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Introducción
El café (Coffea arabica) es una de las plantas más cultivadas y comercializadas en México, siendo Chiapas el principal estado productor de café orgánico (Temis, Lópes & Sosa, 2011). Uno de los principales problemas en la producción de café es la enfermedad de la roya, la cual puede causar pérdidas de rendimiento de hasta el 50% (Florez et al., 2017). Actualmente, es el principal problema al que se enfrenta el sector cafetalero en México. El agente causal es Hemileia vastatrix, el cual es un hongo biótrofo que depende completamente de las células vivas de la planta para su reproducción (Florez et al., 2017), por lo que afecta principalmente el follaje de C. arabica, provocando una defoliación total de las plantas hasta ocasionar su muerte, originando así, pérdidas de hasta un 40% de los cultivos (Fernandez et al., 2012). Para el control de éste hongo, se han empleado fungicidas a base de cobre, triazoles y estroburilinas, microorganismos antagónicos, defoliaciones, por mencionar algunos (Fernandez et al., 2012; Haddad, Saraiva, Mizubuti, Romeiro & Maffia, 2013). Sin embargo, se sabe que las plantas tienen numerosos mecanismos de defensa para contrarrestar los efectos ocasionados por el estrés biótico y abiótico. En el caso del estrés biótico, las plantas activan mecanismos inducidos a través de la respuesta hipersensible, ocasionando la acumulación de metabolitos (ya sea los que se encuentran como componentes estructurales constitutivos como callosa y lignina) y la biosíntesis de fenilpropanoides, así como induciendo la actividad de enzimas antioxidantes (Castillo, Hernández, Gallegos, Rodríguez, & Aguilar, 2012).
Las estrategias empleadas para controlar el hongo han permitido elucidar algunos mecanismos de defensa que tienen las plantas de café para contrarrestar el agente infeccioso, tales como la expresión genética de enzimas antioxidativas e hidrolíticas y algunas relacionadas a la patogénesis (ejemplo: glucanasa, catalasa, y fenilalanina amonio liasa). Las respuestas defensivas de la planta pueden actuar inhibiendo la expresión de genes del hongo e incluso en la degradación de la pared fúngica, sin embargo, la infección aún no se ha logrado erradicar, y los agricultores tienden a estar en constante vigilancia para mantener el control de la rápida diseminación de la enfermedad (Loureiro, Gil, Maria, Talhinhas, & Money, 2015).
La enfermedad de la roya del café, causada por el hongo H. vastatrix, es una de las principales enfermedades del café en todo el mundo. El uso de cultivares resistentes es considerada una de las estrategias de control más efectiva para esta enfermedad (Florez et al., 2017). En ocasiones, en los cultivos de café infectados con H. vastatrix se pueden observar plantas con ausencia de síntomas. El estudio de éstas plantas asintomáticas, es de suma importancia y más aun tratándose de conservación y preservación del germoplasma resistente a H. vastatrix. De igual manera el desarrollo de las plantas y el rendimiento de la producción de café, son también factores muy importantes para los agricultores (Castillo et al., 2012).
El estudio de plantas asintomáticas ante la incidencia de la roya en cultivos de café orgánico es de vital interés para establecer programas de propagación de germoplasma y de mejoramiento, por lo que el presente trabajo tuvo como objetivo determinar la actividad enzimática de quitinasa, β-1,3-glucanasa y peroxidasa, cuantificación de fenoles totales, ácido clorogénico, ácido criptoclorogénico, ácido neoclorogénico, ácido ferúlico, ácido cafeico, ácido gálico y cafeína en plantas infectadas (sintomáticas) y no infectadas (asintomáticas) de C. arabica cultivadas en un sistema de producción orgánico, con muestreos antes y durante la incidencia de la infección por roya de manera natural en campo. Se espera relacionar la presencia y/o concentración de compuestos fenólicos y la actividad de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) como las quitinasas, glucanasas y peroxidasas con la resistencia a la enfermedad.
Material y métodos
Área de estudio y colecta de muestras
Se estableció el área de colecta en las plantaciones de café ubicadas en la localidad de Chaná, municipio de Tenejapa, Chiapas (HO-92°29´00.1; N-16°53´30.6; altitud: 1591 m) en donde las temperaturas oscilan entre 12°C y 26°C. La incidencia de la enfermedad por roya de manera natural se registra en épocas de lluvias; por lo cual, las colectas se llevaron a cabo en dos temporadas: 1) antes de las lluvias (sin incidencia de roya-antes de la infección (ai)) y 2) después de éstas (con incidencia de roya-durante la infección (di)) en plantas susceptibles y no susceptibles a la enfermedad. Las plantas susceptibles fueron denominadas infectadas (i) y las no susceptibles no infectadas (Ni). Las hojas fueron colectadas al azar a partir de ramas ubicadas en la parte media-superior del tallo (FERTILAB, 2012) y de las mismas plantas para ambas colectas.
Identificación de esporas de H. vastatrix
Se empleó el método reportado por Silva, Nicole, Rijo, Geiger & Rodrigues (1999). Se aplicó esmalte de uñas transparente sobre la superficie infectada en las hojas, se dejó secar a temperatura ambiente, posteriormente se retiró y se fijaron en portaobjetos. Las muestras se tiñeron con algodón azul de lactofenol, para identificar las esporas del hongo mediante la comparación de las características morfológicas reportadas, como el tamaño, forma y estructura. Se realizaron cortes de las secciones transversales de fragmentos de hojas infectadas y no infectadas hechas con un micrótomo y se tiñó en algodón azul de lactofenol para evaluar la inserción de las urediniosporas del hongo dentro de los tejidos del huésped usando un microscopio de luz de la marca Axiostar plus.
Extracción y determinación de compuestos fenólicos de las hojas de café (Coffea arabica sp.)
La extracción de compuestos fenólicos se realizó a partir de hojas deshidratadas y molidas, empleando el método de extracción asistida con ultrasonido reportado por Cuesta-Parra & Correa-Mahecha (2018) con algunas modificaciones. Se empleó 1 g de muestra y se adicionaron 10 mL de una solución de metanol al 80%, el tratamiento con ultrasonido fue por 20 minutos en condiciones de oscuridad; posteriormente el extracto se filtró con papel filtro whatman N°2 realizando lavados con 5 mL de metanol al 100% por duplicado. La extracción se repitió dos veces y se recolectó en un matraz balón de 50 mL. El disolvente se rotaevaporó a 40-45 °C y el agua restante se eliminó por liofilización (LABCONCO FreeZone 4.5 Plus). El extracto se almacenó a -20 °C hasta la determinación de fenoles totales y los análisis cromatográficos.
Cuantificación de fenoles totales
Para la determinación de fenoles totales (FT) se utilizó el método reportado por Vignoli, Bassoli & Benassi (2011) con algunas modificaciones. Las muestras liofilizadas se resuspendieron en 3 mL de metanol al 100% y se tomaron alícuotas de 100 µL del extracto fenólico y se diluyeron con 9 mL de H2O destilada. Se tomaron 20 µL de la solución con adición de 1.5 de mL de agua destilada y 100 µL del reactivo Folin and Ciocalteu (Sigma-Aldrich), se agitó por 5 min y posteriormente se agregaron 300 µL de Na2CO3 al 20% p/v, agitando vigorosamente. Se incubó por 90 min en oscuridad y se medió la absorbancia a 765 nm. El ácido gálico se empleó como estándar para la curva patrón empleando la misma metodología (0.1-1.0 mg/mL) y agua como blanco. El contenido de fenoles totales del material vegetal se expresó en mg equivalentes de ácido gálico (AG)/gr de muestra seca.
Cuantificación de metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios de ácido clorogénico (3-CQA), criptoclorogénico (4-CQA), neoclorogénico (5-CQA), ácido ferúlico (AF), ácido cafeico (AC), cafeína (Caf) y ácido gálico (AG) fueron identificados y cuantificados mediante cromatografía líquida de fase reversa (RF-HPLC). Aproximadamente 3 mg de cada muestra liofilizada fue resuspendida en 1 mL de agua tridestilada (H2Ot) y filtrada con una membrana millipore de 0.25 μm. El equipo que se utilizó fue un HPLC (PerkinElmer Series 200, Shelton, CT, USA), acoplado a un detector DAD. La columna empleada fue una Kromasil 100-5-C18 (4.6x150 mm, 5 μm, 100A (SUPELCO, Bellefonte, CA, USA) con un flujo de 0.5 mL/min. La fase móvil consistió en 95% de Solvente A: acetonitrilo/ácido fórmico al 0.1% (80:20 v/v) (Fermont, México; Baker, México) y 5% de Solvente B: ácido fórmico al 1% (v/v) en modo isocrático; el análisis se realizó por triplicado a 280 y 320 nm con un volumen de inyección de 10 μL de muestra. Para la elaboración de la curva se utilizaron estándares de 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, AF, AC, Caf y AG. Los tiempos de retención obtenidos para cada compuesto con la curva fueron: 42.67, 44.32, 35.42, 49.15, 43.49, 41.88, 15.2 min respectivamente. Los metabolitos cuantificados fueron expresados en sus equivalentes analizados del estándar en mg/gr de hoja seca (HS).
Determinación de la actividad enzimática
Extracción de proteínas
Para obtener el extracto total proteico, el tejido foliar fue triturado (300 mg de materia fresca) en un mortero con nitrógeno líquido. Posteriormente, se le adicionó 1 mL del amortiguador de extracción [0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)], ácido ascórbico al 0.1% (p/v), glicerina al 10% (v/v), polivinilpirrolidona al 1% (p/v) y β-mercaptoetanol al 5% (p/v)] y se incubó por 4 h a 4 °C, por último, las muestras fueron centrifugadas a 15,000 g por 15 minutos a 4 °C, y almacenadas en un ultracongelador a -80 °C hasta su análisis. La concentración de proteína total soluble en los extractos se determinó por el método espectrofotométrico de Bradford de acuerdo a la metodología reportada por Diniz et al. (2019) utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar, para la construcción de la curva patrón (10.0-100.0 µg de BSA/mL) (Quick Start™ Bradford protein assay). La absorbancia se midió a 595 nm y los resultados se expresaron en µg BSA/gr HS.
Actividad quitinasa
Se determinó utilizando el método descrito por Honorato, Zambolim, Aucique, Resende & Rodrigues (2015) con ligeras modificaciones. La reacción se llevó a cabo utilizando 40 μL (0.45 μg/μL) del extracto total proteico en 940 μL de la mezcla de reacción (tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5.0)) y 20 μL del sustrato p-nitrofenil-β-DN-N diacetilocitobiosa (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) a una concentración de 2 mg/mL y se incubó en un baño de agua a 37 °C durante 2 h. La reacción se detuvo con 1000 μL de carbonato de sodio 0.2 M. En las muestras control, solo se utilizó carbonato de sodio después de añadir el extracto de enzima a la mezcla de reacción y las muestras se incubaron en un baño de agua a 37 °C durante 2 h. La absorbancia del producto final liberado por la quitinasa se midió a 410 nm. Se utilizó el coeficiente de extinción molar de 7×104 mM/cm para calcular la actividad y los resultados fueron expresados en μmol p-nitrofenilo/min*mg de proteína y éstos equivalen a una unidad de quitinasa, siendo una unidad la cantidad de enzima que se produce por un μmol p-nitrofenilo/min, bajo las condiciones antes descritas.
Actividad glucanasa
Se determinó como describe Dogra & Sreenivasulu (2015) a partir de 40 μL (0.45 μg/μL) del extracto total proteico y 460 μL de la mezcla de reacción (tampón de acetato sódico 100 mM (pH 5.0) y 500 μL del sustrato laminarína (4 mg/mL Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) y se incubó en un baño de agua durante 30 min a 45 °C. Posteriormente, se determinaron los azúcares reductores con 1000 μL de ácido 3,5 dinitrosalicílico, incubando la mezcla en un baño de agua por 15 minutos a 100 °C y después a 30 °C. El testigo se realizó con el extracto total proteico añadido después de calentar la mezcla a 100 °C. La absorbancia del producto liberado por glucanasa se midió a 540 nm, y la actividad glucanasa se expresó como unidad de actividad (UA)/mg de proteína x min (Ramada et al., 2010).
Actividad peroxidase
Se determinó sobre la oxidación del pirogalol de acuerdo con el método de Honorato et al. (2015). Se añadió una mezcla de 590 μL de H2O2, 500 μL de tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 6.8), 400 μL de pirogalol 100 mM y 400 μL de peróxido de hidrógeno 100 mM a 110 μL (0.45 μg/μL) del extracto total proteico. La absorbancia se medió con un espectrofotómetro a 420 nm cada 10 s durante 1 min a 25 °C después de la adición del extracto total proteico. La actividad peroxidasa se calculó mediante el coeficiente de extinción molar de 2.47/mM x cm (Chance & Maehley, 1955) que se expresó en mM de purpurogalina/min x mg de proteína. Durante la reacción las muestras se protegieron de la luz para evitar su oxidación.
Diseño experimental y análisis de datos
Todos los experimentos se realizaron con un diseño completamente al azar con 10 repeticiones y dos tratamientos designados como plantas infectadas y no infectadas con H. vastatrix. Una planta corresponde a una unidad observacional. Se utilizaron 20 plantas en cada experimento (10 plantas por cada tratamiento) en dos tiempos de evaluación antes de las lluvias (sin incidencia de roya-antes de la infección) y después de éstas (con incidencia de roya-durante la infección). Los datos de todas las variables se sometieron a un análisis de varianza y las medias de los tratamientos se compararon mediante la prueba de Tukey (p ≤ 05) usando el software Statgraphics Centurion XVI.
Resultados
En la Figura 1 se observan los cortes longitudinales en el tejido foliar obtenidos de plantas infectadas con roya. Se visualizaron las estomas y dentro de estos algunos presentaban esporas (Fig. 1B); así como, aglomerados de urediniosporas, hifas septadas de germinación e hifas de germinación unidas por diferentes urediniosporas (Fig. 1C). Los estomas fueron asimétricos (Fig. 1D). La morfología de las urediniosporas mostró una coloración amarillenta en las partes centrales y/o poco traslucidas en otras. También se pudo observar que se mantienen unidas mediante tubos germinativos. En las plantas Ni no se observaron lesiones en las estomas, tampoco se visualizaron urediniosporas. La peculiaridad del proceso infectivo de las urediniosporas de H. vastatrix es a través de los estomas, esta penetración desarrolla haustorios que atacarán principalmente la cavidad subestomática y finalmente lesionándolas. Las plantas no infectadas no presentaron urediniosporas en el proceso de invasión, desarrollo y proceso infectivo. Los daños ocasionados por la roya sobre las hojas manifiestan lesiones redondas de aproximadamente unos 3 mm en el haz y en el envés, también manifiestan necrosis, con un color amarillo-anaranjado incluso una coloración parda que van desde el centro de la hoja hasta el área perimetral.
Fig. 1 Observación de cortes longitudinales del tejido foliar de plantas infectadas con H. vastatrix. A. Estomas de la hoja (flecha negra) y esporas dentro de estomas (flecha roja). B. Arreglo/aglomerado de urediniosporas (flecha roja), hifas septadas de germinación (flecha morada) e hifas de germinación unidas por diferentes urediniosporas (flecha negra). C. Vista del tejido foliar infectado. D. Vista del tejido foliar y estomas asimétricas (círculos rojos).
Con respecto a fenoles totales (FT), no hubo diferencias (p < 0.05) en las hojas de plantas Ni e i antes de la infección (ai) y durante ésta (di); sin embargo, durante el periodo de infección (di), la concentración de FT se incrementó al doble en la infectadas (i) (Cuadro I).
En cuanto a los metabolitos secundarios, solo se observaron diferencias significativas en el contenido de cafeína y ácido gálico en hojas de plantas infectadas con roya. Sin embargo, antes de la infección el 5-CQA, 4-CQA y el ácido gálico no están presentes en las Ni; cabe señalar que las concentraciones de ácido gálico disminuyen en las i durante la infección, pero sigue siendo mayor que en las Ni. También se observó un claro incremento de cafeína en las hojas de i durante la infección (Cuadro I).
La actividad de la quitinasa fue mayor en las hojas de plantas Ni, y está actividad se incrementó durante la infección (di). Por otro lado, la actividad de la glucanasa fue mayor en las i antes y durante la infección (ai y di, respectivamente). En cuanto a la actividad de la peroxidasa, ésta fue mayor en las Ni solo antes de la infección (ai) y esta actividad no varió durante la infección (di) en ambas muestras (Cuadro II).
Cuadro I Concentración de compuestos fenólicos en las hojas de C. arabica antes y
| 5-CQA1 | 3-CQA2 | 4-CQA3 | Ác. Cafeico | Ác. Ferúlico | Cafeína | Ác. Gálico | Fenoles totales mg Eq AG |
||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ------------ μg Eq------------ | |||||||||
| Durante de la infección | Infectadas (i) | 6.3 b5 | 507.9 a | 74.0 a | 12.2 a | 5.1 a | 5235.5 a | 5.3 a | 6.0 a |
| No infectadas (Ni) | 33.5 a | 647.9 a | 69.5 a | 16.3 a | 4.2 a | 4105.0 b | 2.0 b | 2.8 b | |
| Antes de la infección | Infectadas (i) | 39.8 a | 695.6 a | 143.5 a | 17.2 a | 2.1 b | 351.7 b | 7.3 a | 4.5 a |
| No infectadas (Ni) | 0 b | 487.2 a | 0 b | 11.3 a | 7.2 a | 8988.8 a | 0 b | 4.4 a | |
| DMS (0.05) 4 | 20.6 | 298 | 29.9 | 6.2 | 2.1 | 1074 | 3.1 | 0.965 | |
| Interacciones | |||||||||
| i x ai | 496.5 | 496.5 | 148.0 | 11.4 | 2.3 | 362 | 10.6 | 5.5 | |
| i x di | 519.2 | 519.2 | 0 | 13.0 | 7.8 | 10109 | 0 | 6.5 | |
| Ni x di | 894.6 | 894.6 | 139.0 | 23.0 | 1.8 | 341 | 4.0 | 3.4 | |
| Ni x di | 455.2 | 455.2 | 0 | 9.5 | 6.6 | 7869 | 0 | 2.3 | |
1Ácido clorogénico (3-CQA). 2 Ácido criptoclorogénico (4-CQA). 3Ácido neoclorogénico (5-CQA).4Diferencia mínima significativa (0.05); 5Los valores en las columnas seguidos con la misma letra no son estadísticamente diferentes entre los tratamientos. Los resultados son reportados por gramo de hoja seca.
Cuadro II Actividades enzimáticas en las hojas de plantas de C. arabica antes y durante la infección por la roya.
| Actividad enzimática 4 | ||||
|---|---|---|---|---|
| Quitinasa | Glucanasa | Peroxidasa | ||
| -μM p-nitrofenilo- | - UAT 3- | - mM purpurogalina- | ||
| Periodo | ||||
| Antes de la infección | Infectadas (i) | 0.113 b | 39.13 a | 3.63 b |
| No infectadas (Ni) | 0.128 a | 27.05 b | 6.09 a | |
| Durante de la infección | Infectadas (i) | 0.098 b | 43.61 a | 4.59 a |
| No infectadas (Ni) | 0.143 a | 22.57 b | 5.13 a | |
| DMS (0.05)1 | 0.014 | 5.49 | 1.55 | |
| Interacciones | ||||
| i x ai | 0.116 | 54.4 | 4.66 | |
| i x di | 0.109 | 23.87 | 2.60 | |
| Ni x di | 0.081 | 32.8 | 4.52 | |
| Ni x di | 0.175 | 21.28 | 7.66 | |
1Diferencia mínima significativa (0.05); 2Los valores en las columnas seguidos con la misma letra no son estadísticamente diferentes entre los tratamientos; 3Unidades de actividad total; 4Todos los valores son por min/g de proteína.
Discusión
Las observación de cortes longitudinales del tejido foliar de plantas i corresponden a las características morfológicas de las urediniosporas de H. vastatrix (Fernándes, Evans, & Barreto, 2009).
Estudios citológicos y bioquímicos han demostrado que en plantas de café se activan algunos mecanismos de defensa cuando es atacado por H. vastatrix. Uno de estos mecanismos es la respuesta hipersensible (HR), activada por efectores patogénicos), que se asocia con la deposición de callosa, compuestos fenólicos (flavonoides y ácido clorogénico) y con la lignificación de la pared celular. Otros tipos de respuestas involucran enzimas como las lipoxigenasas y las peroxidasas que estimulan la vía de los fenilpropanoides. Las proteínas PR (proteínas relacionadas con patógenos), como la β-1,3-glucanasa y la quitinasa, también se encuentran asociadas a la resistencia de algunos cultivares de café a H. vastatrix raza II (Fernandez et al., 2012; Florez et al., 2017).
La alteración de la concentración de los compuestos fenólicos comúnmente se encuentra relacionado con los mecanismos de defensa al estrés biótico (Ávalos & Pérez, 2009). En el presente estudio se encontró que la concentración de fenoles totales (FT), no vario antes del proceso de infección y aumentó en las plantas i en comparación con las plantas Ni. Estos resultados indican que las plantas que son susceptibles a la enfermedad están respondiendo al ataque del fitopatógeno y que no es la presencia del hongo la que los induce.
Sin embargo, nuestros resultados indican también que las plantas de café podrían estar resistiendo al ataque de la roya debido a la producción de metabolitos inducidos como respuesta al ataque del hongo, es decir por resistencia sistémica inducida (RSI). Específicamente, los metabolitos que podrían estar implicados en la RSA son 5-CQA, cafeína y ácido gálico y los que posiblemente participen en la RSI son ácido ferúlico y la cafeína. Estos dos últimos metabolitos fueron detectados en mayor concentración en las hojas de las plantas Ni antes de la infección. El 5-CQA puede estar involucrado en el efecto de la capacidad antioxidante ante el estrés ocasionado por la presencia de la infección de H. vastatrix en la temporada anterior. También podría estar relacionado con la producción de cutinasa en la roya y con la reducción de la producción de melanina fúngica. La cutinasa es una enzima que el hongo usa para degradar la cutina de las hojas y poder adherirse a ellas permitiendo infectar a la hoja (Rodrigues, Carré, Jham, Berhow & Schurt, 2011). Otra explicación es que este metabolito este asociado al proceso de lignificación de la pared celular vegetal y con esto promover el refuerzo de la primera barrera ante un ataque patogénico, además su acumulación podría mantener un índice en la lignificación o actividad antioxidante ante la presencia de una infección por H. vastatrix, y podría estar siendo usando con el fin de retardar el proceso infeccioso (Ávalos & Pérez, 2009). Con respecto a la cafeína, la importancia radica en que es un metabolito que tiene alta actividad antioxidativa y es una molécula precursora en la síntesis de ácidos clorogénicos, por lo que su aumento podría estar ligado con la concentración del 5-CQA (Brezová & Slebodová, 2009). Por otro lado, las plantas podrían estar usando los ácidos clorogénicos en una respuesta temprana de inhibir el crecimiento micelial o la germinación de esporas mediante la permeabilización de la membrana (Martínez, Regente, Jacobi, del Río, & de la Canal, 2017). La diferencia de la concentración de ácido gálico podría ser explicada porque el ácido participa en la biosíntesis de taninos hidrolizables que pueden desempeñar actividad antifúngica (Ávalos & Pérez, 2009). Es interesante el comportamiento de la actividad enzimática de la quitinasa ya que podría estar participando tanto en la RSA como en la RSI. Esta actividad enzimática degrada la pared celular del hongo y/o las hifas generadas por la esporulación y como consecuencia protege a la planta de la colonización del hongo (Guerra et al., 2009).
De acuerdo con González et al. (2011), la actividad enzimática de la glucanasa es una de las más importantes en el fenómeno de la resistencia vegetal ya que interviene en la degradación de los glucanos de la pared celular fúngica. Así mismo, Honorato et al. (2015) demostraron que la actividad de la glucanasa en las plantas se eleva en los días en torno a la infección de la roya desde el día 2 hasta el día 40, caso contrario a lo que se demuestra con las plantas control que no están infectadas. Monteiro et al., (2016) mostraron que las plantas de café ante la incidencia de la roya en las primeras 24 horas, hay un incremento de la expresión de la enzima glucanasa. El decremento de la actividad de glucanasa en plantas muestreadas antes de la infección con respecto a las plantas infectadas muestreadas durante la infección puede reflejar por qué la planta no contrarresta a la roya. La glucanasa puede no ser la enzima principal que le confiere defensa contra la roya a las plantas que no son infectadas y probablemente estas plantas utilizan principalmente a la enzima quitinasa para degradar la pared celular fúngica, además de usarla como un sistema protector durante la incidencia de la roya a posteriores ataques.
La actividad de la peroxidasa fue mayor en las plantas no infectadas antes y durante el proceso de infección, por lo que posiblemente esta enzima esté participando para mejorar el sistema antioxidativo y posiblemente usado como un mecanismo previsor ante agentes oxidantes como los que puede ocasionar el estrés al tejido foliar (Honorato et al., 2015). Se ha demostrado que la actividad de la peroxidasa induce la biosíntesis de lignina y suberina en hojas (Herrero et al., 2013), esto explicaría por qué las plantas resistieron el ataque de la roya.
Conclusiones
Las plantas de C. arabica no susceptibles y por lo tanto resistentes a la roya presentaron niveles altos de 5-CQA y ácido cafeico durante la infección, y ácido ferúlico antes de ésta; en cuanto a las actividades enzimáticas, la quitinasa y peroxidasa mostraron mayor actividad antes y durante la infección, lo que sugiere un posible mecanismo de resistencia mediante la síntesis de éstos metabolitos y la actividad de éstas enzimas.
