duarte-Gardea, Peralta-Videa, & Gardea-Torresdey, 2011}). Sin embargo, actualmente, no hay estudios concluyentes acerca de la fitotoxicidad de las nano-partículas. Se sabe que el cadmio (Cd) el cobre (Cu) y el plomo (Pb) se acumulan en las hojas, las flores de R. sativus, haciéndolas potencialmente tóxicas para los animales herbívoros y los polinizadores (^{Hladun, Parker, & Trumble, 2015}). Previamente se ha descripto la presencia de plomo el que puede depositarse intracelularmente en las células de diversos tejidos de las plantas y de las semillas de R. sativus (^{Lane & Martín, 1982}). El estrés abiótico producido por cobre en R. sativus está vinculado a la función reguladora de los brasinosteroides y las poliaminas (^{Choudhary, Oral, Bhardwaj, Yu, & Tran, 2012}).

En este trabajo analizamos la morfología externa e interna de las semillas. Observamos la germinación con el objetivo de contribuir al establecimiento de un modelo de semillas para estudios de toxicidad de compuestos químicos y nano-partículas de plata a nivel local.

Otros autores también han usado las semillas de Raphanus sativus para la descripción de los efectos tóxicos que algunas sustancias químicas tienen para la germinación (^{Wu, Huang, Head, Chen, Kong, & Tang, 2012}), (^{Husen & Siddiqi, 2014}), (^{Siddiqi & Husen, 2017}).

Si bien los porcentajes de germinación de R. sativus no se ven alterados por la presencia de nanocompuestos de plata en concentraciones menores que 500 mg/L, estos compuestos son fitotóxicos y afectan la elongación radicular y el contenido de agua así como inducen cambios conformacionales en carbohidratos, lignina y lípidos pudiendo tener un efecto deletéreo para la salud cuando se utilizan rabanitos contaminados en la dieta (^{Zuverza-Mena, Armendariz, Peralta -Videa, & Gardea -Torresdey, 2016}), (^{Zuverza-Mena, y otros, 2017}).

Raphanus sativus ha demostrado ser un alimento saludable en la dieta y la salud humana porque parece tener un efecto antidiabético debido a su capacidad para mejorar el mecanismo antioxidante y disminuir el estrés oxidativo (^{Banihani, 2017}). Raphanus sativus es una especie que está siendo estudiada profusamente y que se está incorporando como modelo biológico en ciencia como queda en evidencia al consultar los trabajos científicos publicados por diversos autores (^{Kitashiba, y otros, 2014}), (^{Nie, y otros, 2016}).

Material y métodos

Germinación

Para analizar la germinación de las semillas de R. sativus se observó la ruptura de la cubierta seminal y la emergencia de la radícula en dos experimentos realizados por separado en las mismas condiciones con 50 semillas cada uno. El número total de semillas analizadas fue 50 x 2 (N=100) y se eligieron al azar de un grupo conteniendo al menos 1000 semillas.

Las semillas se trataron durante 20 minutos con una solución de hipoclorito de sodio al 20% para evitar la proliferación de microorganismos (hipoclorito de sodio 58grCl/l producto de venta libre que se usó diluido al 20% en agua). Luego se hicieron cinco lavados con agua destilada. Así tratadas se colocaron 10 semillas sobre papel Whatman Nº1 en cada placa de Petri de 50 mm de diámetro. Se colocó 1 ml de agua destilada sobre el papel Whatman que se mantuvo húmedo. Por cada experimento se colocaron cinco placas de Petri con 10 semillas cada una en una cámara oscura teniendo especial cuidado con el mantenimiento de las condiciones de esterilidad para evitar la proliferación de microorganismos.

La temperatura de incubación utilizada fue de 22 ± 2 °C de acuerdo a las especificaciones técnicas recomendadas para Raphanus sativus en el ISTA - Handbook on Seedling Evaluation; Third Edition (^{Don, Kahlert, & McLaren, 2013}). Las semillas se observaron a partir de las 12 hs. de imbibición durante los 7 días posteriores (168 horas) registrándose el número de semillas que mostraron ruptura de la cubierta seminal. Las semillas que mostraron ruptura de la cubierta seminal se contabilizaron como indicador positivo de germinación. Para la definición de germinación, proceso que incluye los eventos que comienzan con la captación de agua por parte de la semilla quiescente y termina con la elongación del eje embrionario, se ha tenido en cuenta la bibliografía clásica para el tema (^{Bewley & Black, Seeds - Physiology of Development and Germination, 1994}). En este caso se trabajó con el concepto de “germinación visible” tal como lo han descripto dichos autores.

Se calculó el porcentaje de germinación como el número de semillas germinadas multiplicado por 100 y dividido por el número total de semillas tratadas. Para una primera evaluación del crecimiento radicular, las semillas se colocaron sobre papel milimetrado y se midieron las longitudes alcanzadas por las radículas (Fig. 1b).

Fig. 1 a. Semillas secas de Raphanus sativus. b. Crecimiento de la radícula a las 48 horas de imbibición (22 ± 2 °C). c. Aspecto típico de una semilla de Raphanus sativus que ha roto la cubierta seminal con 20 horas de imbibición (magnificación 20X). 

El agua utilizada durante este trabajo en los lavados de las semillas y la imbibición de las mismas fue agua purificada por destilación. Para determinar el grado de pureza, fue analizada mediante el uso del principio de espectroscopia de fluorescencia de rayos X de reflexión total (TXRF) con un equipo de la marca Bruker modelo S2 PICOFOX. Se hallaron bajas concentraciones de los siguientes elementos: Calcio (≤0.20 mg/L), Potasio (≤0.10 mg/L), Titanio (≤0.05 mg/L), Arsénico (≤0.01mg/L), Cromo (≤0.01mg/L), Cobre (≤0.01mg/L), Hierro (≤0.01mg/L), Manganeso (≤0.01mg/L), Níquel (≤0.01mg/L), Rubidio (≤0.01mg/L), Estroncio (≤0.01mg/L), Vanadio (≤0.01mg/L) y Zinc (≤0.01mg/L).

El pH del agua utilizada fue de 6.7 ± 0.01 el cual se midió con un medidor de pH profesional de mesada. El valor del pH del agua utilizada, estuvo comprendido dentro del rango aceptado y que no afecta los resultados de la germinación en esta especie de acuerdo a las recomendaciones halladas en el ISTA - Handbook on Seedling Evaluation; Third Edition (^{Don, Kahlert, & McLaren, 2013}).

Resultados

Morfología y Microscopía Electrónica de Barrido

Las semillas de Raphanus sativus variedad Sparkler White tip se caracterizan por tener forma esférica irregular u ovoide de aproximadamente 3 milímetros de diámetro. El color de la cubierta seminal está entre los pardos claros. La longitud media (y desvío estándar: SD) fue 3.11 (0.35) mm y el ancho medio (SD) de las semillas fue 2.59 (0.42) mm (Fig. 1a).

El análisis realizado por microscopía electrónica de barrido (MEB) permitió observar la morfología y el patrón de ornamentación de la cubierta seminal (Cs). La cubierta presenta un patrón básico de ornamentación en la superficie. Las semillas maduras y secas se caracterizaron por presentar una ornamentación que corresponde al denominado patrón de ornamentación reticulado según lo descripto por (^{Zeng, Wang, Liu, & Wu, 2004}). Este es el patrón más común que presentan las semillas del género Brassica que pertenecen a la misma familia que Raphanus sativus: Brassicaceae. No presenta pelos seminales y toda la superficie es uniforme (Fig. 2a y 2b).

Fig. 2 a. Microscopía electrónica de barrido (MEB) de una semilla de Raphanus sativus (escala = 500µm). b. Detalle de la superficie de la cubierta seminal de la semilla ilustrada en la Figura 2a (escala= 200µm). c. Detalle del tegumento. Se observan el tegumento externo (te), el tegumento interno (ti), la cutícula y las células del tejido de los cotiledones (Co). Par: capa de células parenquimatosas. Escala= 50 µm). d. Detalle de la capa externa del tegumento E = Epidermis, S=Subepidermis, Par= capa de células parenquimatosas (escala= 0,02µm). e. Semilla de Raphanus sativus con 45 horas de imbibición (22 ± 2 °C) donde se observan claramente los cotiledones y la radícula emergida a través del tegumento. R= radícula, Co=cotiledones, Cs=cubierta seminal. Escala= 1 x 10³ µm. f. Ápice de la radícula (R) en crecimiento (detalle de la radícula de la Figura 2e).  

Cubierta seminal (Cs) e Histología

La cubierta seminal es delgada (mide entre 40 y 50 micrones) y se desprende con facilidad al embeber las semillas. La observación del corte transversal de la semilla con MEB permite apreciar una lámina externa que corresponde a la presencia de mucílago (m), una epidermis/subepidermis (E/S) y una capa de células parenquimatosas (Par) (Fig. 2c y 2d). En los cortes histológicos de la cubierta seminal se observan cuatro capas de células. En la zona externa la epidermis (E) y subepidermis (S) cuyas células presentan cierta dificultad para diferenciarlas. La parte interna está formada por una capa de células en empalizada pigmentada (Pal) y hacia el interior se presenta una capa parenquimatosa (Par) (Fig. 3).

Fig. 3 a. Vista general en corte de la semilla luego de 20 horas de imbibición (22 ± 2 °C). Se observa el embrión y el tegumento o cubierta seminal (CS). Del embrión se observan el tejido de la radícula (R) y los tejidos cotiledonales (Co). b. El mismo corte de la Figura 3a mostrando en detalle la radícula en expansión emergiendo a través del tegumento seminal. c. Detalle del tejido de los cotiledones. d. Corte histológico donde se puede observar la radícula en crecimiento a las 45 horas de imbibición (22 ± 2 °C). Co = cotiledones; R = radícula; Cs = Cubierta seminal. e. Detalle del tejido de la radícula en crecimiento de la Figura 3d (Co = cotiledones; R = radícula; am = ápice meristemático; Cs = Cubierta seminal). f. Cubierta seminal en corte donde se observan las capas de células y el mucílago que las recubre (m = mucílago; E = epidermis; S = sub epidermis; Par = capa de células parenquimatosas; Pal = capa de células en empalizada pigmentadas; Co = tejido de los cotiledones). 

La ruptura de la cubierta seminal y la emergencia de la radícula ocurren en las semillas a partir de las 20 horas de imbibición (Fig. 1c) y a las 45 horas casi todas las semillas viables han germinado. En la Figura 2e se muestra el detalle de los cotiledones (Co) la cubierta seminal (Cs) y la radícula en crecimiento (R). Las secciones longitudinales realizadas a través del extremo de la raíz de R. sativus a las 20 y 45 horas de imbibición muestran claramente la morfogénesis de los tejidos. En las imágenes obtenidas por MO (Microscopía óptica) las células de la radícula en crecimiento se observan de forma cilíndrica y vacuoladas (Fig. 3d y 3e) mientras que el ápice meristemático (am) presenta células pequeñas con contenido denso y núcleos grandes. A su vez, el ápice meristemático se encuentra cubierto por la cofia (Fig. 2e y 2f).

Discusión

Se halló una publicación donde se describen semillas adjudicadas a la misma especie: Raphanus sativus (^{Kasem, Ghareeb, & Marwa, 2011}). Los autores informaron para las semillas colectadas en Egipto una medida de 0.8 x 1 mm con un aspecto de la cubierta seminal observado por MEB muy similar a la hallada en nuestra muestra de semillas. Es muy infrecuente que semillas de la misma especie muestren una diferencia de tamaño tan grande. Los factores que pueden influenciar el tamaño de las semillas son tanto genéticos como ambientales y en este caso nos resulta difícil explicar a qué se podría deber tal diferencia de tamaño.

El porcentaje de germinación hallado podría ser una subestimación de la viabilidad de estas semillas en comparación con otros casos como el de las semillas de Colombia. Esto podría deberse a factores endógenos de las semillas, a efectos ambientales de nuestras condiciones experimentales o a una sub estimación por la forma de observación empleada. La viabilidad podría estimarse de otro modo mediante el uso de otras técnicas con fines comparativos. Mediante el test de tetrazolio, algunos autores han señalado una viabilidad del 99% y 97% para las semillas de Raphanus sativus colectadas por ellos en Colombia (^{Salazar Mercado, Quintero Caleño, & Urbano, 2019}). Dado que para realizar un test de germinación con el objetivo de establecer fitotoxicidad, las semillas se exponen a condiciones controladas, los posibles efectos de dormición de las semillas no afectarían los resultados de un test realizado con fines ecotoxicológicos. Creemos que habrá que refinar el modelo de semillas a utilizar para estudios futuros y avanzar en la caracterización genética de las mismas. Las semillas de Raphanus sativus pueden germinar fácilmente de acuerdo al método empleado en el presente estudio, en la oscuridad y con una temperatura de entre 20ºC (mínima) y 24ºC (máxima). En este trabajo la germinación se realizó en la oscuridad por lo cual las observaciones son independientes del posible efecto del estímulo lumínico. Hay autores que mencionan la existencia de fotoinhibición en la germinación en R. sativus. Se ha descripto que la luz tiene un efecto inhibitorio de la germinación en esta especie (^{Schopfer & Plachy, 1993}); (^{Gül & Levent, 2008}). Como se ha mencionado, recientemente en la literatura científica se ha demostrado que la luz redujo la germinación en semillas de R. sativus silvestres y la fotoinhibición persistió en semillas almacenadas en seco incluso después de 30 meses (^{Vercellino, Pandolfo, Cerrota, & Cantamutto, 2019}). Por ello se conjetura que estas semillas sólo deben utilizarse para estudios de fitotoxicidad si se las somete a la oscuridad para la germinación.

^{Sethy & Ghosh (2013)} analizaron los efectos deletéreos que tienen los metales pesados sobre las semillas y el proceso de germinación. Previamente ^{Stanton (1984)} había indicado que en semillas de Raphanus sativus silvestres, no hay una correlación sencilla entre el tamaño de las semillas el tiempo de germinación y la elongación radicular durante las primeras horas luego de la rotura de la testa. Se ha demostrado que el contenido de azúcares reductores aumenta en los cotiledones cuando la germinación de R. sativus ocurre en un ambiente iluminado (^{Huff & Ross, 1975}). Las hormonas como ABA tienen efecto inhibitorio de la germinación en semillas de Raphanus sativus (^{Schopfer, Plachy & Frahry, 2001}). Sin embargo la fisiología de la inhibición de la germinación, que sabemos está relacionada a los efectos de la luz y vinculada a "especies reactivas al oxígeno", no ha sido completamente descripta hasta el momento. Considerando que hay diversos factores moleculares que afectan a la germinación como por ejemplo quinasas que actúan como “checkpoint” o puntos de control del ADN y que los vínculos entre el “stress” genotóxico y el envejecimiento de las semillas son complejos (^{Waterworth, Footitt, Bray, Finch-Savage, & West, 2016}) en este trabajo nos concentramos en hacer una observación preliminar de la germinación de las semillas a las cuales tenemos acceso localmente.

Conclusiones

Este trabajo se realizó en el marco de un proyecto que tiene como objetivo la evaluación de efectos de toxicidad ocasionada por nano-partículas. Como resultado de las observaciones realizadas concluímos que las semillas de Raphanus sativus son útiles como biomarcadores de estrés en ecotoxicología debido a que tienen una alta viabilidad (alto porcentaje de germinación) y las características de su morfología como el tipo de superficie de la cubierta seminal son ideales para ser utilizadas tanto en test de germinación como en análisis de interacciones entre las semillas y las sustancias tóxicas. Por lo analizado en nuestro trabajo experimental y por las referencias bibliográficas halladas en la literatura científica como el trabajo de ^{Kostka-Rick & Manning, (1993)} concluímos que las semillas de esta especie son aptas para modelizar en estudios de ecotoxicología permitiendo la realización de un test en menos de 48 horas. Podríamos criticar la calidad o pureza genética del material utilizado, sin embargo se proyecta continuar con la caracterización genética de nuestro material de semillas que se encuentran disponibles a nivel local.