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Introducción
La conservación de la diversidad genética es crucial para mantener la estabilidad de ecosistemas forestales, ya que contribuye significativamente en la adaptación de las especies ante factores adversos, o nuevas condiciones ambientales, como el cambio climático (Kim, Richardson, McDonald y Klopfenstein, 2011; Vangestel et al., 2016). Además, la diversidad genética dentro de especies forestales permite realizar programas de selección para incrementar la probabilidad de éxito en programas de reforestación (Ivetić, Devetaković, Nonić, Stanković y Šijačić-Nikolić, 2016). Por lo anterior, el conocer la diversidad y estructura genética de las especies forestales es importante para planear una reforestación, ya que se pueden diseñar estrategias para la conservación de recursos genéticos (Pazouki et al., 2016; Bilgen y Kaya, 2017).
La hibridación es un promotor de la diversidad genética; este fenómeno es común dentro del reino vegetal, pues se estima que aproximadamente 25% de las especies de plantas pueden hibridar (Mallet, 2005). No obstante, la hibridación puede afectar la morfología, capacidad productiva y viabilidad de la semilla de especies arbóreas (Roe et al., 2014). Por esta razón, el nivel de hibridación en arboles semilleros podría tener influencia en la calidad de la semilla y en la probabilidad de éxito de los programas de reforestación. En este sentido, es importante que se identifique si existe la posibilidad de hibridación en rodales semilleros donde habitan dos o más especies de importancia económica.
Pinus arizonica Engelm. y P. durangensis Mtz. son especies forestales de importancia económica y ecológica en México. Ambas especies tienen potencial maderable y son catalogadas como especies clave en los ecosistemas forestales de la Sierra Madre Occidental (Silva-Flores, Pérez-Verdín y Wehenkel, 2014). En el estado de Chihuahua, P. arizonica y P. durangensis se distribuyen en 80% de la superficie forestal y generan aproximadamente 160 000 m3 y 190 000 m3 de madera al año, respectivamente (Comisión Nacional Forestal [Conafor], 2009). Ecológicamente, estas especies son clave en los bosques templados del estado de Chihuahua porque ocupan alrededor de 34% y 16% de la composición arbórea, respectivamente (Hernández-Salas et al., 2013). Por lo anterior, es importante que se fortalezcan los planes de manejo para el aprovechamiento sustentable y la conservación de los recursos genéticos de estas especies.
Estudios previos han evaluado la diversidad, estructura genética y capacidad de hibridación de P. arizonica y P. durangensis. Un ejemplo de esto es lo publicado por Hernández-Velasco et al. (2017), quienes encontraron una estructura genética definida en poblaciones de P. durangensis. Otros estudios indican que existe amplia diversidad y una estructura genética definida en poblaciones de P. arizonica (Friedrich, Hernández-Díaz, Leinemann, Prieto-Ruíz y Wehenkel, 2018). Respecto a la hibridación, Ávila-Flores, Hernández-Díaz, González-Elizondo, Prieto-Ruíz y Wehenkel (2016) estudiaron rodales de P. engelmannii Carr. y encontraron que puede hibridar con P. arizonica y P. durangensis. Estos estudios fueron realizados en el estado de Durango, mientras que en el estado de Chihuahua se carece de información sobre la diversidad, estructura genética y capacidad de hibridación de estas especies.
Materiales Y Métodos
Área de estudio y método de muestreo
Los sitios de muestreo se ubicaron en las zonas norte, centro y sur de los bosques templados del estado de Chihuahua, México, en los municipios de Madera, Creel y Guadalupe y Calvo, respectivamente (Fig. 1; Tabla 1). En cada población se recolectaron hojas (acículas) de 10 árboles adultos de cada especie. El método de muestreo fue de transecto, donde se seleccionó un individuo aproximadamente a cada kilómetro de distancia. Los transectos se realizaron para cada especie por separado. Se muestrearon poblaciones densas y dominadas por la especie de interés; sin embargo, en la mayoría de los sitios de muestreo había individuos de ambas especies. Se seleccionaron individuos sanos y de fuste recto. Las características ambientales de las zonas de recolecta se muestran en la tabla 2. El tamaño de muestra tomado se basó en los criterios propuestos por Rodríguez-Peña et al. (2018) quienes sugieren que el procedimiento de AFLP es muy útil para realizar estudios de estructuras genéticas, pues es posible economizar utilizando muestras relativamente pequeñas. Por su parte, Nei (1978) indica que es posible estimar heterocigosidad promedio y distancia genética con cualquier tamaño de muestra, siempre y cuando se considere un alto número de loci; por lo que en este estudio se analizaron 1303 y 1343 bandas para P. arizonica y P. durangensis, respectivamente.
Figura 1 Localización geográfica de tres poblaciones de Pinus arizonica y P. durangensis en el estado de Chihuahua, México.
Tabla 1 Ubicación geográfica de los sitios de recolecta de tres poblaciones de Pinus arizonica y P. durangensis en el estado de Chihuahua, México.
| ID | P. arizonica | P. durangensis | ID | P. arizonica | P. durangensis | ||||
| Latitud | Longitud | Latitud | Longitud | Latitud | Longitud | Latitud | Longitud | ||
| P1-Norte | 29.7919 | -108.2606 | 29.7319 | -108.1704 | P6-Centro | 28.1903 | -107.5994 | 28.2119 | -107.6098 |
| P2-Norte | 29.8138 | -108.2659 | 29.7638 | -108.1706 | P7-Centro | 28.2208 | -107.5979 | 28.2467 | -107.6095 |
| P3-Norte | 29.8303 | -108.2503 | 29.7903 | -108.1704 | P8-Centro | 28.2492 | -107.5970 | 28.2706 | -107.6152 |
| P4-Norte | 29.8512 | -108.2679 | 29.8212 | -108.1711 | P9-Centro | 28.2782 | -107.5970 | 28.2978 | -107.6094 |
| P5-Norte | 29.8786 | -108.2674 | 29.8546 | -108.1696 | P10-Centro | 28.3083 | -107.5970 | 28.3076 | -107.6194 |
| P6-Norte | 29.9059 | -108.2674 | 29.8839 | -108.1695 | P1-Sur | 25.9549 | -107.0472 | 26.0402 | -107.0192 |
| P7-Norte | 29.9338 | -108.2683 | 29.9138 | -108.1697 | P2-Sur | 25.9849 | -107.0475 | 26.0732 | -107.0197 |
| P8-Norte | 29.9598 | -108.2682 | 29.9428 | -108.1688 | P3-Sur | 26.0223 | -107.0477 | 26.1093 | -107.0186 |
| P9-Norte | 29.9718 | -108.2582 | 29.9718 | -108.1686 | P4-Sur | 26.0559 | -107.0472 | 26.1399 | -107.0186 |
| P10-Norte | 29.9868 | -108.2672 | 29.9968 | -108.1646 | P5-Sur | 26.0919 | -107.0464 | 26.1719 | -107.0175 |
| P1-Centro | 28.0290 | -107.5999 | 28.0562 | -107.6089 | P6-Sur | 26.1316 | -107.0470 | 26.2016 | -107.0163 |
| P2-Centro | 28.0629 | -107.5993 | 28.0857 | -107.6094 | P7-Sur | 26.1614 | -107.0474 | 26.2314 | -107.0158 |
| P3-Centro | 28.0990 | -107.5985 | 28.1161 | -107.6094 | P8-Sur | 26.1934 | -107.0469 | 26.2634 | -107.0157 |
| P4-Centro | 28.1290 | -107.5979 | 28.1460 | -107.6094 | P9-Sur | 26.2217 | -107.0473 | 26.2917 | -107.0155 |
| P5-Centro | 28.1580 | -107.5995 | 28.1806 | -107.6095 | P10-Sur | 26.2557 | -107.0463 | 26.3257 | -107.0156 |
Tabla 2 Características ambientales de los sitios de recolecta de tres poblaciones de Pinus arizonica y P. durangensis en el estado de Chihuahua, México.
| Población | Localidad | Municipio | Altitud (msnm) | PPT (mm) | TMA (°C) |
| Norte | Ejido El Largo | Madera | 2324 | 625 | 12.3 |
| Centro | Ejido San Juanito | Creel | 2453 | 805 | 11.4 |
| Sur | Mohinora | Guadalupe y Calvo | 3308 | 1080 | 14.4 |
PPT = precipitación media anual, TMA = temperatura media anual. Fuente: bases de datos CLIMATE-DATA.ORG (2019) y elaboración propia con datos recolectados en campo.
Las muestras de acículas se colocaron en bolsas de plástico e identificaron con la especie, el número del individuo y las coordenadas donde se recolectaron. Posteriormente, se transportaron en hieleras al laboratorio de Genética Molecular del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (Cinvestav), Unidad Irapuato, Guanajuato.
Extracción y análisis de ADN
Para la obtención de ADN se utilizaron de dos a tres acículas (hojas) por árbol. Se utilizó el kit Qiagen DNeasy® 96 Plant Kit (QIAGEN Inc). El material se molió en mortero, desinfectado con etanol a 70% entre cada muestra. El material molido se colocó en tubos de microcentrífuga de 2-mL, junto con una esfera de metal de 5 mm (Qiagen Stainless Steel Beads). Posteriormente, las muestras fueron liofilizadas y remolidas en un TissueLyser II (Quiagen Inc.), con dos ciclos de 30 s por 30 Hz. Las muestras molidas y liofilizadas fueron utilizadas para la extracción del ADN. Una vez realizada la extracción, el total de ADN genómico se cuantificó en un NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific) y se ajustó a una concentración de 50 ng µL-1 con agua desionizada.
El análisis AFLP se realizó utilizando el Kit IRDye® Fluorescent AFLP® Kit for Large Plant Genome Analysis (LI-COR Bioscences). Se comenzó con la digestión de 2 µL de ADN diluido por medio de las enzimas de restricción EcoRI y MseI. Posteriormente, los fragmentos de ADN digeridos fueron ligados con adaptadores para EcoRI y MseI. Después, se adhirió un nucleótido extra a los primers (EcoRI + A y MseI + C) para realizar la pre-amplificación. La amplificación selectiva se llevó a cabo mediante cuatro combinaciones de cebadores marcados con fluorescencia: MseI + CTC - EcoRI + ACA, MseI + CAG - EcoRI + ACT, MseI + CTA - EcoRI + AGA, MseI + CTG - EcoRI+AGC. La reacción en cadena de la polimerasa se realizó en un termo ciclador (Verity Applied Biosystems 2720), con el siguiente programa: un ciclo de 94 °C por 30 s, 65 °C por 30 s, 72 °C por 1 min; 12 ciclos de 94 °C por 30 s, 65 °C por 30 s, 72 °C por 1 min; y 23 ciclos de 94 °C por 30 s, 56 °C por 30 s, 72 °C por 1 min. Los productos de la ampli-ficación selectiva (2 µL) se mezclaron con 8 µL de formamida y 1 µL de marcador Eco 700 GeneScan (Applied Biosystems). Finalmente, la separación y detección de fragmentos se realizó por medio de un secuenciador Genetic Analyzer 3730xl (Applied Biosystems).
Análisis de la diversidad genética
Los electroferogramas obtenidos fueron organizados en una matriz binaria de presencia (1) o ausencia (0) de bandas para realizar el análisis en el software Geneiuos versión R10. El sofware GenAIEx versión 6 (Peakall y Smouse, 2006) fue utilizado para obtener los estadísticos de diversidad, porcentaje de loci polimórficos, promedio de alelos por locus, número de alelos efectivos, índice de información de Shannon (I) y heterocigosis esperada (He). Estos índices fueron estimados con base en el supuesto de que cada locus representa un par de alelos, cuando en una banda se encuentra presencia y ausencia de un fragmento AFLP. La heterocigosis esperada se estimó mediante el enfoque de Lynch y Milligan (1994), quienes utilizan el índice de diversidad de Nei como el valor de heterocigosis esperada (Nei, 1978). Los estadísticos de diversidad para cada población se compararon mediante la prueba Wilcoxon con corrección Bonferroni (α=0.05).
Análisis de la estructura genética
La estructura genética de las poblaciones se infirió con base en el algoritmo de agrupamiento con un modelo Bayesiano, mediante el software STRUCTURE versión 2.3.4 (Pritchard, Stephens y Donnelly, 2000; Falush, Stephens y Pritchard, 2007). El programa STRUCTURE se corrió 30 veces para cada K número de conglomerados genéticos y se analizó desde K=1 hasta k=10. En cada corrida se efectuaron 10 000 repeticiones de cadena de Markov-Monte Carlo (CMMC) y 100 000 periodos de rodaje (burn-in periods). Este análisis se llevó a cabo por medio de un modelo de mezcla y frecuencia de alelos correlacionados. Se consideró como número óptimo de k grupos al que obtuvo el valor mayor de la probabilidad posterior promedio (log likelihood) y de ΔK, de acuerdo con los criterios propuestos por Evanno, Regnaut y Goudet (2005). Los valores de la probabilidad posterior promedio y ΔK se obtuvieron a través del sitio web Structure Harvester (Earl y Von-Holdt, 2012). Por último, se realizó un análisis de varianza molecular (AMOVA; Excoffier, Smouse y Quattro. 1992), donde se comparó entre poblaciones y entre los grupos conformados en el análisis STRUCTURE. Este análisis se llevó a cabo empleando el software Info-Gen (Balzarini y Di Rienzo, 2004). El índice de flujo genético se estimó con la fórmula Nm= [0.25 (1-ΦST)/(ΦST)] (Whitlock y Mccauley, 1999) utilizando los estadísticos F (ΦST) obtenidos del AMOVA. Para detector posibles barreras eco geográficas que afecten el flujo genético entre poblaciones, los datos fueron analizados mediante el algoritmo de Monmonier, con ayuda de software Barrier versión 2.2 (Manni, Guérard y Heyer, 2004). Los valores de Bootstrap de cada barrera fueron calculados con 100 matrices de distancias genéticas Dice. Todos los análisis fueron realizados para cada especie por separado.
Identificación de híbridos
La identificación de híbridos de P. arizonica y P. durangensis se realizó con base en el algoritmo de agrupamiento Bayesiano, en software STUCTURE versión 2.3.4 (Pritchard et al., 2000; Falush et al., 2007). Para ello se analizaron los individuos de ambas especies en conjunto, para cada población por separado (norte, centro y sur). El análisis de hibridación se realizó con los datos obtenidos del análisis AFLP y se estableció k=2 como el número de grupos. En cada corrida se efectuaron 10 000 repeticiones de cadena de Markov-Monte Carlo (CMMC) y 100,000 periodos de rodaje (burn-in periods). Los individuos con una probabilidad menor del 95% de pertenecer a la especie en la que fueron clasificados, se identificaron como híbridos. Por ejemplo, un árbol de P. arizonica con 0.06 (6%) de probabilidad de pertenecer a P. durangensis sería identificado como un hibrido. Los individuos con una probabilidad de entre 45 y 55% de pertenecer a la otra especie fueron identificados como híbridos de primera generación (F1). Este criterio se estableció con base en la investigación realizada por Ávila-Flores et al. (2016), quienes lo utilizaron para identificar híbridos de P. engelmannii con P. arizonica y P. durangensis.
Resultados
Diversidad genética
El análisis AFLP generó 1303 y 1343 bandas para P. arizonica y P. durangensis, respectivamente. En ambas especies, las tres poblaciones (norte, centro y sur) presentaron diferencias significativas (p < 0.05) en los parámetros de diversidad evaluados. En general, las poblaciones de P. arizonica y P. durangensis del centro del estado presentaron mayor diversidad (Tabla 2).
Estructura genética
En P. arizonica, el análisis de estructura genética (STRUCTURE) determinó k= 2 como el número apropiado de grupos, ya que obtuvo el valor más alto de probabilidad posterior promedio y ΔK. La mayoría de los árboles de la población norte quedaron integrados en el grupo I y todos los de la población sur en el grupo II. Los árboles de la población Centro quedaron divididos en ambos grupos; 70% quedo integrado en el Grupo I y 30% en el Grupo II (Fig. 2A). El análisis de barreras genéticas (BARRIER) reveló la existencia de una discontinuidad genética (Bootstrap = 68%) entre las poblaciones de P. arizonica estudiadas. Esta barrera divide a las poblaciones del norte y centro de la sur, lo cual coincide con la zona de las Barrancas (Fig. 2B).
A)Análisis STRUCTURE con k= 2 realizado con base en 1334 fragmentos AFLP. Cada color representa la proporción de la probabilidad de pertenecer a cada grupo. B) Estructura en contexto geográfico, donde el área de las gráficas circulares representa el porcentaje de árboles de cada grupo. La barra amarilla representa una barrera en el flujo genético y el número es el valor de Bootstrap (1000 remuestreos), identificados mediante análisis BARRIER. El mapa fue generado con el modelo digital de elevación esc.: 1:50000, con un tamaño de celda de 30x30 m (Instituto Nacional de Estadística y Geografía [Inegi] 2019).
Figura 2 Estructura genética dentro y entre tres poblaciones de Pinus arizonica en el estado de Chihuahua, México.
El AMOVA determinó que existen diferencias significativas (p < 0.01) entre las tres poblaciones de P arizonica. No obstante, este análisis reveló que las diferencias moleculares entre poblaciones son débiles, ya que solamente explicaron 7.2% de la variación total. En contraste, la variación dentro de las poblaciones explicó 92.8% (Tabla 3). De acuerdo con el AMOVA, los grupos formados por el análisis STRUCTURE también fueron diferentes entre sí (p = 0.0001); sin embargo, este agrupamiento solamente explicó 7.6% de la variación total.
Tabla 3 Análisis molecular de varianza (AMOVA) entre tres poblaciones de Pinus arizonica y entre grupos formados por análisis STRUCTURE, calculado con 1334 fragmentos AFLP.
| Fuente de variación | GL | SC | CV | PV | P | ΦST | Nm |
| AMOVA general | |||||||
| Entre poblaciones | 2 | 938317.33 | 20429.82 | 7.16 | <0.0001 | 0.07 | 3.24 |
| Dentro de poblaciones | 27 | 7151233.6 | 264860.5 | 92.84 | 0.0001 | ||
| AMOVA norte vs centro | |||||||
| Entre poblaciones | 1 | 441055.2 | 5.55 | 3.03 | 0.0006 | 0.05 | 4.25 |
| Dentro de poblaciones | 18 | 5000904 | 94.45 | 96.97 | 0.0011 | ||
| AMOVA norte vs sur | |||||||
| Entre poblaciones | 1 | 544479.2 | 28150.88 | 9.67 | 0.0003 | 0.09 | 2.33 |
| Dentro de poblaciones | 18 | 4733467.2 | 262970.4 | 90.33 | 0.0005 | ||
| AMOVA centro vs sur | |||||||
| Entre poblaciones | 1 | 421941.6 | 16815.85 | 6.21 | 0.0084 | 0.06 | 3.77 |
| Dentro de poblaciones | 18 | 4568096 | 253783.11 | 93.79 | 0.0089 | ||
| AMOVA grupos estructura K=2 | |||||||
| Entre grupos | 1 | 591769.95 | 22279.71 | 7.57 | 0.0001 | 0.07 | 3.05 |
| Dentro de grupos | 27 | 7348626.46 | 272171.35 | 92.43 | <0.0001 | ||
GL= grados de libertad, SC= suma de cuadrados, CV= componente de variación, PV= porcentaje de variación, P= nivel de significancia, ΦST = estimador de la diferencia genética promedio con 10,000 permutaciones, Nm= índice de flujo genético (Whitlock y Mccauley, 1999).
El índice de flujo genético (Nm) total entre las tres poblaciones fue de 3.24. Sin embargo, al comparar entre poblaciones, se encontró que el flujo genético más alto se presentó entre las poblaciones norte y centro (Nm = 4.25). Además, el flujo genético entre las poblaciones centro y sur fue de 3.77, mientras que entre las poblaciones norte y sur se presentó el menor flujo genético, 2.33 (Tabla 3).
Los resultados obtenidos en P. durangensis fueron similares a los encontrados para P. arizonica. El análisis de estructura genética dividió a los árboles analizados en dos grupos genéticos (k = 2). Todos los árboles de la población norte fueron integrados en el grupo I y los de la población sur en el grupo II. Los árboles de la población centro quedaron divididos en ambos grupos, 70% en el Grupo I y 30% en el Grupo II (Fig. 3A). Así mismo, el análisis de barreras genéticas sugiere que existe un cuello de botella en el flujo genético (Bootstrap = 83%) entre la población sur y las poblaciones centro y norte (Fig. 3B). Al igual que en P. arizonica, la barrera genética identificada coincide con la zona de las Barrancas.
A)Análisis STRUCTURE con k= 2 realizado con base en 1343 fragmentos AFLP, donde los colores representan la proporción de la probabilidad de pertenecer a cada grupo. B) Localización geográfica de cada población, el área de las gráficas circulares representa el porcentaje de árboles pertenecientes a cada grupo. La barra amarilla representa una barrera en el flujo genético y el número es el valor de Bootstrap (1000 remuestreos), identificados mediante análisis BARRIER. El mapa fue generado con el modelo digital de elevación esc.: 1:50000, con un tamaño de celda de 30x30 m (Instituto Nacional de Estadística y Geografía [Inegi] 2019).
Figura 3 Estructura genética de tres poblaciones de Pinus durangensis en el estado de Chihuahua, México.
Con base en el AMOVA, en P. durangensis las poblaciones norte y centro no presentaron diferencias significativas (p > 0.05) entre sí. Sin embargo, la población sur si presentó diferencias genéticas significativas (p < 0.05) con las poblaciones norte y centro. No obstante, las diferencias entre poblaciones solamente explicaron 5.9% de la variación total (Tabla 4). Los grupos conformados por el análisis STRUCTURE presentaron diferencias significativas (p = 0.0022) entre sí y este agrupamiento explicó 8.49% de la variación total. Las poblaciones norte y centro presentaron un alto índice de flujo genético (Nm= 6.87), en comparación con el encontrado entre la población sur con las poblaciones norte (3.0) y centro (3.03), respectivamente (Tabla 4).
Tabla 4 Análisis molecular de varianza (AMOVA) entre tres poblaciones de Pinus durangensis y entre grupos formados por análisis STRUCTURE, calculado con 1343 fragmentos AFLP.
| Fuente de variación | GL | SC | CV | PV | P | ΦST | Nm |
| AMOVA general | |||||||
| Entre poblaciones | 2 | 884848.53 | 17290.5 | 5.90 | 0.0079 | 0.06 | 3.98 |
| Dentro de poblaciones | 27 | 7443750.4 | 275694.46 | 94.10 | 0.0084 | ||
| AMOVA norte vs centro | |||||||
| Entre poblaciones | 1 | 415338.4 | 11076.39 | 3.51 | 0.0595 | 0.03 | 6.87 |
| Dentro de poblaciones | 18 | 5482340.8 | 304574.49 | 96.49 | 0.0579 | ||
| AMOVA norte vs sur | |||||||
| Entre poblaciones | 1 | 475940.2 | 22116.25 | 7.67 | 0.0080 | 0.07 | 3.00 |
| Dentro de poblaciones | 18 | 4795520.4 | 266417.8 | 92.33 | 0.0062 | ||
| AMOVA centro vs sur | |||||||
| Entre poblaciones | 1 | 722222.25 | 20477.27 | 7.60 | 0.0450 | 0.07 | 3.03 |
| Dentro de poblaciones | 18 | 4481964.8 | 248998.04 | 92.40 | 0.0402 | ||
| AMOVA grupos estructura K=2 | |||||||
| Entre poblaciones | 1 | 678944.31 | 26322.55 | 8.49 | 0.0022 | 0.08 | 2.80 |
| Dentro de poblaciones | 27 | 7688429.82 | 283756.66 | 91.51 | 0.0023 | ||
GL= grados de libertad, SC = suma de cuadrados, CV = componente de variación, PV = porcentaje de variación, P = nivel de significancia, ΦST = estimador de la diferencia genética promedio con 10,000 permutaciones, Nm = índice de flujo genético (Whitlock y Mccauley, 1999).
Hibridación
El análisis STRUCTURE sugiere que existen híbridos ancestrales de P. durangensis x P. arizonica y P. arizonica x P. durangensis (Fig. 4). Veintitrés de cada cien árboles de P. durangensis analizados presentaron una introgresión genética de P. arizonica, mientras que solamente en 16% de los árboles de P. arizonica se encontró una introgresión genética de P. durangensis. Además, los resultados sugieren que la hibridación entre estas especies se ha dado en todo el macizo forestal del estado de Chihuahua (Fig. 4). La mitad de los híbridos fueron encontrados en la población norte, 33% en el centro y solamente 16% en la sur. No obstante, no se identificaron híbridos de primera generación (F1) entre los árboles muestreados.
Discusión
El análisis AFLP produjo 1445 bandas, de las cuales una alta proporción de loci fueron polimórficos. Pinus arizonica y P. durangensis presentaron 74.9 y 76.0% de loci polimórficos, respectivamente. Estos resultados son mayores a los detectados en otras especies de pinos, al usar marcadores AFLP. Por ejemplo, Xu, Tauer y Nelson (2008) encontraron 65% y 46% de loci polimórficos en P. echinata Mill y P. taeda L., respectivamente. Así mismo, Rawat, Barthwal y Ginwal (2014) encontraron 36% de loci polimórficos en P. roxburghi Sargent. Lo anterior confirma que existe amplia diversidad genética en las poblaciones de P. arizonica y P. durangensis del macizo forestal en la Sierra Madre Occidental del estado de Chihuahua.
El índice de Shannon (I) total obtenido para P. arizonica y P. durangensis fue similar al obtenido para otras especies de pinos; por ejemplo, Androsiuk, Ciaglo-Androsiuk y Urbaniak (2015) encontraron un I de 0.35 en 20 poblaciones de P. sylvestris L. distribuidas en 12 países europeos. Así mismo, Di y Wang (2013) evaluaron la diversidad de 20 poblaciones de P. tabulaeformis Carr. en todo China, mediante marcadores AFLP y encontraron un I de 0.35. Dada la amplia distribución de las poblaciones analizadas en los estudios antes mencionados, se puede considerar que la diversidad genética encontrada en este estudio fue alta para ambas especies (I= 0.37).
El nivel de heterocigosis encontrado para P. arizonica y P.durangensis (He= 0.24) puede considerarse como medio si se comparan con lo encontrado en investigaciones previas con AFLP. Xu et al. (2008) registraron valores de heterocigosis esperada desde 0.08 hasta 0.17 en P. echinata Mill y P. taeda. En contraste, Kim et al. (2011) obtuvieron 0.35 de heterocigosis esperada en P. montícola Dougl. Si se toma como base este intervalo, se podría sugerir que, tanto P. arizonica como P. durangensis, presentan una heterocigosis moderada en el estado de Chihuahua.
En las dos especies estudiadas las poblaciones del centro del estado presentaron valores más altos en todos los parámetros de diversidad evaluados (porcentaje de loci polimórficos, promedio de alelos por locus número de alelos por locus, índice de información de Shannon y heterocigosis esperada). Estos resultados sugieren que existe un mayor nivel de diversidad genética en las poblaciones de P. arizonica y P. durangensis del centro de Chihuahua, en comparación con el norte y el sur.
Los resultados del análisis de estructura genética revelaron que existen dos grupos genéticos en ambas especies, los cuales fueron significativamente diferentes (p<0.05) de acuerdo con el AMOVA. Un grupo genético se encuentra en el norte y otro en el sur del estado, mientras que en el centro habitan individuos de ambos grupos. Este comportamiento podría ser la causa de la mayor diversidad genética en el centro del Estado, a través de la convergencia y cruzamiento de ambos grupos. No obstante, las poblaciones de ambas especies presentaron diferenciación genética entre sí. Este resultado sugiere que en cada población existen alelos particulares que no se encuentran en las demás poblaciones. Estos resultados concuerdan con Friedrich et al. (2018) y Hernández-Velasco et al. (2016), quienes encontraron diferencias genéticas entre poblaciones de P. arizonica y P. durangensis en el estado de Durango y recomiendan utilizar genotipos locales para evitar la pérdida de las estructuras genéticas locales. Esto debido a que al utilizar genotipos locales se asegura que son materiales adaptados y se incrementa la probabilidad de éxito en programas de reforestación (Mijnsbrugge, Bischoff y Smith, 2010).
A pesar de que el AMOVA reveló diferencias entre las tres poblaciones de ambas especies, la variación entre poblaciones explicó un porcentaje bajo de la variación total (entre 3.03 y 9.60%). Este resultado es consistente con diversas investigaciones realizadas en pinos, donde han encontrado que la mayor parte de la variación total se encuentre dentro de poblaciones y la variación entre poblaciones represente solamente una pequeña proporción. Un ejemplo de lo anterior es lo señalado en P. oocarpa Schiede ex Schltdl., donde se encontró que las diferencias entre poblaciones solamente explicaron 3.6 y 0.95% de la variación global con marcadores RAPDS y AFLP, respectivamente (Díaz, Muniz y Ferrer, 2001). Otro ejemplo es lo mencionado por Androsiuk et al. (2015), quienes encontraron que la variación entre poblaciones de P. sylvestris L. representó 5.3% de la variación total. En pinos es común que la variación entre poblaciones explique menos de 10% de la variación global y pocas especies exhiben una mayor diferenciación entre poblaciones (Ledig, 1998; Sorensen, Mandel y Aagaard, 2001). La homoplasia de diversos caracteres dentro del género Pinus ha llevado a que la baja diferenciación entre poblaciones sea atribuida al fenómeno de la hibridación (Willyard, Cronn y Liston, 2009). Por otro lado, la baja diferenciación genética entre poblaciones de especies de pinos puede atribuirse al alto flujo genético que se da en este género. Los pinos se caracterizan por poseer un eficiente mecanismo de reproducción, mediante la dispersión de polen a través del viento (Parker, Hamrick, Parker y Nason, 2001). Investigaciones previas han documentado que el polen de los pinos puede dispersarse a grandes distancias de la fuente de origen y ser aún viable. Respecto a esto, Williams (2010) encontró que P. taeda puede dispersarse vía polen al menos 41 km de la fuente. Robledo‐Arnuncio (2011) señaló que el polen de P. sylvestris puede viajar hasta 100 km de su población de origen. Varis, Pakkanen, Galofré y Pulkkinen (2009) detectaron granos de polen viables a más de 600 km de la fuente en P. sylvestris. En este sentido, la dispersión del polen de pinos puede generar intercambio genético entre poblaciones distantes y ser la principal causa de la baja diferenciación genética entre poblaciones.
El alto flujo genético, común en especies de pinos, concuerda con lo encontrado en este estudio para las poblaciones de ambas especies. P. arizonica presentó un flujo genético entre 2.3 y 4.25, mientras que en P. durangensis se encontraron valores del índice de flujo genético de 3.0 a 6.8. El flujo genético entre las poblaciones de las dos especies puede ser considerado como alto, en comparación con el encontrado en otras especies de Pinus. Por ejemplo, Di y Wang (2013) mencionaron un flujo genético de 0.57 entre poblaciones de P. tabulaeformis. Por su parte, Xue, Wang, Korpelainen y Li (2005) obtuvieron un índice de flujo genético de 0.96 en poblaciones de Picea asperata Mast.
En ambas especies el flujo genético entre la población sur y las demás poblaciones fue considerablemente menor, en comparación con el flujo genético entre las poblaciones norte y centro. Este resultado concuerda con el análisis BARRIER, que identificó una discontinuidad en el flujo genético entre la población sur y las poblaciones norte y centro en las dos especies de pinos analizadas. Esta discontinuidad puede haber influido en la diferenciación de los grupos genéticos que se encontraron en este estudio, tanto para P. arizonica como para P. durangensis. Además, la discontinuidad genética encontrada concuerda con la zona de las Barrancas. Esta zona presenta una altitud menor de 1,000 m s.n.m., en la que no habitan P. arizonica y P. durangensis. Esta zona podría ser una barrera geográfica ante el flujo genético y haber influido en la diferenciación genética dentro de estas especies. Este resultado concuerda con investigaciones previas, como la realizada por Yang, Liu, Li y Dyer (2015), quienes encontraron que barreras geográficas como sistemas montañosos y valles o ríos, han actuado como cuellos de botella ante el intercambio genético entre poblaciones de P. henryi Mast. y P. tabuliformis Carr. Así mismo, Wang, Mao, Zhao y Wang (2013) señalaron que factores geográficos y climáticos han sido causa importante de la diferenciación genética entre poblaciones de P. yunnanensis L. A pesar de que existe un cuello de botella en el flujo genético entre la población del sur y las otras poblaciones, el intercambio genético fue alto. Lo anterior puede deberse a la alta capacidad de dispersión que posee el polen de los pinos (Williams, 2010; Robledo‐ Arnuncio, 2011).
Los resultados del análisis STRUCTURE sugieren que P. durangensis y P. arizonica pueden hibridar. Willyard et al. (2009) encontraron una posible introgresión ancestral de P. durangensis y P. arizonica con P. montezumae Lamb. Por otro lado, Ávila-Flores et al. (2016) encontraron que la hibridación de P. engelmannii con P. arizonica o P. durangensis es muy común en rodales semilleros del estado de Durango.
En este sentido, si P. durangensis y P. arizonica pueden hibridar con P. montezumae y P. engelmannii, resulta lógico que puedan hibridar entre sí.
El análisis STUCTURE encontró un alto porcentaje de individuos híbridos (39%) entre las dos especies. Este resultado concuerda con diversas investigaciones realizadas en especies de Pinus, donde se ha encontrado que es común la hibridación dentro de este género. Un ejemplo de esto es la investigación realizada por Ávila-Flores et al. (2016); ellos estudiaron rodales semilleros en Durango y encontraron que 58% de 280 árboles de P. engelmannii presentaron una introgresión genética de P. arizonica o P. durangensis; es decir, que provienen de ancestros híbridos. Además, estos investigadores encontraron ocho híbridos de primera generación (F1) de P. engelmannii x P. arizonica; sin embargo, no detectaron híbridos F1 de P. engelmannii x P. durangensis. Por otro lado, la capacidad de hibridación de P. arizonica fue estudiada también por Peloquin (1984), quien encontró que P. arizonica puede hibridar con P. engelmannii y P. ponderosa.
De acuerdo con los resultados de diversas investigaciones, la hibridación dentro del complejo Ponderosae, al que pertenecen P. arizonica y P. durangensis, es común (Delgado et al., 2007; Epperson, Telewski Willyard, 2009; Willyard, Cronn y Liston, 2009; Ávila-Flores et al., 2016). Esto posiblemente se debe a que Ponderosae es una sección joven que divergió hace alrededor de 15 millones de años, a pesar de que Pinus se originó hace alrededor de 100 millones (Willyard, Syring, Gernandt, Liston y Cronn, 2007). Las especies de divergencia reciente pueden hibridar en algunos casos debido a que sus genomas aún son muy parecidos y, por lo tanto, compatibles (Mallet, 2005).
La hibridación entre P. arizonica y P. durangensis puede explicar parcialmente la amplia diversidad genética que existe dentro de ambas especies, así como la baja diferenciación entre sus poblaciones. Debido a que la hibridación puede generar nuevas estructuras genéticas y aumentar la diversidad, hace más difícil detectar patrones de diferenciación genética entre poblaciones (Willyard et al., 2009).
Conclusiones
Existe alta diversidad genética dentro de las poblaciones de P. arizonica y P. durangensis del estado de Chihuahua. Las poblaciones norte, centro y sur del Estado de ambas especies presentan estructuras genéticas diferentes; es decir, poseen regiones genómicas exclusivas de cada región geográfica. Además, existen zonas de hibridación bidireccional entre P. durangensis y P. arizonica a lo largo del macizo forestal del estado de Chihuahua. Lo anterior, debe ser considerado al seleccionar áreas o árboles semilleros.
