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Introducción
Las plantas pueden utilizar distintas formas de nitrógeno (N), molécula muy importante en el crecimiento vegetal. Diferentes experimentos han mostrado que las plantas acuáticas presentan un mejor crecimiento bajo mezclas de amonio (NH4 +) y nitratos (NO3 -) (Clostre & Suni, 2007; Raven et al., 1992). Algunas especies tienen un mejor crecimiento con mayores concentraciones del NH4 +, pues su asimilación requiere menos energía que el NO3 - (Zuluaga-González, 2017). Otras especies manifiestan síntomas de toxicidad cuando hay concentraciones altas de NH4 +, presentando un mejor crecimiento cuando NO3 - predomina como fuente esencial de N (Britto et al., 2001). Conocer las proporciones de NO3 -:NH4 + para el crecimiento de especies útiles es fundamental para lograr una producción a gran escala de las mismas (Holzschuh et al., 2009; Houdusse et al., 2005; Rao et al., 2018; Van Beusichem et al., 1988).
Limnobium laevigatum (Familia Hydrocharitaceae) (Humb. & Bonpl. ex Willd.) es una planta acuática que se encuentra frecuentemente en las regiones costeras del continente americano, habiendo registros desde México Central hasta Argentina (Cook & Urmi-König, 1983). Esta especie, que en Perú se distribuye en los departamentos de Loreto, Ucayali y Lima (Ramirez & Cano, 2011), se caracteriza por tener un gran potencial para su uso como forraje (hasta 30% de proteínas en biomasa seca) pudiéndose implementar en dietas para peces por su bajo contenido en fibra y alto valor proteico (Aponte et al., 2013). L. laevigatum presenta una propagación rápida y capta cantidades importantes de carbono durante su crecimiento (1.79 T/ha/año); por ello, en los últimos años, se han realizado esfuerzos por optimizar su crecimiento, ya sea bajo diferentes condiciones lumínicas, diferentes concentraciones de nutrientes, así como la influencia de la aireación y salinidad; demostrando que esta especie presenta un crecimiento óptimo a mayores cantidades de luz, bajas concentraciones de nutrientes de soluciones hidropónicas comerciales (25% Solución San Marcos), ausencia de aireación y bajas concentraciones de salinidad (Aponte, 2016, 2017; Aponte & Pacherres, 2013; Troncoso-Gómez & Aponte, 2020). Un factor aun no estudiado en el crecimiento de esta planta es cómo la proporción NO3 -:NH4 + en la solución nutritiva para su cultivo puede afectar su crecimiento. Dicha proporción, correctamente administrada, ha mejorado el crecimiento de muchas plantas acuáticas como Vallisneria natans (Lour.) H.Hara, Lemna gibba (L.) Moench, Eichhornia crassipes (Mart.) Solms (Cao et al., 2007; Clostre & Suni, 2007; Reddy & Tucker, 1983) y podría ser benéfica en el crecimiento de esta especie. Por esta razón, el presente estudio buscó evaluar el crecimiento de Limnobium laevigatum probando diferentes proporciones de NO3 -:NH4 + bajo condiciones de laboratorio.
Material y métodos
Periodo de aclimatación
Se colectaron rametos (copias de la planta reproducida vegetativamente) de Limnobium laevigatum ubicados en la zona de amortiguamiento del Refugio de Vida Silvestre Los Pantanos de Villa (18L 284263.97 O - 8649114.35 S, 5 m sobre nivel del mar), provincia de Lima, Perú, con la autorización N°AUT-IFL-2018-004 de SERFOR. Luego, las muestras fueron trasladadas al Laboratorio de Investigación de la Universidad Científica del Sur. Se limpiaron los rametos y se distribuyeron en tanques de 20 L para su propagación y aclimatación durante 30 días con una solución hidropónica (solución 6:1 de Tabla 1; recomendada en Aponte, 2017). Durante este periodo, se evaluó las condiciones bajo las cuales crecieron los ejemplares (temperatura, humedad, iluminación y fotoperiodo) tres veces al día durante los 30 días de aclimatación (Tabla 2).
Tabla 1 Valores de los elementos en partes por millón (ppm), pH y conductividad (mS/cm) de las soluciones nutritivas utilizadas en cada tratamiento (NO3 -:NH4 +)
| Elemento | 6:1 | 3:1 | 1:1 | 1:3 |
|---|---|---|---|---|
| NO3 - | 42.5 | 37.8 | 24.8 | 12.2 |
| NH4 + | 7 | 13 | 24.8 | 37.1 |
| K | 69.52 | 69.52 | 69.52 | 69.52 |
| P | 10.4 | 10.4 | 10.4 | 10.4 |
| Mg | 27.47 | 27.47 | 27.47 | 27.47 |
| S | 54.22 | 54.22 | 54.22 | 54.22 |
| Ca | 116.2 | 116.2 | 116.2 | 116.2 |
| Fe | 0.39 | 0.39 | 0.39 | 0.39 |
| Mn | 0.13 | 0.13 | 0.13 | 0.13 |
| Zn | 0.14 | 0.14 | 0.14 | 0.14 |
| Cu | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 |
| B | 0.77 | 0.77 | 0.77 | 0.77 |
| Mo | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| pH | 8.2 | 8.1 | 8.03 | 8 |
| Conductividad | 3.83 | 3.86 | 3.86 | 3.94 |
Tabla 2 Condiciones de Humedad, Temperatura, Iluminación y Fotoperiodo durante la etapa de aclimatación (30 días) y experimentación (28 días). Los datos serán mostrados como Promedio ± DE (Min-Max).
| Parámetros | Aclimatación | Experimentación |
|---|---|---|
| Humedad Relativa (%) | 48.62 ± 8.73 (23-76) | 45.07 ± 7.17 (33-62) |
| Temperatura del agua (°C) | 21.23 ± 1.07 (18-24.4) | 22.02 ± 1.81 (18.1-28.3) |
| Temperatura laboratorio (°C) | 24.40 ± 1.65 (20.1-30.2) | 24.34 ± 1.41 (21.3-27.4) |
| Iluminación (µmol/m2/s) | 130.41 ± 78.81 (21.28-394.05) | 181.19 ± 173.76 (32.93-743.7) |
| Fotoperiodo (horas/día) | 12.35 ± 0.06 (12.24-12.45) | 12.14 ± 0.05 (12.05-23.23) |
Diseño Experimental
Se evaluó cuatro tratamientos de diferentes proporciones de NO3 -:NH4 + (6:1; 3:1; 1:1; 1:3) con 20 repeticiones (unidades experimentales, UE) por tratamiento (Aponte & Pacherres, 2013); el contenido de cada solución se encuentra en la Tabla 1. Las UE fueron constituidas por un rameto obtenido en la etapa de aclimatación, estos fueron situados en un vaso de precipitado de 600ml cubiertos por un plástico negro que evitaba el ingreso lateral de luz para impedir el crecimiento de microalgas. Cada UE contuvo 300ml de la solución hidropónica del respectivo tratamiento. Las UE fueron distribuidas aleatoriamente. Al inicio del experimento, cada rameto tenía en promedio (± Desviación Estándar) 2.27 ± 0.45 hojas, un peso de 0.16 ± 0.04g, una longitud máxima de la raíz de 0.74 ± 0.31cm y un área foliar de 2.23 ± 0.44 cm2. Cada siete días se tomaron los siguientes parámetros de crecimiento en las plantas: número de rametos, hojas totales, hojas cloróticas, hojas muertas, peso húmedo total (g), tamaño de la raíz más larga (cm) y área foliar (cm2). Cada tres días se limpiaron las UE y se hizo el recambio de la solución hidropónica, con el objetivo de mantener las mismas condiciones de nutrientes durante el experimento y evitar la contaminación por presencia de microalgas. Al finalizar el experimento, se obtuvo el peso seco total (g) y la tasa de crecimiento relativa (TCR) definida por la fórmula desarrollada en Hoffmann & Poorter (2002):
Donde WF y WI, corresponden al peso húmedo final e inicial de cada UE (i), y la diferencia de tiempos (t2-t1) fue el número de días que duró el experimento.
Todos los días se registró los datos de temperatura, humedad, iluminación y fotoperiodo, para corroborar que los parámetros físico-químicos fueron homogéneos durante este periodo. Estos datos fueron registrados, tres veces al día, hasta culminar el experimento luego de 28 días, tiempo en el cual Limnobium laevigatum presenta un crecimiento exponencial y cubre el espacio superficial de la unidad experimental (evitando de esta manera una sobreposición de los rametos; Aponte, 2017). Los datos de esta etapa se encuentran en la Tabla 2.
Procesamiento de datos y análisis estadístico
Se realizaron estadísticos descriptivos para cada variable evaluada por tratamiento (Promedio ± Desviación Estándar). Se obtuvo el porcentaje de hojas cloróticas (% CL) en función al número total de hojas vivas contadas; el porcentaje de hojas muertas (% HM) se obtuvo en función al número total de hojas, considerando las vivas (incluyendo cloróticas) y muertas vistas en el momento del conteo.
Posteriormente, se comprobó la normalidad de los datos (prueba de Shapiro-Wilk) y al no cumplir el requisito (p < 0.05), se procedió a realizar la prueba no paramétrica de Kruskall Wallis, seguida de la prueba a posteriori de Mann-Whitney. Todos estos análisis y los gráficos se realizaron en el software PAST V. 2.14c. (Hammer et al., 2009) y Excel 2013 (©Microsoft).
Resultados
En el periodo de aclimatación y experimentación no hubo diferencias significativas en los datos de temperatura, humedad, iluminación y fotoperiodo, estos resultados demostraron ser homogéneos sin que puedan influir significativamente durante la etapa de experimentación (Tabla 2).
Durante el periodo de experimentación el tratamiento 6:1 (NO3 -:NH4 +), fue el que presentó mayor número de hojas, número de rametos, peso húmedo, área foliar y longitud de raíz; el tratamiento 1:3 presentó los valores más bajos para todos estos parámetros (Figs. 1 y 2). Con respecto a la clorosis y hojas muertas, el tratamiento 6:1 fue el que presentó menor porcentaje para ambos parámetros, y el tratamiento 1:3 fue el que presentó mayor porcentaje. Al finalizar el experimento, el tratamiento 6:1 fue el que obtuvo la mayor TCR (0.08; Fig. 3a) y ganancia de peso seco (0.17 g; Fig. 3b), y el tratamiento 1:3 la menor TCR (-0.04; Fig. 3a) y pérdida de peso seco (-0.006 g; Fig. 3b).
Fig. 1 Limnobium laevigatum sometida a cuatro tratamientos de NO3 -:NH4 + (6:1, 3:1, 1:1, 1:3) durante el periodo de experimentación. El tratamiento 6:1 es el que presenta mayor número de hojas y número de rametos. A diferencia del tratamiento 1:3, el cual presenta menor número de hojas y rametos.
Fig. 2 Evolución del Peso Húmedo (a), Longitud de la Raíz (b), Número de Hojas (c), Número de rametos (d), Área Foliar (e), Porcentaje de hojas cloróticas (f), Porcentaje de hojas muertas (g) durante los 28 días del experimento. Tratamientos: ♦=6:1, ▄=3:1, ▲=1:1 y X=1:3 para la proporción NO3:NH4 +. Las letras en las figuras representan el resultado del análisis estadístico a posteriori de Mann-Whitney.
Fig. 3 (a) Tasa de crecimiento relativo (TCR) por tratamiento. (b) Ganancia de peso seco por tratamiento a los 28 días de experimento. Las letras en las figuras representan el resultado del análisis estadístico a posteriori de Mann-Whitney.
Se encontró diferencias significativas entre los tratamientos 6:1 y 1:3, para el peso húmedo, longitud de raíz, número de hojas, número de rametos, número de hojas muertas, área foliar, tasa de crecimiento y peso seco (p < 0.05, p=5.98×10-8, p=5.56×10-8, p=5.82×10-8, p=5.59×10-8, p=8.59×10-8, p=6.02×10-8, p=3.1×10-6, p=5.73×10-8, respectivamente), a excepción del porcentaje de hojas cloróticas (%CL) (p > 0.05, p=0.12). Sin embargo, los tratamientos 3:1 y 1:1 no presentaron diferencias estadísticamente soportadas entre ellos para ninguno de los parámetros mencionados: peso húmedo, longitud de raíz, número de hojas, número de rametos, número de hojas cloróticas, número de hojas muertas, área foliar y peso seco (p > 0.05, p=0.24, p=0.88, p=0.17, p=0.21, p=0.12, p=0.32, p=0.37, p=0.16, respectivamente), a excepción de la tasa de crecimiento (p < 0.05, p=0.02) (Fig. 2).
Discusión
La presente investigación muestra el efecto de las diferentes proporciones NO3 -:NH4 + en el crecimiento de Limnobium laevigatum, donde altas concentraciones de NO3 - favorecieron su desarrollo (Fig. 2a, 1b, 1c, 1d, 1e; Fig. 3) y altas concentraciones de NH4 + se mostraron negativas, generando una mayor mortalidad foliar (Fig. 2g). Resultados similares fueron obtenidos por Reddy & Tucker (1983) en Eichhornia crassipes y Clostre & Suni (2007) en Lemna gibba, donde se usaron proporciones similares a las del presente experimento.
En los primeros siete días del experimento, el tratamiento con mayor concentración de NH4 + (1:3) no presentó diferencias con los otros tratamientos (en todos los parámetros excepto longitud de raíz y peso húmedo; Fig. 2). Esto, pudo deberse a un mecanismo de defensa intracelular que tienen las plantas acuáticas y que genera una mayor producción de enzimas antioxidantes: por ejemplo, catalasa, glutatión-S-transferasa y guaiacol peroxidasa; las cuales impiden la inducción al estrés oxidativo causado por el NH4 + (Díaz et al., 2010; Peralta-Pérez & Volke-Sepúlveda, 2012). Esta actividad ha sido reportada en plantas acuáticas como Potamogeton crispus L. y Myriophyllum mattogrossense Hoehne (Cao et al., 2004; Nimptsch & Pflugmacher, 2007).
A partir de la segunda semana del experimento, se evidenció que el crecimiento de L. laevigatum era menor bajo la proporción 1:3 de NO3 -:NH4 +. Este tratamiento, al poseer mayor concentración de amonio, pudo afectar la actividad enzimática del nitrato y nitrito reductasas provocando una inhibición en la asimilación del nitrato (Martínez, 2003; Rodríguez & Piñeros, 2007). Asimismo, pudo haber un mayor gasto energético en la respiración, correlacionándose a una disminución en el crecimiento de esta especie, como ocurrió en Hordeum vulgare L., cultivada en un medio hidropónico (Britto et al., 2001); si bien esta última especie no es una planta acuática, los resultados son reportados para su crecimiento bajo condiciones semejantes a las de Limnobium laevigatum en esta investigación.
Es oportuno recordar el rol que juegan los nitratos en el metabolismo de iones importantes como el potasio (K+). La recirculación de cationes como el K+ dentro de la planta, depende de la presencia y reducción del NO3 -; estas moléculas absorbidas por las raíces son trasladadas a las hojas, donde ocurre este proceso; por cada ion reducido de NO3 - se forma un ion malato, el cual junto al K+ es transportado nuevamente a las raíces, donde el malato libera OH- y genera una mayor absorción de NO3 - (Zioni et al., 1971). Debido a este mecanismo, la recirculación del K+ es favorecida; sin embargo, cuando hay bajas concentraciones de nitrato reducido en las hojas, la circulación del K+ es menor. Bajo este contexto, el mayor crecimiento de L. laevigatum en la proporción 6:1 probablemente se debe a que; existe una mejor absorción de cationes como el potasio (K+) y también otros iones como magnesio (Mg+) y calcio (Ca+), lo cual no se cumple cuando el amonio predomina en el medio, impidiendo la eficaz recirculación de cationes en la planta, generando un desequilibrio nutricional (Van Beusichem et al., 1988).
Los resultados del presente estudio muestran cómo la disponibilidad y proporciones de nutrientes en la columna de agua influyen en la abundancia de las plantas acuáticas. A fin de continuar esta línea de investigación será importante conocer en próximos estudios las cantidades adecuadas de otros elementos esenciales para la mayor propagación de L. laevigatum, entre los cuales están: el magnesio (Mg), el fósforo (P) o el potasio (K); nutrientes que forman parte de procesos esenciales como la fosforilación y desfosforilación, funcionamiento de enzimas (ATPasa, fosfatasas y carboxilasas), o promueven la síntesis, translocación y almacenamiento de carbohidratos (Navarrete, 2017; Samborska et al., 2018; Thiébaut, 2005). Este trabajo permite conocer la mejor proporción de NO3 -:NH4 + (6:1) para la propagación de L. laevigatum en laboratorio, sumándose a los resultados previamente descritos de concentración de nutrientes, intensidad lumínica, salinidad y aireación (Aponte, 2016; Aponte & Pacherres, 2013; Troncoso-Gómez & Aponte, 2020). Estos conocimientos contribuyen para lograr establecer las mejores condiciones de cultivo de esta planta acuática.
Conclusiones
El mejor crecimiento de Limnobium laevigatum se obtuvo bajo la proporción 6:1 (NO3 -:NH4 +), donde hubo mayor número de hojas, rametos, peso húmedo, área foliar y longitud de raíz. Estos resultados indicaron que mayores concentraciones de nitratos favorecen el rendimiento de esta especie, optimizando sus condiciones de cultivo en laboratorio.
