Introducción

Los helechos son plantas vasculares, que se originaron durante el Devónico según ^{Nazario-Galindo, & Arreguín-Sánchez (2007)}. En México habitan principalmente en los bosques mesófilos de montaña, de encino y pino, selvas altas perennifolias, matorrales xerófilos y en vegetación acuática ^{Montoya-Casimiro, Álvarez-Varela, Pérez-Hernández, & Arreguín-Sánchez (2000)}. A nivel mundial se estima que existen alrededor de 10 578 especies de helechos (^{PPG I, 2016}) y en México se calculan unas 1 100 ^{Riba (1993)}.

Los helechos presentan tres tipos de ciclos de vida: el isospórico, el heterospórico y el tipo Equisetum como lo refieren ^{Montoya-Casimiro, Álvarez-Varela, Pérez-Hernández & Arreguín-Sánchez (2000)} y ^{Arreguín-Sánchez, Fernández-Nava, & Quiroz-García (2004)}.

Una vez que las esporas caen en un medio propicio comienzan a germinar y a partir de la primera división de estas células comienzan a diferenciarse el rizoide y el filamento clorofílico. De acuerdo a ^{Nayar & Kaur (1971)} describen cuatro tipos de germinación: tipo Osmunda, Vittaria, Anemia e Hymenophylum; y, una vez que el filamento comienza a formar un talo se inicia el desarrollo protálico donde se reconocen siete tipos: Adiantum, Drynaria, Kaulinia, Marattia, Osmunda, Ceratopteris y Aspidium según ^{Nayar & Kaur (1969)}.

La formación de anteridios y arquegonios se realiza a partir de alguna de las células del prótalo que comienza a diferenciarse ^{Rodríguez-Ríos (1973)}.

El género Polystichum se incluye en la familia Dryopteridaceae según lo indican ^{Mickel & Smith (2004)}, ^{Christenhusz, Zhang & Schneider (2011)} y ^{PPG I (2016)}, se caracteriza por presentar frondes pinnadas o bipinnadas, densamente escamosas desde la base, los esporangios se encuentran protegidos por un indusio peltado a veces ausente o fugaz, esporas monoletes con patrones de ornamentación variados. En el mundo existen alrededor de 200 especies, en México prosperan 18, siendo una de ellas Polystichum fournieri (^{Mickel, J., & A.R., 2004}).

La hibridación es un fenómeno común en plantas y concretamente en el género Polystichum se ha observado que ocurre en varios taxones. La hibridación es la mezcla de genes de dos especies distintas que forman un organismo diferente a ellos. Los helechos híbridos comúnmente son estériles ^{Knobloch (1976)} y poseen estructuras intermedias de sus padres ^{Manton (1950)}. Los híbridos de Polystichum son triploides de padres diploides x tetraploides, y se cree que la perturbación y los sitios alterados la promueven y debido a ello constantemente se describen nuevas entidades taxonómicas, ^{Barrington (1985b)}. Los híbridos presentan caracteres morfológicos que los identifican como formas intermedias entre los padres, como son: esporas con tamaños reducidos, sin contenido celular o esporas del tamaño de las normales pero con paredes colapsadas, o bien esporas agrupadas, aunque también, pueden observarse esporas aparentemente normales (^{Chambi, C. J. Cardozo, R. M. & Martínez, O. G., 2013}) y es a través de estudios de desarrollo morfogénico de los gametófitos que se pueden detectar estas hibridaciones como la ausencia de uno o dos de los gametangios y la formación de esporófitos es a través de apogamia ^{Bell (1992)}.

Materiales y método

En la figura 1 se muestra los esporófitos de Polystichum fournieri de los cuales se tomaron las esporas. La especie se distribuye en México, Guatemala a Costa Rica. En México se ha recolectado en las entidades de Guerrero, Morelos, México, San Luis Potosí, Oaxaca y Chiapas. En el Valle de México es una planta escasa, se conoce de los municipios de Tlalmanalco y Amecameca a una altitud de 2 500 m.s.n.m. en bosque mesófilo de montaña según lo citan ^{Arreguín-Sánchez, Fernández-Nava & Quiroz-García (2004)}.

Fig. 1. Ejemplar herborizado de Polystichum fournieri A. R. Sm., recolectado en San Rafael, municipio de Tlalmanalco, Estado de México, 2 500 m.s.n.m., 16 de agosto 2006 y del cual se tomaron las muestras de esporas. 

La recolecta del material botánico fue realizada por Lucero Rosete. Las muestras de esporas de P. fournieri se tomaron de tres organismos en campo que tenían soros maduros, mismos que fueron colocados en sobres para traerlos al laboratorio, además se recolectó un ejemplar para su identificación, mismo que está en resguardo en el herbario de la ENCB (fig. 1).

La técnica utilizada para este trabajo fue la de (^{Montoya-Casimiro, M. C., Álvarez-Varela, R., Pérez-Hernández, S., & Arreguín-Sánchez, M.L., 2000}). Las esporas se sembraron en quince frascos de vidrio de 125 ml y se utilizaron cinco por sustrato. En total, por cada sustrato se sembraron 0.03 g de material que resultó de raspar los soros, mismos que se revolvieron en 0.5 g de arena de río esterilizada; este material se repartió por partes iguales en cada uno de los cinco frascos de cada soporte. Las condiciones en que se mantuvieron los quince frascos germinadores fueron con luz natural en el invernadero a una temperatura de 20 a 25ºC y cada frasco contenía 2 ml del agua con la que se esterilizó cada sustrato. Se tomaron muestras de un frasco por cada sustrato en intervalos de 15 días en condiciones de asepsia, uno se quedó como testigo y los otros germinadores se abrían una vez que se hubiera agotado el material biológico del anterior, la cantidad de muestra que se tomaba cada dos semanas era la que se alcanzaba a obtener con unas pinzas de punta fina, las muestras inmediatamente se fijaban en formol al 2% por 48 horas y posteriormente se teñían con safranina acuosa. Con lo anterior, se realizaron preparaciones permanentes que se montaron con una mezcla de miel de maíz, agua 1:1 y trazas de fenol, cada preparación se etiquetó con la fecha en que se fijó el material de cada soporte y fue así que se realizaron series de preparaciones las cuales se observaron, se interpretaron, se midieron y se tomaron fotomicrografías tanto al microscopio óptico como en el microscopio estereoscópico.

Cada una de las etapas correspondientes del desarrollo morfogénico como germinación, fase filamentosa, laminar y esporofítica, fueron observadas y descritas de acuerdo a las características de cada una de ellas, en la fase filamentosa: largo de los filamentos, número de células y rizoides; en la fase laminar: gametófito joven, largo, ancho, número de rizoides, gametófito adulto, largo, ancho, forma, sexualidad, número de rizoides; gametangios anteridios y arquegonios: tamaño, forma, número de anterozoides, número de células del canal del cuello y en los esporófitos: tricomas, forma de los primofrondes, venación. Estas medidas se tomaron cada 15 días para determinar el rango de desarrollo, con el propósito de establecer cuál de los tres soportes tenía las mejores características y condiciones para el desarrollo de la fase sexual de esta planta. Las medidas que se mencionan en las descripciones son los promedios de diez estructuras de cada fase.

La toma de muestras se suspendió el día 384 después de la siembra que fue cuando se formaron los esporófitos. Los frascos germinadores se siguieron observando tres meses después, cuando en musgo y maquique los esporófitos tenían de 1 a 6 cm de largo y en tierra de hoja seguían sin desarrollarse.

Resultados

En total se elaboraron 246 laminillas de preparaciones permanentes que sirvieron de base para describir los resultados. La cronología resumida del desarrollo morfogénico se expone en el cuadro 1 y en la figura 11 se muestra el concentrado gráfico del desarrollo de este taxón.

Esporas

Se distinguieron dos tipos con base en el tamaño y forma de las mismas, unas pequeñas (fig. 2A) con promedios de 43.5 µm de largo por 40.4 µm de ancho; al dividir las medidas del eje mayor entre eje menor se encontró el factor 0.92, por lo que se concluye que la forma de estas esporas es subesferoidal según ^{Kapp (1969)} el número de pliegues y crestas es entre 15 y 20, el grosor de la perina oscila entre 2 a 5 µm, la nexina y sexina de 1.5 µm respectivamente. Las otras esporas se apreciaron un poco más alargadas (fig. 2B), en promedio de 46.08 µm de largo por 32.7 µm de ancho con factor 1.4, por lo que la forma de la espora es elipsoidal según la obra de (^{Tryon, A., F., y Lugardon, L. 1991}), el número de pliegues y crestas son mayores a 20 y el grosor de la perina oscila entre 1 a 3 µm, nexina y sexina de 1 µm respectivamente y la superficie presenta un patrón rugulado.

Fig. 2. Esporas. A, espora pequeña subesferoidal (40X). B, espora grande elipsoidal (40X). 

Al revisar las esporas y diferenciar dos formas y tamaños de las mismas se contaron el porcentaje de estas en cinco esporangios tomados al azar observando una relación menor en las subesferoidales pequeñas (32%) y mayor número de las elipsoidales grandes (68%).

Germinación

Fue de tipo Vittaria descrita por (^{Nayar, B. K., & Kaur, S., 1971}), se presentó a los 15 días en musgo (fig. 3A), en maquique de los 29 a los 44 días (fig. 3B) y en tierra de hoja a los 44 días; para estas fechas, también se distinguían varios filamentos (fig. 3C, cuadro 1 y fig. 11).

Fig. 3. Germinación. A, en musgo (40X). B, en maquique (40X). C, germinación y filamentos en tierra de hoja (10X). 

Fase filamentosa

En musgo se presentó a los 15 días (fig. 4A), en maquique a los 29 días (fig. 4B) y en tierra de hoja entre los 44 a los 59 días (fig. 4C) en los tres sustratos esta fase se presentó con 5 a 6 células y los filamentos midieron entre 56 a 70 µm (cuadro 1, fig. 11). En todos los filamentos se diferencia un tricoma terminal y uno o dos rizoides de 22 a 28 µm de largo.

Fig. 4. Fase filamentosa. A, en musgo (10X). B, en maquique (40X). C, en tierra de hoja (40X). Figs. 4A y 4B, la flecha señala el tricoma terminal. 

Gametófito joven

Esta etapa se consideró antes de la formación de la escotadura (fig. 5), en musgo se apreció entre los 59 a 371 días, en maquique entre los 29 a 59 días y en tierra de hoja a los 59 días, en este último sustrato fueron muy escasos (cuadro 1, fig. 11). En todos los sustratos midieron entre 430 a 520 µm de largo por 564 a 580 µm de ancho. En todos los soportes se apreció el desarrollo de tricomas desde la fase filamentosa hasta los gametófitos jóvenes. El inició del desarrollo del prótalo fue a partir de un tricoma terminal en el filamento (fig. 5A) y posteriormente la formación de otro tricoma más (fig. 5C), entre ambos se diferenció el meristemo, dando origen al desarrollo tipo Aspidium (^{Nayar, B. K., & Kaur, S. 1969}).

Fig. 5. Desarrollo del prótalo tipo Aspidium. A, tricoma inicial de un filamento (40X). B, prótalo joven, mostrando dos tricomas en el gametófito (10X). 

Gametófito adulto

Se consideró gametófito adulto o cordado una vez que los prótalos tuvieron bien desarrollada la escotadura (cuadro 1, fig. 11). En musgo se obtuvieron desde los 103 a los 371 días (fig. 6), en maquique de los 83 a los 384 días (fig. 7) y en tierra de hoja entre los 59 a los 384 días (fig. 8). Paralelamente al desarrollo del prótalo se empezaron a diferenciar los gametangios y fue así que ya en esta etapa se observaron gametófitos unisexuales. En el soporte de musgo los gametófitos masculinos midieron entre 4 a 5 mm de largo y ancho; los femeninos de 6 a 7 mm de largo por 8 a 11 mm de ancho. En el maquique los prótalos masculinos fueron entre 2 a 3 mm de largo por 1.5 a 3 mm de ancho y los femeninos de 4 a 5 mm de largo por 2 a 4 mm de ancho y en tierra de hoja se presentaron gametófitos masculinos de 3 a 4 mm de largo por 3 a 5 mm de ancho y los femeninos de 6 a 8 mm de largo por 5 a 7 mm de ancho. En los tres soportes los gametofitos femeninos fueron un poco más grandes que los masculinos y formaban rizoides ventrales en mucho mayor cantidad que los masculinos y en varios de ellos, también se apreció el cojinete. En los gametófitos unisexuales masculinos y femeninos se observaron gran cantidad de tricomas marginales bicelulares de 250 a 300 µm (fig. 6F). En todos los sustratos se encontraron más gametófitos femeninos que masculinos, se contó la abundancia de los mismos que se tenían en las series de preparaciones fijas y se realizó una estimación porcentual. En total se contaron 68 gametófitos, 14 masculinos (32.6%) y 54 femeninos (65.2%).

Fig. 6. Gametófitos adultos en musgo. A, gametófito masculino (10X). B, anteridios (40X), C, gametofito femenino (10X). D, vista de los arquegonios (40X), E, detalle de unos arquegonios inmaduros (100X). F, detalle de un tricoma de los prótalos (40X). 

Fig. 7. Gametofitos adultos en maquique. A, prótalos masculinos (10X). B, detalle de un anteridio (40X). C, prótalos femeninos (10X). D, detalles arquegonios inmaduros (40X). 

Fig. 8. Gametofitos adultos en tierra de hoja. A, gametófito unisexual masculino (10X). B, anteridios (40X). C, gametófito unisexual femenino (10X). D, arquegonios inmaduros (40X). 

Apogamia

En musgo se encontró desde los 206 a los 384 días (fig. 9A), en maquique de los 103 a los 356 días (fig. 9B) y no se observó en tierra de hoja (cuadro 1).

Fig. 9. Formación de yema apogámica. A, en musgo (40X). B, en maquique (40X). 

Esporófito

En musgo se desarrolló entre los 206 a los 384 días (figs. 10A y 10B), en maquique entre los 103 a los 384 días (fig. 10C), en tierra de hoja no se desarrolló (cuadro 1, fig. 11). Los esporófitos se presentaron de uno a dos por gametófito, lámina flabelada con venación dicotómica.

Fig. 10. Esporófito joven. A, esporófito en musgo mostrando esporófito joven y gametófito adulto (10X). B, detalle de la primofronde (10X). C, esporofito en maquique (10X). 

Fig. 11. A. Esporófito adulto. B. Espora Subesferoidal. C. Espora elipsoidal. D. Germinacion tipo Vittaria E. Filamentos. F. Detalle de uno filamento con tricoma apicccaaal. G. Inicio del desarrollo protálico tipo Aspidium H. Gametofito joven I. Gametofito adulto J.Gametofito unisexuado masculino K. Anteridios L.Gametofitos unisexuados femenino M. Aspecto general arquegonios N. Detalle arquegonios O.Yema apogámica P.Esporófito joven con restos de gametofito adulto Q. Detall de la lamina joven de esporófito 

Discusión

Al comparar los datos de este trabajo con los de la bibliografía consultada (cuadro 2) se aprecia que el tiempo de germinación de las esporas fue variable, para P. polyblepharum entre 2 y 3 días; P. montevidense en 3 días; P. pycnolepis en 7 días; P. ordinatum en 35 días; P. distans a los 16 días en musgo y 30 a 44 días en maquique y tierra de hoja; en P. fournieri entre los 15 a los 44 días, siendo más largos los tiempos de germinación en los sustratos naturales, posiblemente debido a que los medios nutritivos tienen mayor cantidad de nutrientes que aceleran esta etapa, aunque es frecuente que el ciclo se detenga en el desarrollo morfogénico del protalo sin producir esporofitos. En todos los casos la germinación fue de tipo Vittaria, excepto en P. ordinatum que fue de tipo Anemia. Con respecto al número de células del filamento clorofílico osciló entre 3 y 11, en P. distans se cita para esta etapa la presencia de anteridios (protandria). El desarrollo protálico en todas las especies fue el tipo Aspidium.

Los gametófitos maduros son de forma cordada en las especies citadas en el cuadro 2 y en P. ordinatum también existe la forma alargada en prótalos unisexuados masculinos. La sexualidad de los prótalos depende de la especie, desde los que sólo forman arquegonios como P. tsussemense y P. montevidense, o arquegoniados y bisexuados como en P. pycnolepis y P.polyblepharum o bien unisexuados masculinos, unisexuados femeninos y bisexuados como en P. distans, o sólo unisexuados masculinos y femeninos como en P. ordinatum y P. fournieri.

En ningún trabajo se cita la relación entre forma y tamaño de las esporas con la sexualidad de los gametófitos, en P. fournieri se estima que estas variaciones pueden estar ligadas a la formación de gametófitos unisexuales femeninos y unisexuales masculinos que está determinada entre otros aspectos por la forma y tamaño de las esporas. El porcentaje de esporas subesferoidales y pequeñas fue de 32%, y de las esporas más grandes elipsoidales fue de 68%. El número de gametófitos masculinos fue de 32.6% y de los gametófitos femeninos de 67.5%, por lo anterior y dada la relación porcentual que se encontró entre tamaño y forma de las esporas y la sexualidad de los gametófitos se considera que las esporas pequeñas subesferoidales son las que podrían originar protalos masculinos y los más grandes elipsoidales, podrían originar protalos femeninos.

En el cuadro 2 sólo Polystichum ordinatum y P. fournieri presentaron gametófitos unisexuados masculinos y unisexuados femeninos, pero la última con prótalos masculinos y femeninos cordados y la primera con prótalos femeninos cordados y masculinos alargados.

En P. montevidense se encontraron dos tamaños de esporas según lo citado por (^{Chambi, C. J., Cardozo, R. M., & Martínez, O. G., 2013}) quienes además indican que el 12% de ellas presentan tamaño reducido, sin contenido celular o esporas del tamaño de las normales pero con paredes colapsadas, que formaron sólo arquegonios sin desarrollo de esporófitos.

^{Wagner, W. H., & Lim Chen, K., (1965)} indican que estos aspectos permiten la detección de factores genéticos que llevan a suponer la presencia de entidades híbridas y/o poliploides como esporas colapsadas, sin contenido celular.

En P. fournieri las esporas son aparentemente normales, con formas y tamaños diferentes, se desarrollaron los dos tipos de gametangios, que no maduraron para finalmente producir esporófitos apogámicos. Sin embargo ^{Bell (1992)}, considera que la presencia de estas dos últimas características son suficientes para considerar que es una entidad híbrida y/o poliploide.

Con respecto a la formación de esporofitos, según se aprecia en el cuadro 2, los taxones que formaron esporofitos apogámicos fueron: P. tsussemense, P. fournieri y P. polyblepharum, los taxones que no desarrollaron esporófitos fueron P. pycnolepis y P. montevidensis y aquellas especies que produjeron esporófitos sexuales fueron P. retroso-paleaceum, P. ordinatum y P. distans. Considerando lo anterior, habría que resaltar que de las ocho especies sólo tres produjeron esporofitos sexuales y las otras cinco o no produjeron o formaron esporófitos apogámicos. A este respecto, ^{Patterson (1942)} menciona que la presencia de esporófitos apogámicos indica un desorden genético al presentarse una meiosis incompleta; ^{Barrington (1985a)} menciona que Polystichum es un género cuyas especies tienden a hibridarse; (^{Mickel, J. T., & Smith, A. R., 2004}) dicen que es un género proclive a formar híbridos. Tomando en cuenta las consideraciones anteriores, entonces esas cinco especies podrían considerarse híbridos o entidades poliploides por presentar una o varias de las siguientes condiciones: formación de esporófitos apogámicos o bien no se forman, la carencia de gametangios o bien la formación de gametangios no viables o de sólo uno de ellos y esporas anómalas. Entre estas condiciones caería P. fournieri por desarrollar gametangios no viables y esporófitos apogámicos.

En el cuadro 2 se incluyen datos del desarrollo morfogénico de P. muricatum X P. polyphyllum el cual muestra parte del comportamiento típico de un híbrido según ^{Barrington (1985b)}, con la formación de prótalos multicordados y anteridios y arquegonios estériles, sin desarrollo del esporófito. (^{Tahuilán-Martínez, J. U., Arreguín-Sánchez, M. L., & Fernández-Nava, R., 2003}) mencionan la presencia de esporas anormales en un híbrido de Plecosorus speciosissimus y Polystichum rachichlaena. En P. fournieri no se presentaron los caracteres mencionados por estos autores.

(^{Panagua, E., Quintanilla, L. G., Sancho, A., & Pajarón, S., 2003}) estudiaron la generación gametofítica del alotetraploide Polystichum aculeatum y sus padres diploides P. setiferum y P. lonchitis, detectando el 100% de germinación en el tetraploide y las diferencias que encontraron con este y sus padres diploides fueron el largo de los gametófitos y la longitud de los tricomas marginales, la expresión en el alotetraploide fue la mezcla de los diploides, en este trabajo el alotetraploide no parece presentar caracteres de poliploidia citados por autores anteriores como ^{Barrington (1985a)} y ^{Bell (1992)}.

En P. fournieri el desarrollo del esporófito se observó en musgo a partir de los 206 días y en maquique a los 103 días y en tierra de hoja no se desarrollaron, la posible explicación al respecto podría deberse a lo citado en el trabajo de (^{Watson, P. J., & Vázquez, M., 1981}) quienes indican que el microhábitat es trascendental en la historia de vida de las especies y las propiedades del sustrato son importantes, según estos autores el desarrollo apropiado del esporófito requiere de la asociación con musgos, ya que este evita la desecación y a la raíz del helecho joven le otorga agentes antimicóticos. Con lo anterior, quizás los prótalos de P. fournieri en una etapa de su desarrollo requieran de la protección del musgo contra la desecación, razón por la cual obtuvimos esporófitos en musgo. En el caso del maquique que son raíces adventicias de los helechos arborescentes, es probable que estas les confieran protección, razón por la cual, también se desarrollaron esporófitos en maquique. En tierra de hoja, que se hubiera pensado fuera el sustrato idóneo para la especie, sólo se formaron gametófitos unisexuados masculinos y femeninos que no alcanzaron la madurez ni formaron esporófitos. Cabe destacar que los tres sustratos se encuentran en los bosques mesófilos de montaña y que quizás la tierra de hoja sea el soporte idóneo para los esporofitos adultos, pero para los gametófitos jóvenes los soportes que les brindan protección y humedad son los aptos para ese periodo de vida.

Considerando que esta especie desarrolló esporófitos en maquique a los tres meses y medio, puede ser apta para cultivarse con miras a un posible aprovechamiento comercial, pero además estos datos podrían contribuir al conocimiento de la ecología de la colonización en las primeras etapas de su desarrollo, en esclarecer problemas de tipo taxonómico y en particular con aspectos relacionados con la hibridación y poliploidia del género.

Por último, analizando los trabajos del cuadro 2, P. fournieri se diferencia de los otros taxones por la presencia de dos tipos de forma y tamaño de esporas, la presencia de gametófitos cordados unisexuados masculinos y unisexuados femeninos, la falta de maduración de ambos gametangios y el desarrollo de esporófitos apogámicos.

Conclusión

El desarrollo morfogénico de los gametófitos y esporófitos jóvenes de P. fournieri se llevó a cabo en maquique y musgo, en tierra de hoja no se formaron esporófitos, considerando que los esporófitos en maquique se desarrollaron en tres meses y medio podría considerarse una especie apta para el cultivo en este soporte.

P. fournieri se diferencia de los taxones hasta ahora estudiados por la presencia de dos tipos de forma y tamaño de esporas, la presencia de gametófitos cordados unisexuados masculinos y unisexuados femeninos, la falta de maduración de ambos gametangios y el desarrollo de esporófitos apogámicos.

Según varios autores la serie de caracteres reproductivos que presenta esta especie, indicaría que podría ser una entidad híbrida y/o poliploide.

La relación porcentual de las esporas por la forma y el tamaño resultó coincidir con el número de gametofitos masculinos y femeninos que se desarrollaron, lo cual sugiere la posibilidad de que las esporas chicas y subesferoidales pueden desarrollar gametofitos masculinos y las esporas elípticas y grandes, gametofitos femeninos.