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INTRODUCCIÓN
Los hongos son los principales microrganismos causantes de la pérdida en la calidad de los cereales almacenados, además de ocasionar una disminución en la viabilidad o poder de germinación de la semilla, decoloración en el grano, pudrición, modificación del valor nutricional y características organolépticas, así como la producción de micotoxinas (Hernández, 2005; Pascual, Calderón, & Calderón, 2000). Las micotoxinas son consideradas la principal causa de riesgo para la salud, ya que el consumo de granos contaminados, así como de sus productos puede ser fatal si estas se encuentran en altas concentraciones (Christensen & López, 1962; Dohlman, 2004; Ocampo, 2006). Pueden ser producidas por algunos hongos del género Aspergillus y son de gran importancia debido a su alto potencial para producir enfermedades en humanos y animales, además de causar grandes pérdidas económicas. Como ejemplo de estas micotoxinas están las aflatoxinas producidas por A. flavus y A. parasiticus y las ocratoxinas producidas por A. niger (Juárez, 2002; Luna, Lozada, & Trigos, 2010; Robledo, Marín, & Ramos, 2001; Vega, 2012). Estos microorganismos son controlados con fungicidas tradicionales, lo cual podría causar graves consecuencias sobre la salud humana y el medio ambiente, además que algunos hongos han generado resistencia a ellos (Hernández, 2005). Una de las alternativas ha sido el uso de compuestos de origen vegetal, que tienen la habilidad de inhibir su crecimiento y/o la producción de sus micotoxinas (Gamboa, Hernández, Guerrero, Sánchez, & Lira, 2003; Sánchez, 2002).
El ajo (Allium sativum) es un bulbo perteneciente a la familia Amaryllidaceae que se caracteriza por tener un sistema radicular constituido por una raíz bulbosa compuesta de 6 a 12 bulbillos, reunidos en su base por medio de una película delgada para formar la “cabeza del ajo” (Bender & Bárcenas, 2013; Còrdova, 2010), ha sido utilizado por diversas civilizaciones en la elaboración de alimentos y en múltiples preparaciones medicinales y se considera que su origen se pudo haber dado en Asia Central y de ahí migrado a Arabia, Egipto, India, China y al Mediterráneo (Ledezma & Apitz, 2006; Torija, Matallana, & Chalup, 2013). El interés de la ciencia por la capacidad antifúngica del ajo se remonta al siglo pasado, Timonin y Thexton (1951) y Tansey (1975) observaron que extractos acuosos del ajo pueden inhibir el crecimiento de diversas especies de hongos. En la actualidad se conocen más de 100 compuestos biológicamente activos derivados de Allium sativum contenidos sobre todo en el bulbo. Destaca una sustancia sulfurada inodora llamada aliína que por acción de aliinasa se convierte en esencia de ajo y levulosa. La esencia de ajo contiene la alicina, a la cual se le atribuyen efectos antimicrobianos y antimicóticos in vitro, contra Candida albicans y algunos hongos, principalmente dermatofitos y levaduras patógenas para el hombre. Alkahil (2005) probó extractos acuosos, por arrastre de vapor y etanólicos de ajo (Allium sativum) contra Fusarium oxysporum, pero fue el extracto acuoso el mejor con casi 95% de actividad fungicida (Corrales & Reyes, 2016; Kyung, 2012; Ledezma & Apitz, 2006; Moctezuma, Pedraza, Cárdenas, Martinez, & Acosta, 2016; Villa et al., 2014). Este efecto está asociado a que los extractos de ajo disminuyen la absorción de oxígeno, reducen el crecimiento, dañan las membranas e inhiben la síntesis de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos (Ankri & Mirelman, 1999; Bender & Bárcenas, 2013; Pundir & Jain, 2010). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de extractos crudos de ajo sobre el desarrollo in vitro de A. parasiticus y A. niger mediante diferentes ensayos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material vegetal
Se utilizaron ajos (Allium sativum) obtenidos directamente del productor y cultivados entre enero y junio del 2017 en el municipio de San Jerónimo Tlacochahuaya, perteneciente al estado de Oaxaca, México.
Preparación de extracto
El extracto de ajo se preparó al momento de realizar los ensayos y se mantuvo en refrigeración entre 4 y 10°C hasta su uso. Los dientes de ajo fueron pelados y macerados a temperatura ambiente en un mortero de porcelana con solución salina amortiguada por fosfatos (PBS) pH 7.2 en relación 1:1 (p/v), esta solución se consideró la concentración al 100%. Posteriormente el extracto se centrifugó por 10 min a 3000 rpm para quitar los sólidos disueltos.
Cepas fúngicas
Los hongos utilizados fueron: A. parasiticus cepa ATCC 16992 donada por la doctora Dora Linda Guzmán Ortíz, Jefa del Laboratorio de Micotoxinas del CINVESTAV Unidad Irapuato y una cepa silvestre de A. niger, ambas conservadas en agua con tritón al 0.01%.
Preparación de las cepas
Se inocularon 100 µL de una suspensión de esporas en placas de PDA y se incubaron a 28 + 2°C durante 7 días. Posteriormente, se recuperaron las esporas en agua con tritón al 0.01%, se determinó su concentración con cámara de Neubauer y se ajustó a 1.5 x 106 esporas/mL.
Evaluación in vitro de las propiedades antifúngicas del extracto de ajo
Para evaluar las propiedades antifúngicas del extracto de Allium sativum se realizó mediante las Técnicas del pozo en agar y dilución de extracto en agar reportadas por Moreno, González, Salcedo, Cárdenas, & Perales (2011) realizando modificaciones
a) Técnica del pozo en agar
Con espátula Drigalski se inocularon 100 µL de la suspensión de esporas en placas de PDA, con un sacabocados se hicieron pozos de 5 mm de diámetro a los que se agregaron 10 µL de extracto en diferentes concentraciones (50, 66, 75, 80 y 100%). Utilizando un control al cual se le agregaron 10 µL de PBS en lugar del ECA. Las placas se incubaron a 28 + 2°C durante 72 h, y los halos de inhibición se midieron cada 24 h.
b) Técnica de dilución del extracto en agar
Debido a que en ensayos con concentraciones mayores a 1% de extracto crudo de ajo era imposible medir el efecto, se envenenó el medio PDA adicionando concentraciones de ECA por debajo de ese valor (0.25, 0.35, 0.38 y 0.4%). Se inoculó por punción en el centro de las placas con una colonia de A. parasiticus de 144 h de desarrollo, utilizando un control sin extracto. Las placas se incubaron durante 6 días a 28 + 2°C, y se midió el crecimiento radial de las colonias cada 24 horas.
c) Unidades Formadoras de Colonias (UFC)
Para evaluar UFC se empleó la técnica reportada por Dìaz (2015), en tubos Eppendorf se agregaron 200 µL de extracto en diferentes concentraciones (50, 66, 75, 80 y 100%) y 100 µL de una suspensión de esporas (1.5 x 103 esporas/mL), utilizando un control sin extracto. Los tubos se incubaron durante 48 h a 28 + 2°C. Posteriormente, el contenido de los tubos se inoculó por vertido en placas con PDA, se incubaron por 48 h a 28 + 2°C y cada 24 h se realizó el conteo de colonias.
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Para determinar la concentración mínima inhibitoria se utilizó la técnica reportada por Moreno et al., (2011), realizando modificaciones, a partir de 100 µL de extracto crudo, en tubos Eppendorf, se realizaron diluciones seriadas con PBS (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64), posteriormente se agregaron 100 µL de una suspensión de esporas (1.5 x 106 esporas/mL) y 100 µL de Caldo Papa Dextrosa (CPD); los tubos se incubaron 48 h a 28 + 2°C. Se realizó microscopía de luz visible para confirmar la ausencia de crecimiento micelial. Para evaluar el efecto fungicida del extracto de ajo sobre los hongos, los tubos que no presentaron crecimiento micelial visible en la prueba de CMI, se lavaron con agua destilada estéril por centrifugación y las esporas se resuspendieron en 100 µL de agua destilada estéril, se inocularon en placas de PDA y se incubaron por seis días a 28°C + 2°C.
Interacción del extracto crudo de ajo con los hongos
Se realizó la misma técnica descrita para determinar la CMI y después de 48 h de incubación se realizó la observación por microscopia de luz visible para identificar los cambios morfológicos de esporas y micelio, el ensayo se realizó por triplicado.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación in vitro de las propiedades antifúngicas del extracto de ajo
a) Técnica del pozo en agar
Los extractos crudos de ajo mostraron efecto inhibitorio sobre el crecimiento de A. parasiticus y A. niger, presentando halos de inhibición durante las 72 horas de incubación. El análisis de Tukey (p < 0.05) indicó que al cabo de 72 de incubación existe diferencia significativa entre las medias de los resultados del extracto al 100% y las concentraciones al 50, 66 y 75%. Por otro lado, todas las concentraciones muestran diferencia significativa con respecto al control. El mayor efecto a las 72 horas de incubación lo presentó el extracto al 100%, con halos de inhibición de 12 mm para A. parasiticus y 15.5 mm para A. niger (tabla 1), estos resultados son similares a los obtenidos con el extracto etanólico de propóleo y los extractos acuosos de canela y clavo al 100%, los cuales presentaron halos de inhibición de 16, 11.3 y 15.4 mm respectivamente sobre A. niger (Bucio, Navarro, Martínez, & Torres, 2016; Cubillo, 2007). En otro trabajo, el extracto acuoso de ajo en una concentración de 10 g/mL presentó halos de inhibición de 0.5 cm sobre A. niger (Magro, Carolino, Bastos, & Mexia, 2006). En ensayos realizados con A. flavus, hongo con características fisiológicas similares a A. parasiticus, el extracto de hoja de zimmu, un híbrido interespecífico de A. sativum y A. cepa, inhibió un 73% el crecimiento del hongo con respecto al control, presentando un halo de 2.4 cm (Sandosskumar et al., 2007). Con el mismo hongo, el extracto de Melissa officinalis en una concentración de 58.25 mg/mL presentó halos de inhibición de 22 mm (Abarca, Bragulat, Castellá, Accensi, & Cabañes, 2000; Sara Centeno & Carrera, 2013), mientras que los extractos etanólicos de Thymus vulgaris y Rosmarimus officinalis (S. Centeno, Calvo, Adelantado, & Figueroa, 2010) produjeron halos de inhibición de 11.4 mm y 14.6 mm respectivamente, estos resultados son similares a los obtenidos en este trabajo con A. parasiticus. Algunos estudios han evaluado el efecto antifúngico de Allium sativum sobre otras especies de hongos. Un liofilizado de Allium sativum en una concentración de 400 µg/mL mostró halos de inhibición entre 1500-2000 mm para Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Microsporum canis y Candida albicans (Lora, Lujan, Robles, Saravia, & Cabeza, 2010). El extracto acuoso de Allium sativum a concentración de 9 y 10 g/ml inhibió el desarrollo de Fusarium culmorum, Penicillium sp. y Aspergillus candidus, produciendo halos de inhibición de 0.5-0.7 cm (Magro et al., 2006). En otro estudio el extracto de ajo (200 mg/ml) mostró halos de 20 mm sobre Trichophyton rubrum (Samuel, Andrews, & Jebashree, 2000).
Tabla 1 Valores promedio (mm) de los halos de inhibición de A. parasiticus y A. niger en respuesta a diferentes porcentajes de extracto crudo de ajo.
| Porcentaje de extracto crudo | Halo de inhibición (mm *) | ||
|---|---|---|---|
| Tiempo de incubación (h) | |||
| 24 | 48 | 72 | |
| A. parasiticus | |||
| 50 | 14.3c | 9.5c | 5.3d |
| 66 | 17.5b, c | 14.2b | 6c, d |
| 75 | 20a, b | 17.7a, b | 8.6b, c |
| 80 | 20.5a, b | 17.9a | 9.8a, b |
| 100 | 22.4a, b | 19.5a | 12a |
| Control | 0d | 0d | 0e |
| A. niger | |||
| 50 | 30.1a | 19.1a | 11a |
| 66 | 30.8a | 19.8a | 12.3a, b |
| 75 | 31.5a | 20.3a | 13.6a, b |
| 80 | 31.7a | 20.3a | 13.8b, c |
| 100 | 31.9a | 25.5b | 15.5c |
| Control | 0b | 0c | 0d |
*El halo de inhibición incluye el diámetro del pozo (5 mm); Los resultados son la media de seis repeticiones. **Letras diferentes en la columna indican diferencias significativas (Tukey, p < 0.05)
b) Técnica de dilución del extracto en agar
En los ensayos de dilución del extracto en agar, El análisis de Tukey (p < 0.05) indicó que al cabo de 144 de incubación existe diferencia significativa entre las medias de los resultados del extracto al 0.38 y 0.4% con respecto al control de A. parasiticus (tabla 2), el crecimiento disminuyó en 10 y 13% con colonias de 69.6 y 66.8 mm respectivamente, después de 144 horas de incubación. Con A. niger, el extracto de ajo mostró una diferencia significativa en todas las concentraciones con respecto al control. La concentración que inhibió en mayor porcentaje el crecimiento del hongo fue la de 0.4% con un 46.8% con una colonia de 40.1 mm (tabla 2).
Tabla 2 Valores promedio (mm) del crecimiento radial de A. parasiticus y A. niger en respuesta a diferentes porcentajes de extracto crudo de ajo.
| PorcentajeConcentración (ppm) | Crecimiento radial (mm*) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Tiempo de incubación (h) | ||||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | 120 | 144 | |
| A. parasiticus | ||||||
| 0.25 | 4a | 16.8a | 30a, b | 42.1a | 55a | 76.1a |
| 0.35 | 3a | 15.8a | 29.6a,b | 41.8a | 50.6a | 74a |
| 0.38 | 1.5b | 13b,c | 26.6b,c | 38.2a,b | 50b,c | 69.6b |
| 0.4 | 1.1b | 12c | 26.1c | 37.1b | 48.8c | 66.8b |
| Control | 6.6c | 18.6a | 32.6a | 47.1c | 59.5d | 77.5a |
| A. niger | ||||||
| 0.25 | 2.3b | 6.3b | 25.1b | 35.2b | 47.6b | 56.8b |
| 0.35 | 0c | 5.5b | 16.2b,c | 26.2c | 40.2b | 51.8c |
| 0.38 | 0c | 3.2c | 10.8c | 21.5d | 39.8c | 51.7c |
| 0.4 | 0c | 2.3c | 9.1c | 21.5d | 35.8d | 40.1d |
| Control | 10.2a | 27.6a | 42a | 62.7a | 68.3a | 75.3a |
*Letras diferentes en la columna indican diferencias significativas (Tukey, p < 0.05)
**En el cuadro se muestra la media de seis repeticiones.
Por otro lado, algunos estudios reportan que los extractos de canela y orégano en concentración de 250 ppm y los extractos etanólicos de Larrea tridentata, en una concentración de 100 mg/mL inhibieron en un 100% el crecimiento de A. flavus (Moreno et al., 2011), los extractos etanólicos de Allium sativum y Allium cepa a una concentración de 1 g/mL después de siete días de incubación inhibieron el desarrollo de A. flavus en 56.25 y 37.5% respectivamente (Tagoe, Nyarko, & Akpaka, 2011). Los extractos de Juniperus sabina y J. virginiana en concentraciones de 1000 ppm inhibieron el crecimiento de A. parasiticus en un 100% (Dambolena et al., 2011; García et al., 2006). Los extractos metanólicos de Karwinskia humboldtiana y Ambrosia ambrosioides al 6% inhibieron el crecimiento de A. niger en un 52 y 50% respectivamente, mientras que los extractos etanólicos de L. tridentata inhibieron el crecimiento de la misma especie en un 77.3% (Tequida, Cortez, Rosas, López, & Corrales, 2002); estos resultados son similares a los observados en este trabajo con el extracto crudo de ajo. Por otra parte, extractos metanólicos de Myrocaroues frondosus inhibieron en un 17% el crecimiento micelial de A. niger, los extractos etanólicos de Allium sativum y Allium cepa a una concentración de 1 g/mL después de siete días de incubación inhibieron en un 46.2 y 30.8% el desarrollo de A. niger (Jerke et al., 2008; Tagoe et al., 2011; Torija et al., 2013), porcentaje menor al observado con el extracto crudo de ajo. Por otro lado, el extracto acuoso de Allium sativum a una concentración de 100 mg/ml inhibió en un 100% el desarrollo de Trichophyton rubrum (Samuel et al., 2000).
c) Unidades formadoras de colonias (UFC)
Para evaluar la viabilidad de las esporas se realizó la prueba de UFC. Para A. parasiticus y A. niger, todas las concentraciones mostraron una inhibición del 100% con respecto al control sin extracto (figs. 1 y 2). En un estudio similar, Díaz (2013), reportó que el extracto de lectina de coleoptilo de Zea mays, incrementaba el número de colonias de A. parasiticus con respecto al control sin lectina, y que el extracto crudo de Sorghum bicolor a mayor concentración disminuía el desarrollo de sus colonias.
Fig. 1 Unidades Formadoras de Colonias de A. parasiticus a) 50%, b) 66%, c) 75%, d) 80%, después de 48 horas de incubación con extractos de ajo al e) 100% y f) control sin extracto.
Concentración mínima inhibitoria (CMI)
En la prueba para determinar la CMI, la dilución 1:2, que corresponde a 50 µL de extracto crudo, inhibió en 100% el crecimiento de A. parasiticus. En un trabajo similar, la CMI para A. flavus del extracto de Melissa officinalis se observó en la dilución 1:2.5 (23.30 mg/mL) y en el extracto etanólico de ajo en 20 mg/mL (Sara Centeno & Carrera, 2013; Pundir & Jain, 2010). Para A. niger, la CMI se observó en la dilución 1:32 (3.12 µL de extracto). Al respecto, Huamanì & Ruiz (2005), reportaron una CMI de 4 mg/mL con los extractos de Annona para este hongo. En trabajos realizados con extractos de ajo se encontró que la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto concentrado fresco del ajo (ECFA) estaba entre 40 y 50 µL del ECFA (0.8-1.0 mg/mL de proteína) sobre los hongos Histoplasma capsulatum, Cladophialophora carrionii y Exophiala dermatitidis (Moctezuma Zárate et al., 2016).
Allium sativum presentó una CMI a una concentración de 500 µg/mL sobre Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton rubrum, y de 2500 µg/mL sobre Candida albican (Lora et al., 2010). El compuesto activo del ajo, ajoeno presento una CMI en medio CSD de 2.5 y 5 en medio RPMI-1640, de 1,25 a 5 µg/ml sobre Histoplasma capsulatum (Torres & Romero, 2012).
Para A. parasiticus la concentración fungicida se encontró en la dilución 1:2, correspondiente a 50 µL de extracto de ajo, y para A. niger la concentración fungicida se observó en la dilución 1:16, (6.25 µL de extracto). García et al. (2006), reportaron concentraciones fungicidas de 1 000 y 2 000 ppm, sobre A. flavus con los extractos de orégano y canela respectivamente. Allium sativum liofilizado presentó una concentración fungicida de 1000 µg/mL sobre Histoplasma capsulatum, Cladophialophora carrionii y Exophiala dermatitidis, y de 5000 µg/mL para Candida albicans, por otro lado el ajoeno tiene una concentración fungicida de 5 y 10 µg/ml sobre Histoplasma capsulatum (Lora et al., 2010; Torres & Romero, 2012).
Interacción del extracto crudo de ajo con los hongos
En los estudios microscópicos se observó que el extracto crudo de ajo inhibió el crecimiento micelial de los dos hongos en la dilución 1:32, y redujo significativamente la cantidad de esporas, en comparación con el control sin extracto, en el cual se observó elongación de hifas y esporulación de cabezas conidiales, por lo que se puede concluir que el extracto crudo de ajo inhibe la germinación de las esporas de A. parasiticus y A. niger (fig. 3). Lo cual es diferente a lo reportado para las lectinas Concavalina A y Dolichos biflorus sobre A. parasiticus, las cuales indujeron la elongación de hifas y modificaron la morfología de las mismas (Dìaz, 2015).
Fig. 3 Microscopia de la interacción del extracto crudo de ajo con los hongos, Vista 40x: a) ECA-A. parasiticus, b) Control de A. parasiticus, c) ECA-A. niger, d) Control de A. niger.
Se ha reportado que algunos extractos vegetales contienen sustancias que muestran un efecto directo en la reducción o total inhibición del crecimiento de Aspergillus, mediante la degradación de componentes estructurales de pared celular, membrana celular, y organelos (Bhatnagar, Cary, Ehrlich, Yu, & Cleveland, 2006; Cupull, Andreu, Pérez, Delgado, & Cuppull, 2003). Y con respecto al extracto concentrado de ajo, la inhibición del crecimiento bacteriano se atribuye principalmente a la alicina (Jiménez & Zambrano, 2017; Moctezuma Zárate et al., 2016). Su efecto radica en el bloqueo de la síntesis de fosfatidilcolina, con una acumulación del compuesto precursor fosfatidiletanolamina, lo cual se traduce en una alteración en la estructura de la membrana celular y consecuente muerte celular (San Blas et al., 1997).
CONCLUSIONES
Allium sativum inhibe el crecimiento de A. flavus y A. niger in vitro. Debido a que se trabajó con un extracto acuoso, se puede atribuir el efecto antifúngico a la presencia de alicina; se presentó un mayor efecto sobre A. niger en algunos de los ensayos. La concentración mínima inhibitoria para A. parasiticus se encontró en la dilución 1:2 y para A. niger en 1:32, y las concentraciones fungicidas se observaron en las concentraciones 1:2 y 1:16 respectivamente. Se demostró mediante microscopia que a mayor concentración de extracto crudo de ajo mayor inhibición de la producción de micelio y esporulación en comparación con el control. En general, el efecto de los extractos de ajo dependerá de su concentración, volumen, tipo de extracción y la especie de hongo a estudiar.
