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Introducción
El género Mammillaria comprende el grupo con mayor número de representantes dentro de la familia Cactaceae con 171 especies (Navarro y Deméneghi, 2007; cf. 200 especies, Novoa, Le Roux, Robertson, Wilson, y Richardson, 2015). El 85% de ellas son endémicas de México, razón por la cual se considera como el centro de diversificación del género (Martínez, Arroyo, Mandujano, y Golubov, 2016; Montes, López, y Cruz, 1997). Su mayor presencia se registra en zonas áridas y semiáridas, pero también existen ejemplares que se distribuyen en dunas costeras, bosque tropical caducifolio y bosque templado (Godínez, Valverde, y Ortega, 2006; Rzedowski, 2006; Torres, Méndez, Dorantes, y Durán, 2010). Desafortunadamente, desde hace casi una década 110 especies de mamilarias mexicanas se encuentran listadas en la Norma Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT-2010 bajo diferentes categorías de riesgo (Diario Oficial, 2010). A nivel internacional el número de ejemplares mexicanos en riesgo alcanza niveles cercanos al 50% de un total de 164 especies registradas por la International Union for Conservation of Nature (IUCN, Red List of Threatened Species, 2018).
Existen diversas razones que han desencadenado y en algunos casos agravado dicha problemática. Aunque como género se distribuye en toda la República, a nivel de especies su distribución suele ser restringida a regiones y zonas con características ambientales específicas (Santos, Velásquez, y González, 2005). La extracción de ejemplares adultos, el cambio de uso de suelo y la explotación de recursos del ambiente provocan una notable disminución en el tamaño de las poblaciones, más aún, cuando por condiciones geográficas se encuentran aisladas (Ferrer, Durán, Méndez, Dorantes, y Dzib, 2011; Gómez y Hernández, 2000; Martínez et al., 2016). Por otro lado, las mamilarias comparten las características típicas de la familia Cactaceae: ciclo biológico prolongado y un ritmo de lento crecimiento (Godínez et al., 2006). Ello conlleva a que en los primeros estadios de su desarrollo presenten altas tasas de mortalidad y como consecuencia la población se estanca en individuos ya adaptados, mayoritariamente adultos (Godínez et al., 2006). De manera previa a este periodo de sobrevivencia y adaptación, el reclutamiento de nuevos individuos por medio de la germinación de semillas resulta más bien un hecho esporádico que depende en gran medida de una serie de condiciones ambientales que raramente se presentan (Ferrer et al., 2011), traduciéndose en una disminución sustancial del éxito reproductivo (Martínez, Molina, Golubov, Vázquez, y Mandujano, 2014).
A nivel experimental se han analizado factores tales como la temperatura, fotoperíodo, promotores de germinación y sustratos, que al ser modificados incrementan los porcentajes y velocidad de germinación (Flores y Jurado, 2019; Navarro y Deméneghi, 2007; Sánchez, Reyes, García, y Terrazas, 2010). La mayor parte de estos trabajos se han realizado en condiciones de invernadero, aunque también existen otros desarrollados bajo condiciones in vitro (Rodríguez et al., 2018; Salas, Foruoghbackch, Díaz, Cárdenas, y Flores, 2011). Bajo este marco, la presente investigación tuvo como objetivo comparar los porcentajes, velocidad de germinación, germinación media y tasa de crecimiento en condiciones in vitro y ex vitro de cinco especies del género Mammillaria listadas en la NOM-059-SEMARNAT-2010 (Diario Oficial, 2010).
Métodos
Material vegetal
Las especies en estudio fueron: M. albilanata, M. bocasana, M. columbiana, M. rhodantha y M. spinosissima, cuatro de ellas catalogadas en la NOM-059-SEMARNAT-2010 (Diario Oficial, 2010) bajo la categoría Protección especial (Pr), mientras que M. rhodantha se encuentra categorizada como Amenazada (A).
El material vegetal fue donado por la Asociación de Productores de Cactáceas y Suculentas de México (APC A.C.). Las semillas recién recolectadas se empaquetaron en sobres de papel Kraft y almacenadas durante un mes a una temperatura promedio de 24 ± 1°C en completa oscuridad y en un ambiente seco.
Desinfestación de semillas
Las semillas se seleccionaron para cada especie bajo criterios de homogeneidad en tamaño, color y forma. Posteriormente se desinfestaron mediante una serie de dos lavados con agua corriente más detergente comercial en polvo (Ariel ©) y Tween 20©; inmersión en etanol al 70% durante 5 minutos; inmersión en una solución de hipoclorito de sodio al 10% durante 15 minutos y finalmente dos lavados consecutivos con agua estéril.
Germinación
Para evaluar la germinación de las semillas se compararon dos tipos de tratamientos: in vitro y ex vitro. En el primer caso, la preparación del medio de cultivo in vitro estuvo basada en las sales MS (Murashige y Skoog, 1962) al 25%, suplementadas con 0.40 mg.L-1 de Tiamina,100 mg.L-1 de Myo-inositol, 3% de sacarosa, con un pH 5.7±0.1 y 3% de Gelrite Gellan Gum (Sigma®) como agente gelificante. Para el tratamiento ex vitro se empleó una mezcla estéril de tierra de hoja y tezontle (tamaño de partícula 0.2-4.0 mm) en relación 1:1, ligeramente humedecida con agua estéril y colocada dentro de contenedores plásticos transparentes a modo de invernadero (30X26X17 cm).
Las semillas de cada especie se distribuyeron bajo un diseño completamente al azar en cada uno de los tratamientos experimentales con un total de cinco repeticiones con 12 semillas por repetición. La incubación de las semillas fue bajo condiciones controladas de luz y temperatura: 16 horas luz/8h oscuridad con una intensidad lumínica de 30 µmol⋅m-2 ⋅s-1 y una temperatura de 24 ± 1°C, durante un período de 30 días después de la siembra (dds).
El criterio para definir una semilla como germinada fue la emergencia de la radícula. Las variables respuesta fueron: porcentaje final de germinación (PG), velocidad de germinación (VG) mediante el método propuesto por (Maguire, 2010) y germinación media (G50) correspondiente al número de días transcurridos después de la incubación, para alcanzar el 50% del porcentaje final de germinación.
Tasa de crecimiento
En una segunda fase experimental, las plantas obtenidas in vitro se conservaron en sus medios respectivos durante un período de 60 días posteriores a la germinación. Luego de ello, se seleccionó de manera aleatoria una muestra de 36 plantas de cada especie, salvo el caso de M. spinosissima donde el tamaño de muestra fue de 33 plantas. Bajo un diseño completamente al azar, se distribuyeron 12 y 11 repeticiones respectivamente en tres medios de cultivo. Para este experimento, se emplearon medios MS al 50% suplementados con 0.40 mg.L-1 de tiamina,100 mg.L-1 de myo-inositol, 3% , 6% y 9% de sacarosa respectivamente, gelificados con 2.5% de Gelrite Gellan Gum (Sigma®) y ajustados a pH 5.7 ± 0.1.
Se registraron las diferencias entre valores iniciales y finales de altura, diámetro medio, y longitud de raíz (tomando en consideración únicamente la raíz principal) para estimar la tasa de crecimiento relativo (RGR, por sus siglas en inglés) bajo la fórmula: (V f - V i ) / (Vi) donde: V f = valor final, V i = valor inicial con base en lo reportado por Sumaryono, Muslihatin, y Ratnedewi (2012). El período de incubación fue de 280 días bajo condiciones de ambiente controlado: 16 horas luz/8h oscuridad con una intensidad lumínica de 30 µmol⋅m-2 ⋅s-1 y una temperatura de 24 ± 1°C.
Para las plantas obtenidas ex vitro se registraron las mismas variables bajo las mismas condiciones ambientales durante el mismo periodo de tiempo, con un riego por semana.
Aclimatización
Finalmente, las plantas obtenidas in vitro se aclimatizaron en la misma mezcla de sustrato que aquellas generadas ex vitro y se evaluó la sobrevivencia luego de 60 días.
Análisis estadístico
Con respecto a la germinación, se realizó una transformación de los datos obtenidos en porcentaje a fin de normalizarlos mediante la función arcoseno de la raíz cuadrada de PG, denotada por la fórmula: PGt = arcoseno √PG, donde PGt es el porcentaje de germinación transformado y PG es el porcentaje a transformar dado en un rango de 0 a 1 (Rodríguez, Valdés, y Rodríguez, 2012). Para analizar los datos de PGt, VG y G50 se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) de dos factores: tratamiento y especie. Posteriormente se aplicó una prueba de medias de Tukey con una p = 0.05. Con respecto al ritmo de crecimiento, los datos obtenidos fueron sometidos a un ANDEVA de dos factores: tratamiento y especie, seguidos de una prueba de medias de Tukey con una p = 0.05. Todos los procedimientos estadísticos se procesaron con el software Minitab® v.17 (Minitab Inc, 2017).
Resultados y discusión
Germinación
Se presentó una respuesta diferencial en la germinación promovida en los diferentes niveles de los factores tratamiento y especie (Fig. 1). El tratamiento in vitro presentó un efecto positivo sobre el valor de PGt de mayor tamaño en comparación con el que se obtuvo a nivel ex vitro. De manera global, se observó un incremento promedio del 25% sobre los valores de PGt, lo cual se tradujo en una mayor germinación para las cinco especies (Cuadro 1).
Fig. 1 Gráfica de efectos principales para PGt. Especie: M. albilanata, M bocasana, M. columbiana, M. rhodantha y M. spinosissima (30 dds).
Cuadro 1 Porcentaje de germinación, velocidad de germinación y G50 (30 dds).
| Especie | PG ex vitro | PG in vitro | VG ex vitro | VG in vitro | G50 ex vitro | G50 in vitro |
|---|---|---|---|---|---|---|
| M. albilanata | 60.6 b | 92.6 a | 1.59 b | 2.73 b | 12.50 b | 10.1 b |
| M. bocasana | 85.2 a | 93.3 a | 2.40 a | 3.50 a | 15.20 a | 9.70 b |
| M. columbiana | 59.9 bc | 93.9 a | 1.44 b | 2.85 ab | 16.40 a | 12.60 a |
| M. rhodantha | 76.3 a | 99.0 a | 2.26 ab | 2.80 ab | 13.20 ab | 11.80 a |
| M. spinossisima | 48.6 c | 55.1 b | 1.16 b | 1.83 b | 14.80 a | 12.50 a |
Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas entre los valores promedio de acuerdo a la prueba de Tukey (p ≤ 0.05).
Porcentajes de Germinación (PG)
El análisis de varianza y la prueba de Tukey evidenciaron diferencias significativas en los valores generados por los distintos niveles de tratamiento germinativo sobre la variable respuesta (p = 0.012). Los valores más altos de PG bajo condiciones ex vitro se obtuvieron en M. bocasana y M. rhodantha, sin embargo, bajo condiciones in vitro ambas especies compartieron valores similares de PG con M. columbiana y M. rhodantha siendo únicamente diferentes de los obtenidos en M. spinosissima (p = 0.023), la cual fue en ambas situaciones la especie con menor PG.
Los resultados obtenidos en este experimento coinciden con los reportados para algunas especies del género Mammillaria bajo condiciones ex vitro, tal y como los señalados por Flores et al. (2011), quienes reportaron para M. bocasana porcentajes de germinación de 83%. En el presente trabajo para esta especie se alcanzó un PG ligeramente superior (85.2%) bajo una temperatura de 24± 1°C y un fotoperíodo con dos horas más de luz que lo reportado, pudiendo ser esto un estimulo que incrementó la germinación. Para otras especies (M. aurelianata, M. plumosa, M. orcutti y M. longimamma) reportadas por los mismos autores, la germinación alcanzó valores de 42 % a 75%. Por otro lado, considerando las condiciones de germinación naturales como condiciones ex vitro, se observó un mayor contraste con lo reportado para M. gaumeri, especie para la cual se reportan porcentajes de germinación de apenas el 2.9% de una siembra total de 1500 semillas (Ferrer et al., 2011), lo cual indica que dentro del mismo género, la germinación es sumamente variable.
Con respecto a la germinación in vitro se obtuvo valores que en general sobrepasaron el 90% coincidiendo con lo reportado por Ruedas, Valverde, y Castillo (2019) para especies como M. magnimamma (95%) y fueron también superiores a lo señalado para M. haageana y M. carnea cuyos máximos fueron de 76.71 y 72.87% (Benítez, Orozco, y Rojas, 2005). Por otra parte, Salas et al. (2011) reportaron porcentajes de germinación en medio MS al 50% para Mammillaria prolifera cercanos al 23%, mientras que para M. pectinifera los valores máximos reportados por Villanueva, Navarro, y Eliosa (2016) fueron ligeramente superiores al 35%. Ambos casos presentan valores mucho menores al porcentaje de germinación más bajo observado en esta investigación (51.1% para M. spinosissima).
Como se pudo advertir en las dos condiciones germinativas, M. spinosissima presentó los menores porcentajes de germinación, esto pudo deberse a que tal y como señalan Trejo (1993) existen algunas cactáceas cuyas semillas pese a ser recién recolectadas no siempre tienen la mejor viabilidad en los primeros meses tras la cosecha, y mejoran su viabilidad al cabo de un par de años.
Velocidad de germinación (VG)
Para la variable VG, el mayor valor se obtuvo en M. bocasana bajo ambas condiciones de germinación, las cuales al ser comparadas entre sí resultaron ser estadísticamente diferentes (p = 0.016). Las especies restantes también presentaron incrementos en cuanto a la VG en el tratamiento in vitro, solo para M. spinosissima este incremento no fue significativo entre tratamientos (p = 0.062).
Para condiciones ex vitroFlores y Jurado (2019) reportaron valores de 1.25 para A. myriostigma, mientras que para otras cactáceas como Pilosocereus pachycladus el valor reportado fue de 3.91 (Abud, Gonçalves, Reis, Pereira, y Bezerra, 2010). Los valores obtenidos para esta variable en la presente investigación coinciden dentro de este intervalo, siendo el menor de 1.16 para M. spinosissima y de 2.40 el mayor en M. bocasana.
Respecto a la germinación in vitro, Salas et al. (2011) reportan valores de VG de 0.42 ± 0.08 en medios de cultivo MS al 50% gelificados y suplementados con 10% de sacarosa. Específicamente para M. prolifera el valor de VG fue de 0.1, valor muy por debajo de lo obtenido para las especies aquí evaluadas, donde la de menor VG (M. spinosissima) supera más de 18 veces dicho valor de referencia.
En contraste, Santos, Martín del Campo, Arredondo, y Santos (2001) reportaron valores de hasta 8.98 obtenidos para A. myriostigma en medios MS al 50%. En este sentido deben tenerse en consideración las características propias de las semillas, así como su fisiología, ya que si bien las velocidades de germinación no rebasaron el valor de 3.50, los porcentajes de germinación en cuatro de las cinco especies sobrepasaron el 90%.
Germinación media (G50)
Los resultados obtenidos en condiciones ex vitro contrastan con lo reportado por Sánchez et al. (2010) para M. mazatlanensis donde el valor de G50 (T50 en su estudio) fue de 6.3 días, mientras que el valor más bajo obtenido en este trabajo fue de 12.5 días para M. albilanata. Pese a ello, cabe aclarar que M. mazatlanensis fue incubada durante el período de germinación 5°C por arriba de la temperatura utilizada en este experimento, lo cual puede influir sustancialmente en el valor de la variable. Por su parte Navarro, Cervantes y Lázaro (2008) señalan que la germinación de M. hamata y M. sphacelata ocurrió hasta la segunda y cuarta semana respectivamente (14 y 28 días), con lo que podemos inferir que los valores para G50 fueron mayores a algunos de los obtenidos para las cinco especies evaluadas, y que pese a pertenecer al mismo género cada especie muestra un comportamiento diferente.
La mayor reducción en días se presentó en la condición in vitro para M. bocasana con 9.7, mientras que la menor ocurrió en M. rhodantha (11.8 contra 13.2 días ex vitro). Estos resultados contrastan con lo reportado para especies de este mismo género, donde por ejemplo, M. magnimamma alcanzó el valor G50 a los 3.4 días (Ruedas et al., 2019).
En general se observó que en la condición in vitro se dio una reducción significativa en el tiempo en días para alcanzar el 50% de germinación. Esto puede atribuirse principalmente a que las semillas así sembradas estuvieron expuestas a una imbibición continua lo que facilita y acelera los procesos fisiológicos previos y durante la germinación.
Tasa de crecimiento
Se presentan a continuación los valores de RGR calculados para altura, diámetro y longitud de raíz en condiciones ex vitro e in vitro. Si bien existen estudios donde se ha calculado el valor de RGR en cactáceas, en la mayoría de los trabajos esto se ha realizado a partir del cálculo de biomasa tanto en peso seco como en peso fresco (Balen et al., 2013; Martínez y Valverde, 2008; Ruedas et al., 2019) o bien respecto a aproximaciones geométricas del volumen de la planta (Loustalot, Malda, Suzán, Hernández, y Guevara, 2014).
En consecuencia, se pretende que los resultados obtenidos en este experimento constituyan un nuevo aporte para la medición de tales variables, describiendo lo encontrado.
RGR altura
Existió diferencia estadística entre los efectos generados en RGR a nivel de tratamientos (p = 0.034). De manera global, se puede observar que bajo condiciones in vitro la tasa de crecimiento es mucho mayor en todas las especies en comparación con lo que se obtuvo bajo el tratamiento ex vitro (Fig. 2). A nivel de especies, de acuerdo a la prueba de Tukey se presentó diferencia estadística entre la tasa de crecimiento de M. spinosissima respecto de las especies restantes, bajo todas las combinaciones in vitro.
Fig. 2 Efecto en el valor de RGR de altura bajo tratamientos in vitro con tres dosis de sacarosa vs tratamiento ex vitro, después de 280 días de incubación. Las barras de error indican la media ± desviación estándar.
En todas las especies se observó un incremento en la tasa de crecimiento bajo los medios suplementados con dosis de 6% y 9%. Sin embargo, no hubo diferencia estadística entre los efectos de estas dos concentraciones en cuatro de las cinco especies (p = 0.106), salvo en M. albilanata (p = 0.034), lo cual sugiere que la adición de concentraciones mayores de sacarosa no necesariamente genera incrementos mayores a los que se obtuvieron con suplementaciones de 60 g.L-1.
Las plantas más altas se presentaron en M. albilanata bajo el tratamiento al 9% de sacarosa con una media de 68 mm y una RGR de 0.16, mientras que para esta misma especie bajo el tratamiento ex vitro se alcanzó una altura promedio de 36 mm y una RGR de 0.07. El resto de las especies se distribuyó en rangos de RGR de 0.5 a 0.15 y alturas de 34 mm a 63 mm.
RGR diámetro
Al igual que en el resultado anterior, el valor de RGR fue mayor en el tratamiento in vitro (p = 0.021) y a su vez dentro de éste, se obtuvieron los valores más elevados en los medios suplementados con dosis de 6% y 9% de sacarosa. Para las especies M. columbiana, M. rhodantha y M. spinosissima no hubo diferencia entre los efectos promovidos por ambas dosis de sacarosa, contrariamente a lo que sí ocurrió para M. albilanata y M. bocasana (Fig. 3).
Fig. 3 Efecto en el valor de RGR de diámetro bajo tratamientos in vitro con tres dosis de sacarosa vs tratamiento ex vitro, después de 280 días de incubación. Las barras de error indican la media ± desviación estándar.
Los mayores diámetros se presentaron en M. albilanata con tamaños promedio de 19 mm en el mejor de los tratamientos (6%) mientras que el menor crecimiento se dio en M. spinosissima donde el diámetro promedio fue de 10 mm.
RGR longitud de raíz
Los valores de RGR en raíz presentaron diferencias significativas entre los tratamientos in vitro y el tratamiento ex vitro (p = 0.014). Las raíces más grandes se desarrollaron en los tratamientos suplementados con el 3% de sacarosa (Fig. 4), lo cual sugiere que, en dosis de sacarosa más elevadas el medio se torna hiperosmótico e inhibe la división y el alargamiento de las células de la raíz conduciendo a una menor longitud. La mayor longitud de raíz se presentó en M. albilanata con un tamaño promedio de 56 mm, seguidas de M. columbiana y M. spinosissima con 52 y 49 mm respectivamente. Para el caso de M. spinosissima no hubo diferencia en el valor de RGR bajo las tres concentraciones de sacarosa (p = 0.63).
Conclusiones
La germinación in vitro de semillas de las especies evaluadas presentó mejores respuestas en comparación con el tratamiento ex vitro en todas las variables. Al incrementar el nivel de nutrientes in vitro y suplementar con dosis de sacarosa entre el 3% y 6% se promovió un mayor crecimiento en las plantas durante el mismo lapso de tiempo que de manera ex vitro, además de que el porcentaje de sobrevivencia final fue del 100%.
La medición de las variables altura de planta, diámetro de planta y longitud de raíces resultaron un buen indicador para evaluar la tasa de crecimiento relativo (RGR). Finalmente, los resultados obtenidos se podrían implementar como una estrategia que contemple la germinación y crecimiento in vitro, obteniendo plantas más grandes y vigorosas en un menor tiempo para poder dirigirlas a esquemas de conservación ex situ e in situ de estas especies.
