Ubicación del área de estudio y diagnóstico de rodales semilleros de C. elaeagnoides

El material biológico utilizado se obtuvo de los municipios de Tumbiscatío (Longitud:-102.376667, Latitud: 18.524722) y La Huacana (Longitud: -101.806389, Latitud: 18.962222) del Estado de Michoacán, México. La descripción de los predios con RS se realizó con la colaboración de la Comisión Nacional Forestal, Gerencia Estatal Michoacán, donde se obtuvo el listado de los estudios técnicos para el aprovechamiento forestal no maderable y recolección de germoplasma forestal de C. elaeagnoides, realizados en base a los criterios de Manual de Unidades Productoras de Germoplasma Forestal (UPGF) de la Comisión Nacional Forestal (2016). Posteriormente se realizó el diagnóstico obteniendo seis inventarios con C. elaeagnoides, las poblaciones naturales seleccionadas se localizaron en el área geográfica de distribución ubicada a altitudes entre los 297 y 362 metros sobre el nivel del mar, de los cuales se tomaron muestras en los sitios Manila (I), Manila (II), Caja (III) y Cuirindales (IV) (Cuadro 1 y Fig. 1).

Fig 1 Rodales semilleros dirigidos para el aprovechamiento forestal no maderable y recolección de germoplasma forestal de C. elaeagnoides, conforme a la información obtenida por la Comisión Nacional Forestal (2016). Manila (I), Manila (II), Caja (III) y Cuirindales (IV). 

Selección de árboles semilleros de C. elaeagnoides

Con base en recientes trabajos realizados (^{Valladolid-Ontaneda et al., 2017}) se tomaron en cuenta las características fenotípicas, se eligieron ocho árboles maduros a una distancia mínima de 100 metros entre ellos, libres de plaga o daño mecánico, con altura mínima de 9 metros, fuste limpio y recto, (copa de 5 metros de diámetro como mínimo), en etapa de fructificación con flores que mantuvieran un color café, determinado así la idoneidad de los individuos como árboles semilleros. De los árboles encontrados en los sitios de muestreo ya mencionados, se utilizaron para la colecta de germoplasma.

Colecta de germoplasma

De los ocho árboles que cumplieron con los criterios de selección establecidos, fueron identificados y georreferenciados (Guía para la Manipulación de Semillas Forestales de la FAO, 1991). De estos ejemplares arbóreos se tomaron muestras o lotes (2400 semillas aproximadamente) del germoplasma durante el mes de febrero (2016), la estrategia metodología consistió en: Primero se realizó una división en tres partes similares de acuerdo con su altura (Alta, Media y Baja), para posteriormente y con la ayuda de una lona (10m²), ganchos telescópicos y escaleras, las semillas fueron colectadas por separado conforme con la división establecida. La semilla colectada se colocó en bolsas de plástico para ser trasladada al área en manejo y conservación de recursos forestales maderables-UMSNH, donde se almacenó a humedad y temperatura controlada (10% / 20ºC respectivamente) hasta su uso (Guía para la manipulación de semillas forestales ortodoxas de la FAO). Después, utilizando los protocolos de la “International Seed Testing Association-ISTA” (Issue, 2004), de cada una de las muestras de semilla se obtuvieron datos de las principales características físicas, como su peso, longitud, diámetro, semillas por gramo, contenido de humedad y pureza (utilizando una balanza analítica y vernier digital (± 0.001 mm; Truper^R) y rendimiento promedio de los árboles semilleros (numero de semillas por kilogramo, ver Cuadro 2).

Pruebas de viabilidad en semilla

Tomando como referencia el trabajo de (^{Marcos Filho, 2015}) y los protocolos de la ISTA, se realizaron cuatro pruebas para definir la viabilidad de semilla por estrato (Alto, medio y bajo), en donde se tomaron al azar 100 semillas por estrato y árbol, la estrategia metodológica consistió en:

Germinación de semillas de Cordia elaeagnoides

En este ensayo se utilizó una muestra de semilla tomada al azar y procedente de los ocho árboles identificados como superiores, para el cual se utilizó una cantidad de 100 semillas para cada condición (temperatura), las características del experimento consistieron en: Las semillas fueron colocadas en charolas de plástico en contenedores individuales con un volumen de 1.5 cm³ de sustrato por semilla (Agrolita:Arena:Peat-Moss en proporción 1:1:1) e hidratadas a capacidad de campo del sustrato (2.7ml de agua cada 4 días aproximadamente). Las condiciones de germinación se realizaron en una cámara de crecimiento vegetal, operada bajo un entorno controlado de 16 horas luz y 8 en oscuridad y condiciones de temperatura de 25, 28 y 30°C. Las evaluaciones de germinación se realizaron a los 7, 14, 21 y 28 días después de la siembra. Finalmente, la germinación se reportó de acuerdo al trabajo realizado por (^{Barraza A., Benavides B., & Torres M., 2016}; ^{Orantes-García et al., 2013}), en donde se considera el numero de semillas utilizadas entre el numero de semillas germinadas por cien.

Análisis estadístico

Utilizando el Programa STATISTICA Versión 7, los resultados se examinaron con un Análisis de Varianza (ANOVA) y una posterior prueba de Tukey (p < 0.05).

Copa arbórea y características de la semilla en Cordia elaeagnoides

Los resultados también revelaron una diferencia en las muestras obtenidas, respectivas con el estrato de la copa arbórea, es decir, en la zona media/alta de la copa fue mayor la muestra de semilla obtenida. En el cuadro 2 se muestran los valores de peso obtenido por muestra (g), en donde, los datos mas altos corresponden a la parte media/alta del dosel, que las obtenidas en el estrato inferior o bajo. Sin embargo, al realizar el conteo de número de semillas por gramo entre estratos, no se encontró una diferencia estadísticamente significativa, situación similar que se tiene con los valores de rendimiento (Cuadro 2).

Por su parte, los datos obtenidos en diámetro y longitud de la semilla, señalan una tendencia a ser de mayor dimensión en el estrato alto, y dichos valores van disminuyendo acorde a la altura de la copa, teniendo los datos más bajos en la parte inferior del dosel (Fig. 2).

Fig 2 Diámetro y longitud de la semilla en C. elaeagnoides de acuerdo al estrato de la copa arbórea. La línea gris indica el diámetro y la línea negra indica la longitud de semilla. 

Viabilidad de semilla en Cordia elaeagnoides

Los ensayos realizados para conocer la viabilidad de semilla revelaron, en la técnica de separación con aire (columna densimétrica) correspondió con una mayor viabilidad en Cordia, en relación a las complementarias pruebas, obteniendo valores de 85, 77 y 71% para los estratos alto, medio y bajo respectivamente. Además, exponiendo también que la prueba con tinción de tetrazolio (para estratos medio y bajo) se obtuvieron valores similares estadísticamente a la prueba anteriormente reseñada (Fig. 3). Por su parte, en el ensayo de flotación de semilla (Inmersión) se obtuvieron los valores mas bajos en viabilidad, siendo estadísticamente diferentes a las anteriores dos pruebas realizadas (61.6, 63.2 y 59.6% para los estratos de alto a bajo respectivamente).

Fig 3 Porcentaje de viabilidad de semilla en C. elaeagnoides de acuerdo al estrato de la copa arbórea, los valores corresponden a la media obtenida y las barras muestran error estándar. Resultados examinados mediante un Análisis de Varianza (ANOVA) y una posterior prueba de Tukey (p < 0.05). Las letras iguales denotan significancia estadística entre los estratos de la copa arbórea. 

La principal característica fisiológica de las semillas ortodoxas es su gran tolerancia a la deshidratación, en el presente documento se evidencia que las muestras de semilla presentan contenidos de humedad de 8.5 a 8.1% (Cuadro 2). De igual forma, los resultados obtenidos en el escrutinio del número de compartimentos embrionarios en semilla de Cordia, revelaron que en semillas identificadas como viables existe una relación entre el número de embriones en semilla y compartimentos embrionarios encontrados (Fig. 4A), a diferencia de semillas clasificadas como no viables, que mostraron tener baja presencia de número de embriones en razón con el número de compartimentos (Fig. 4B). En la Figura 4C se exponen los compartimentos embrionarios en semillas de C. elaeagnoides, resaltando la presencia de 3 y 4 espacios principalmente.

Fig 4 Compartimentos embrionarios en semilla de C. elaeagnoides de acuerdo al estrato de la copa arbórea en semillas viables y vanas. A) Semillas viables y número de embriones en semilla por compartimento embrionario, B) Semillas no viables y número de embriones en semilla por compartimento embrionario, C) Compartimentos embrionarios en semillas de C. elaeagnoides, mostrando la presencia de 2, 3 y 4 espacios. 

Evaluación de la germinación en C. elaeagnoides

La investigación realizada en este trabajo, mostró que la temperatura es una importante condición que puede limitar significativamente la germinación en C. elaeagnoides. En la Figura 5 se muestra que bajo condiciones de 30ºC se alcanzó una germinación acumulada de 53%, disminuyendo de acuerdo con la baja de temperatura, es decir, a 28 y 25ºC después de 28 días los valores de germinación obtenidos fueron de 0 y 42%. Es importante también resaltar que, a 14 días de siembra se obtuvo el cien porciento del total final de semillas germinadas ensayadas a 30ºC, no así el experimento realizado a 28ºC, alcanzando su cien porciento del total final hasta los 21 días.

Fig 5 Germinación acumulada, en donde se muestra que a una temperatura de 30ºC se alcanzó un 53% de semillas germinadas, después de 14 días de siembra. 

Condiciones del área de estudio

En el proceso fisiológico de génesis y maduración de semilla, la intensidad lumínica juega un papel determinante, ya que, la luz natural puede mimetizar los efectos dados por alternancia de temperatura, efecto vinculado con la germinación (^{Li, Yin, Jongsma, & Wang, 2011}). En este trabajo encontramos que las condiciones climáticas entre localidades (Tumbiscatío y La Huacana Michoacán, México) son homogéneas entre ellas (BS1(h')w) y dicha cualidad es importante, ya que desde un punto de vista de producción de planta, se podrá colectar semilla de cualquiera de estos sitios, ofreciendo la certeza para poder alcanzar resultados uniformes, así como establecer las condiciones para su muestreo.

Desarrollo de la semilla en C. elaeagnoides

El desarrollo y maduración del germoplasma en los árboles no necesariamente se lleva a cabo homogéneamente en la planta, es decir, se efectúa por etapas o secciones que favorecen su continuidad en el ecosistema. Existen factores como la disponibilidad de nutrientes, temperatura, presencia de plagas, enfermedades, disposición genética o humedad, que intervienen en la maduración de semillas. En particular, elevados porcentajes de humedad durante el desarrollo de la semilla podrian mejorar la viabilidad y capacidad de almacenamiento (^{Gantait, Kundu, Wani, & Das, 2016}; ^{Pammenter & Berjak, 2014}). v.g. en algunas especies de pinos (Pinus halepensis Mill), la maduración del cono está influenciada por la densidad arbórea en los RS, generando una menor competencia entre los pinos y la flora del bosque que los acompaña, lo que resulta en un aumento dimensional general de los árboles, incluida la producción de semillas. Sugiriendo que la mejora de las particularidades morfológicas del árbol podría favorecer las características de semillas y cultivo de conos, es decir, la producción de semillas y conos es mayor en árboles que presentan un dosel superior en altura y diámetro (^{Ayari & Khouja, 2014}). A largo plazo, la calidad de las semillas se puede ver reflejada en los rendimientos y desarrollo de los árboles en campo, disminuyendo los costos de producción y manejo.

Información publicada por CONAFOR, reporta que las semillas de Cordia son ortodoxas, que además presentan valores de viabilidad estimados bajo condiciones de almacenamiento del 50%, sin embargo, en este trabajo se alcanzó valores de viabilidad del hasta 85%. Aunque el término viabilidad y germinación pudieran relacionarse, en el presente trabajo se identificaron valores de viabilidad (dependiendo de la prueba utilizada) entre 59.6 a 85%, los cuales no correspondieron a los valores de germinación encontrados (53%), lo cual nos dice que en C. elaeagnoides no necesariamente semillas con elevados valores de viabilidad se verán reflejados en la germinación, ya que, para una germinación exitosa en condiciones in vitro, vivero o campo es necesario encontrar las condiciones ambientales ideales.

La CONAFOR también ha reportado que estas semillas pueden almacenarse a temperatura de hasta 0°C y mantener su viabilidad por varios años, sin embargo, en este trabajo también se encontró que la viabilidad se pierde con el tiempo a una taza inusual para semillas ortodoxas (^{Walters, 2015}), ya que las mismas pruebas realizadas seis meses después, se obtuvo una pérdida en la viabilidad del 50% aproximadamente (datos no mostrados). En la actualidad, en esta especie o género taxonómico no se ha reportado una relación con el proceso de maduración y viabilidad de semilla. Pero se conoce que, durante el ciclo de desarrollo de las semillas ortodoxas, estas desarrollan gran parte de las características de tolerancias al estrés hídrico, y durante este proceso es importante que la condición ambiental al cual el árbol esta sometido no se vean alteradas o pasen por fuertes cambios. En etapas iniciales de desarrollo y crecimiento del embrión (formación de semillas), cuando la actividad metabólica y contenido de agua es alto, las semillas son sensibles a la desecación, por su lado, en la fase de maduración, las semillas ortodoxas son inducidas a tolerar la desecación, hasta el comienzo de la germinación (^{Pereira et al., 2017}). También, es importante tener en cuenta que una mejor manera de clasificar si una semilla es ortodoxa seria considerando su potencial hídrico, ya que aun existen dudas en categorizar si una semilla es recalcitrante, intermedia u ortodoxa en base a su capacidad a la desecación.

Germinación en C. elaeagnoides

Se encontró que bajo condiciones de 30ºC se obtuvo el porcentaje de germinación mas alto, que coindice con la temperatura media alcanzada en la región de “Tierra Caliente” Michoacán (27.8ºC), por lo cual, significaría que el productor podrá realizar el procedimiento de germinación de semilla sin la necesidad de adquirir equipo costoso o que represente dificultades en operación y/o mantenimiento. El papel que desempeña la temperatura en semilla se extiende desde su génesis, pasando por el almacenamiento y germinación, por ejemplo, en un trabajo publicado y utilizando como modelo de estudio semillas de Ginkgo bilobaL. se encontró que el comportamiento de la semilla durante un almacenamiento a 25°C, después de seis meses pierden el total de su viabilidad. En cambio, al ser almacenadas a una baja temperatura (4°C) se conserva la viabilidad hasta 12 meses, no así su capacidad de germinación, ya que disminuyó considerablemente después de seis meses. Los autores del trabajo cometan que en tejido embrionario la presencia de dos importantes antioxidantes como el ascorbato y glutatión, muestran un comportamiento diferente en las dos condiciones de temperatura ensayadas, regulando el estrés oxidativo durante el almacenaje, manifestándose en la germinación (^{Tommasi, Paciolla, Concetta de Pinto, & De Gara, 2006}). Y como anteriormente se a visto, aunque una semilla pueda tener un tejido embrionario morfológicamente completo y desarrollado, no necesariamente la germinación se llevaría a cabo, pero si es un importante indicador de viabilidad. En otro estudio, utilizando como modelo semillas de Jatropha Curcas Linn., se analizó el efecto de la temperatura y medio de crecimiento sobre la germinación, encontrando que del rango de temperatura ensayada (20-37°C), a 30°C se registró el mayor porcentaje de germinación (84%), notando una tendencia relacionada a la temperatura, demostrando la influencia de este factor (^{Gairola, Nautiyal, & Dwivedi, 2011}).

También, un estudio sobre la viabilidad a diferente temperatura durante un período de almacenamiento de cinco años sobre semillas de Brassica repanda, Eruca vesicaria, Malcolmia littorea, Moricandia arvensis, Rorippa nasturtium-aquaticum, Sinapis alba, Sisymbrium runcinatum, almacenadas en 48 distintos ambientes que comprendían una combinación de ocho contenidos de agua (0.21 a 0.01 g.H2H.g-1 DW) y seis distintas condiciones de temperatura durante su almacenaje (45, 35, 20, 5, -25, -170 °C). Se encontró que el contenido de agua es crítico durante el almacenamiento de semillas a temperatura elevada, el efecto de la desecación extrema a 45°C mostró efectos dañinos manifestados en inhibir la germinación (^{Mira, Estrelles, & González-Benito, 2015}).

Finalmente, en otro manuscrito se reporta que, utilizando cuatro especies arbóreas (dos especies de Fabaceae y dos Bignoniaceae) se encontró una respuesta a la temperatura (25/30°C) y determinante para promover la germinación de la mayoría de las semillas ensayadas. El germoplasma de las cuatro especies presentó un comportamiento propio de semillas ortodoxas, mostrando tolerancia y germinación en condiciones ambientales con intervalos amplios de temperatura y luminosidad (^{Vargas-Figueroa, 2015}). Pese a que la temperatura desempeña un papel importante en el fenómeno de germinación, con la evidencia mostrada con anterioridad resulta evidente que el proceso de germinación es multifactorial, v.g. La inducción de la dormancia en semilla ocurre durante la maduración y está regulada por el desarrollo. Los factores ambientales experimentados por la planta progenitora durante la maduración de la semilla, como temperatura, luz y nitrato del suelo, influyen en el nivel de dormancia. Esto influye de manera que, cuando las condiciones ambientales favorecen la siguiente temporada de crecimiento, este mecanismo puede ayudar a la próxima generación (memoria celular) a adaptarse al entorno. Especialmente, la temperatura ha demostrado ser un factor determinante, ya que, utilizando la planta Arabidopsis sp., se vio que bajas temperaturas durante la maduración de las semillas aumentan los niveles de dormancia. Evolutivamente esto ha permitido evitar que todas las semillas germinen simultáneamente, reduciendo el riesgo de mortalidad en la progenie (^{Née, Xiang, & Soppe, 2017}). Del mismo modo, los reguladores del crecimiento vegetal como las giberelinas (AG), están fuertemente implicadas en los procesos de germinación, y se sabe que existen genes que regulan la expresión de AG, dependientes de la temperatura, capaces de alterar el metabolismo de la semilla. Estos efectos conducen a un debilitamiento del endospermo que determinan el tiempo óptimo para germinar (^{Graeber et al., 2014}).