Inducción organogénica de Jatropha curcas L. a partir de hojas jóvenes

 

Organogenic induction of Jatropha curcas L. from young leaves

 

I.L. Pequeño-Granado¹, R.E. Vázquez-Alvarado¹, J.A. Santos-Haliscak¹, A.I. Luna-Maldonado¹, G. Moreno-Degollado³, L. Iracheta-Donjuan², P. López-Gómez¹, M. Castellanos-Juárez¹, y M.C. Ojeda-Zacarías¹

 

¹ Universidad Autónoma de Nuevo León, Campus de Ciencias Agropecuarias, Facultad de Agronomía, Francisco Villa s/n, col. Ex-Hacienda El Canadá, 66054 Escobedo, Nuevo León, México.

² Instituto Nacional Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Rosario Izapa, Km 18 de la carretera Tapachula a Cacahoatan, 30870 Tuxtla Chico, Chiapas, México.

³ Centro de Producción Agropecuaria. Universidad Autónoma de Nuevo León. Carretera Nacional Linares-Cd. Victoria Km. 145, cp 67700, ap 93, Linares, Nuevo León, México. Correo electrónico: ojedacz@yahoo.com.mx.

 

Recibido: 16 marzo 2013.
Aceptado: 6 junio 2014.

 

Resumen

Jatropha curcas L., conocida en México como piñoncillo, es una especie productora de aceite, la cual ha recibido gran atención en recientes años al ser utilizada como fuente para la elaboración de biodiesel debido que sus semillas llegan a producir de 46 a 64% de aceite. Sin embargo, la producción de Jatropha ha demostrado limitado éxito debido al heterogéneo rendimiento de semillas y contenido de aceite. Por tal motivo, se ha impulsado la selección de genotipos con características de rendimiento superiores para ser propagados a gran escala. Por esta razón, la propagación clonal mediante la técnica de cultivo de tejidos vegetales ofrece una alternativa de homogeneidad genética. Por lo que, en esta investigación se estudió la inducción organogénica a partir de hojas jóvenes de piñoncillo de un genotipo mexicano. Logrando el establecimiento aséptico de los explantes en el medio de cultivo Murashige & Skoog 1962 (MS), después de 14 días del establecimiento in vitro, existiendo un 70% de explantes asépticos. Con respecto a la inducción de yemas la mayor respuesta se logro en el tratamiento uno, utilizando el mismo medio básico de (MS) suplementado con 1.0 mg L^-1 de 6-bencil-aminopurina (BA) y 0.5 mg L^-1 de ácido indol-3-butírico (AIB), logrando la formación de yemas después de 60 días, el porcentaje de viabilidad se presentó en un 37.5%, mientras que el número de yemas adventicias fue de 2.2, todos los tratamientos presentaron la asociación de callo. Mientras que en la proliferación de brotes, la mayor respuesta se presento en el tratamiento dos, mas la adición de 0.5 mg L^-1 de BA, con un promedio de 5.14 brotes por explante después de cuatro semanas.

Palabras clave: hoja, in vitro, yemas, brotes, Jatropha curcas L., inducción.

 

Abstract

Jatropha curcas L., known in Mexico as "piñoncillo", is an oil producing species, which has received much attention in recent years as a source for biodiesel production because their seed yield from 46 to 64% oil. However, Jatropha production has shown limited success due to heterogeneous seed yield and oil content. For this reason, the selection of genotypes with superior performance characteristics to be propagated on a large scale has increased. Therefore, clonal propagation by plant tissue technique offers an alternative for genetic omogeneity. So, in this research, the organogenic induction from young leaves of a Mexican Jatroppha genotype was studied. The establishment of in vitro asceptic explants in Murashige & Skoog 1962 (MS) culture media was accomplished after 14 days with 70% asceptic explants. With respect to the induction of buds, greater response was achieved in treatment one, using the same basic media supplemented with 1.0 mg L^-1 6-benzyl-aminopurine (BA) and 0.5 mg L^-1 indole-3-butyric acid (IBA), achieving bud formation after 60 days, viability was 37.5%, while the number of adventitious buds was 2.2, all treatments showed callus association. In bud proliferation, the greatest response was in treatment two, with the addition of 0.5 mg L^-1 BA, with an average of 5.14 shoots per explants after four weeks.

Key words: leaf, in vitro, buds, shoots, Jatropha curcas L., induction.

 

Introducción

Jatropha curcas L. conocida en México como piñoncillo, es una especie perteneciente a la familia de las Euphorbiaceae, que podemos encontrar en climas tropicales y subtropicales de América Latina, África y Asia (Francis et al., 2005; Brittaine y Lutaladio, 2010). Se considera centro de origen México y Centro América, donde se desarrolla en forma silvestre (Heller, 1996). Es un arbusto grande o árbol pequeño de rápido crecimiento que puede alcanzar más de cinco metros de altura en buenas condiciones, es tolerante a sequias y fácil propagación (Divakara et al., 2010). La planta se utiliza ampliamente como cerco vivo, tutor de otros cultivos, control de erosión, como subproductos en la elaboración de jabones, plaguicidas también es utilizada con fines medicinales (Brittaine y Lutaladio, 2010); donde sobresale su comprobada actividad antiviral en contra de cepas resistentes del VIH (Dahake et al., 2012). Por otro lado, la producción de semillas con altos contenidos de aceite que varían de 46-64% (Martinez-Herrera et al., 2010); ha recibido gran atención al ser utilizado como materia prima para elaboración de biodiesel (Kumar et al., 2007; Ceasar y Ignacimuthu, 2011).

Tradicionalmente Jatropha curcas L., es propagada a partir de semillas y esquejes, las cuales cuentan con múltiples desventajas, entre las principales, se encuentra la gran variabilidad genética presente cuando es propagada por semillas, atribuida a la polinización cruzada de la especie (Ginwal et al., 2005). Por otro lado, la propagación clonal por esquejes es posible, pero tiene múltiples desventajas, por ejemplo, menor longevidad, débil anclaje al suelo, bajo rendimiento de semillas, alta susceptibilidad a plagas y enfermedades; debido al desarrollo de seudo-raíces la tolerancia a sequia es baja (Sujatha et al., 2005; Brittaine y Lutaladio, 2010; Mukherjee et al., 2011).

Con base en lo anterior, el uso de la técnica del cultivo de tejidos vegetales ofrece una alternativa para producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto (Sujatha et al., 2005; Misra et al., 2010a; Olmos et al., 2010). La inducción organogénica de brotes de novo a partir de explantes cultivados in vitro es una vía frecuentemente usada en los métodos de mejoramiento biotecnológico como la microprogación in vitro (Duclercq et al., 2011). La organogénesis de novo se basa en la totipotencia de las células somáticas para generar plantas enteras in vitro. (Iliev et al., 2010). El desarrollo de meristemos de novo está influenciado por la aplicación de reguladores de crecimiento exógenos (Sangwan et al., 1997; Iliev et al., 2010). El cultivo de tejidos vegetales, hace uso de la organogénesis directa a través del estímulo de reguladores de crecimiento para impulsar el desarrollo de brotes adventicios (Beyl, 2010).

En estudios de microprogación de Jatropha curcas, el medio más utilizado es el (Murashige y Skoog, 1962) MS, el cual se reporta que estimula y mejora la respuesta de los tejidos (Ceasar y Ignacimuthu, 2011; Mukherjee et al., 2011). En la inducción de organogénesis directa a partir de explantes de hoja los reguladores de crecimiento más empleados han sido N6-bencilaminopurina (BA) y ácido indol-3-butírico (AIB) (Sujatha et al., 2008). Así mismo; Sujatha y Mukta (1996) reportan que utilizando el mismo tipo de explante tuvieron la inducción de brotes mediante el uso de BAP en combinación con AIB. Existen diversos trabajos relacionados con la regeneración de Jatropha curcas L. desarrollados a través de la organogénesis directa, utilizando diferentes tipos de explantes tal es el caso de (Sujatha y Mukta, 1996; Kumar y Reddy, 2010; Kumar et al., 2010a; Sharma et al., 2011, Kumar y Reddy, 2012) que a través de peciolos, cotiledones e hipocotilos lograron la regeneracion de la especie. Así mismo, Khurana-Kaul et al.(2010); Kumar et al. (2010c); Misra et al. (2010a); Kumar et al. (2011), lograron la regeneración directa a partir de hojar; mientras que, Wei et al. (2004) logró buenos resultados a través de epicótilos, por su parte Datta et al. (2007); Shrivastava y Banerjee (2008); Misra et al. (2010b); Singh et al. (2010) trabajando con nudos axilares lograron buenos resultados en la regeneración de la especie; por otro lado, Daud et al. (2013) logró la regeneración a través de los ápices in vivo. Aunque, la mayoría de los estudios que se reportan en organogénesis se han hecho a partir de genotipos de la India, de modo que es necesario el estudio de los factores que afectan la organogénesis en genotipos mexicanos, ya que se han encontrado amplias variaciones genéticas entre genotipos (Basha y Sujatha, 2007). Por tal motivo, en este estudio se planteó desarrollar una metodología para inducir la organogénesis directa de un genotipo mexicano de piñoncillo, mediante la técnica de cultivo de tejidos. Así como definir el medio de cultivo y dosis de reguladores de crecimiento para el establecimiento e inducción de brotes en el genotipo utilizado.

 

Material y métodos

Como material experimental se empleó el genotipo INI-6 de Jatropha curcas L. donado por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Campo Experimental Rosario Izapa, km 18 de la carretera Tapachula a Cacahoatan, 30870 Tuxtla Chico, Chiapas, México. La investigación se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Facultad de Agronomía, unidad Marín de la Universidad Autónoma de Nuevo León. Ubicado en la carretera Zuazua-Marín Km 17.5 del municipio de Marín, Nuevo León, México.

Técnica de desinfección de los explantes

La predesinfección consistió en la selección de hojas jóvenes en óptimas condiciones de estacas en invernadero de dos meses de edad, obtenidas de árboles adultos en producción. El material vegetal colectado se lavó con jabón líquido y agua potable, para poder llevarlos a condiciones de asepsia bajo una campana de flujo laminar para realizar el proceso de desinfección. Los explantes fueron sumergidos en etanol al 70% por 30 segundos, posteriormente se realizó la inmersión en hipoclorito de sodio (NaClO) al 1.0% durante 5, 10 y 15 min (cuadro 1). Los tratamientos fueron adicionados con 0.1% de tween-20, concluido el periodo de inmersión en el agente desinfectante se realizaron tres enjuagues con agua bidestilada estéril, procediéndose a colocar los explantes en una solución antioxidante basada en (Misra et al., 2010b), constituida por sacarosa, 3.0% p/v; glutatión reducido, 25 mg L^-1; ácido ascórbico, 10 mg L^-1, durante el desarrollo de la siembra.

Inducción de explantes in vitro

Con la finalidad de desarrollar la morfogénesis directa en explantes de la especie, se procedió a realizar cortes de láminas de hojas de 1.0 cm² como fuente de explante los cuales fueron sembrados en medio basal MS en frascos de vidrio con 20 ml de medio de cultivo, adicionados con vitaminas y reguladores de crecimiento: Inositol 100 mg L^-1; Tiamina 0.1 mg L^-1; Piridoxina 0.5 mg L^-1; Glicina 2.0 mg L^-1; Sacarosa 30 g L^-1; Phytagel® 4.5 g L^-1; pH ajustado a 5.60 ± 0.02. Los reguladores de crecimiento fueron Benciladenina, BA, 0.5 y 1.0 mg L^-1 y el Ácido Indolbutírico, AIB, 0.1 y 0.5 mg L^-1, en este experimento no se incluyo el uso de un testigo debido a que en bioensayos anteriores no existió desdiferenciación celular en ausencia de fitohormonas en los explantes después de cuatro y seis semanas de permanecer en los medios de cultivo por esta razón no se utilizaron otras fuentes de sales minerales en esta investigación. (cuadro 2). Concluida la siembra las unidades experimentales fueron colocadas en condiciones controladas de temperatura de 26 ± 2°C y bajo condiciones de fotoperiodo de 16 horas luz a 35-40 μmol m^-2 s^-1. Se establecieron bajo un modelo estadístico completamente al azar, con 10 repeticiones por tratamiento. Los datos fueron analizados a través de análisis de varianza utilizando el programa estadístico Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versión 20. Las variables a evaluar fueron porcentaje de contaminación, oxidación, viabilidad, número de yemas y presencia de callo. El porcentaje de contaminación y oxidación se evaluara después de 14 días del establecimiento in vitro, mientras que las otras hasta los 60 días.

Proliferación de brotes

Concluida la fase de inducción de yemas, los explantes fueron subcultivados al mismo medios de cultivo MS pero con tres dosis del regulador de crecimiento, para este etapa se utilizó el BA a razón de (0.5, 1 y 2 mg L^-1). De igual manera que la etapa anterior, las unidades experimentales se establecieron bajo un modelo estadístico completamente al azar, con 10 repeticiones por tratamiento en condiciones controladas similares a la etapa anterior. Los datos fueron analizados a través de análisis de varianza utilizando el programa estadístico Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versión 20. Las variables a evaluar fueron: número de brotes después de cuatro semanas del subcultivo.

 

Resultados y discusión

Técnica de desinfección de los explantes

La técnica de desinfección utilizada favoreció el establecimiento aséptico de explantes al controlar la contaminación y permitir continuar el desarrollo de los explates in vitro. Después de transcurridos 14 días se logró observar claramente la respuesta con relación al porcentaje de contaminación y oxidación en los tratamientos, los cuales variaron en función de la concentración del NaClO y tiempo de exposición (cuadro 3).

Los resultando mostraron que el tratamiento dos expresó un 70% de explantes asépticos y 30% de explantes sin oxidación y viables, en comparación con los resultados del tratamiento tres, que presentó oxidación en todos los explantes con cero viabilidad y el tratamiento uno contaminación total. Esta respuesta se puede sustentar con lo mencionado por Mroginski et al. (2010) que señala que uno de los métodos más empleados para el control de la contaminación microbiana en cultivo de tejidos vegetales consiste en la inmersión de explantes en etanol al 70% durante 20-60 segundos, seguido de la inmersión en NaClO del 1.0 a 3.0%. Así mismo, Daudet et al. (2011) mencionan que los principales agentes desinfectantes utilizados en la desinfección de Jatropha curcas son el cloruro de mercurio (HgCl₂) y el hipoclorito de calcio (Ca(ClO)₂). Por lo tanto, el NaClO puede ser utilizado en la desinfección de hojas de esta especie.

Con respecto a la oxidación los resultados muestran un aumento en función del tiempo de exposición al agente desinfectante produciendo serios daños en los tejidos, esto conlleva al oscurecimiento de los mismos. Así mismo, He et al., (2009) menciona que el oscurecimiento es producto de la oxidación de fenoles para formar quinonas, los cuales reaccionan generando daño e incluso la muerte de los tejidos vegetales. Por su parte, Olmos et al. (2010) y Hernández y González (2010) reportan que en especies leñosas es común la secreción de polifenoles oxidados al medio del cultivo, visibles como pigmentos marrones y/o negros.

Evaluación de la inducción de explantes in vitro

El desarrollo de los explantes se logró en medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS) en combinación de 1.0 mg L^-1 de 6-bencil-aminopurina (BA) y 0.5 mg L^-1 de ácido indol- 3-butírico (AIB), se observó se y cuantificó la formación de pequeñas estructuras después de 60 días, las variables que se evaluaron fueron porcentaje de viabilidad, número de yemas por explante y formación de callo (cuadro 4). El análisis de varianza mostró una diferencia significativa realizándose una comparación de medias a través de la prueba de Tukey mostrando diferencia en el tratamiento uno, en comparación con el tratamiento tres y cuatro, pero siendo similar estadísticamente al tratamiento dos. De tal manera que lo anterior puede atribuirse a la relación de auxinas y citocininas utilizadas, que estimulan el desarrollo de brotes (Skoog y Miller, 1957; Che et al., 2002).

Evaluación de proliferación de brotes

La proliferación de brotes fue registrada a las cuatro semanas después de establecidos los explantes en el medio de cultivo MS, con tres dosis de BA, presentándose una mayor respuesta en el tratamiento uno (cuadro 5). El análisis de varianza mostró una diferencia significativa y al realizar la comparación de medias a través de Tukey se encontró diferencia en los tratamientos dependiendo a la dosis al BA, que contenía el medio de cultivo, de acurdo a los resultados presentados se muestra una tendencia que a medida que se incrementa la dosis del BA disminuye el número de brotes.

 

Conclusiones

Con respecto a la técnica de desinfección se logró el establecimiento aséptico de los explantes esto permitió continuar con la siguiente etapa de desarrollo in vitro de hoja de Jatropha curcas L. en condiciones asépticas.

La mayor respuesta de inducción morfogénica se logró en medio de cultivo de MS más la adición de 1.0 mg L^-1 de (BA) y 0.5 mg L^-1 (AIB), la respuesta fue de un 37.5% de viabilidad y 2.2 yemas adventicias en promedio por explante, mediante la vía de la organogénesis directa.

El mayor número de brotes se presentó en la etapa de proliferación en el mismo medio de cultivo con 0.5 mg L^-1 de BA con un promedio de 5.14 brotes por explante.

Recomendaciones

Se recomienda establecer las plantas madres en condiciones de invernadero, para poder tomar varetas como fuente de explates de una manera más controlada con el saneamiento de las hojas jóvenes de Jatropha curcas L. y bajar los índices de contaminación en el establecimiento in vitro.

Se recomienda ajustar el medio de cultivo y las dosis de los reguladores de crecimiento en las siguientes etapas de desarrollo de la organogénesis de la especie. Por otro lado, se sugiere hacer uso de antioxidantes en medio de cultivo para disminuir la oxidación en los explantes.

 

Agradecimiento

Al Programa de Apoyo de Investigación Científica y Tecnológica (PAICYT, 2011) otorgado a través de la Universidad Autónoma de Nuevo León.

 

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