Introducción

En México, las zonas forestales han incrementado su vulnerabilidad a incendios y plagas que destruyen en promedio 270 000 ha anuales, lo que incide en la extinción local de numerosas especies (^{Segura-Warnholtz, 2014}), también se han registrado insectos que dañan severamente plántulas en viveros forestales del centro de México (^{Marín-Cruz et al., 2015}). Las principales plagas y enfermedades atendidas a escala nacional por su superficie afectada son: muérdago y plantas parásitas (36 786 ha), descortezadores (18 116 ha), defoliadores (15 0036 ha) y enfermedades en menor superficie (^{Comisión Nacional Forestal [Conafor], 2016}).

Dentro de los insectos defoliadores, se encuentra la mosca sierra que pertenece a la familia Diprionidae. Esta es considerada de alta importancia económica forestal, ya que se alimenta del follaje de la vegetación de la familia Pinacea y, dependiendo del nivel de infestación del arbolado, puede llegar a causar la muerte (^{Sánchez, Alanís, Cano y Olivo, 2012}). La mosca sierra ha adquirido importancia como plaga ya que en los últimos años la Conafor ha atendido daños ocasionados a especies del genero Pinus, debido al ataque de insectos de los géneros Zadiprion y Neodiprion (^{Gaona et al., 2014}).

Para controlar el ataque de la mosca sierra en el ejido los Bancos del municipio de Pueblo Nuevo Durango, se han realizado aplicaciones químicas en 15 ha. Desde el punto de vista ecológico, los insecticidas químicos son substancias tóxicas que afectan a los componentes del ecosistema y la intensidad del efecto varía según las características del insecticida, el grado de susceptibilidad de las especies, la forma en que se aplica, la formulación y dosificación del producto (^{Badii y Abreu, 2006}). Sin embargo, existen métodos alternativos para el control de plagas que se han evaluado en laboratorio y en campo, tales como: controladores biológicos (depredadores), hongos entomopatógenos y extractos naturales de plantas (^{Amariles-Barrera, García-Pajón y Parra-Henao, 2013}); también, se han realizado aspersiones de Bauveria bassiana (^{Aguilar, 2016}); esta última requiere ser evaluada para conocer el modo de acción sobre la larva del defoliador.

Los extractos vegetales son mezclas complejas de metabolitos secundarios, aislados de las plantas (^{García, Martínez, Ortega y Castro, 2010}), los cuales se usan para minimizar la aplicación de plaguicidas convencionales (químico-sintéticos), estos ocasionan efectos adversos medioambientales, económicos y a la salud humana (^{Cardozo y Jiménez, 2014}; ^{Pino y Lazo, 2010}). Actualmente, existen alrededor de 1000 plantas que son utilizadas como bioinsecticidas (^{Sabilón y Bustamante, 1995}).

En México el género Datura cuenta con 14 especies (^{Luna. Cavazos y Bye, 2011}), de ellas Datura stramonium (toloache) es la más tóxica y se ha utilizado para elaborar fungicidas e insecticidas. Se ha probado su efectividad sobre Fusarium oxysporum asparagi y Stemphylium vesicarium (^{Rodríguez y Chico, 2012}). El toloache ha sido efectivo en el control de plagas del algodón en Perú y en México (^{Fuertes et al., 2010}), contra el agente causal de la falsa cenicilla de Ramularia cercosporelloides (cártamo; ^{Quintana-Obregón et al., 2010}); además se considera que causa 79% de mortalidad de ninfas y adultos del psílido asiático, el cual afecta a los cítricos de la parte sur de México (^{Sandoval-Reyes, Arriaga-Gaona, Hernández, Hernández-Romero y Guzmán-González, 2013}). Por otra parte, es importante reconocer que en plagas forestales se carece de registros sobre resultados del uso de Datura stramonium, como insecticida orgánico.

Objetivos

Analizar los extractos metanólicos, obtenidos de las diferentes estructuras de la planta de Datura stramonium (hoja, tallo y raíz), para realizar evaluaciones de toxicidad sobre larvas del cuarto y quinto instar del defoliador del pino Neodiprion autumnalis, con el fin de verificar su efectividad como posible biocontrolador.

Materiales y métodos

Se colectaron 25 plantas de Datura stramonium de una altura promedio de 1 m, ubicadas en el noreste de la ciudad de Durango, México. Posteriormente, se realizó una separación por estructura vegetal (hoja, tallo y raíz), las estructuras se almacenaron durante una semana para su secado a la sombra, con la finalidad de no mermar el contenido de alcaloides por su fotosensibilidad (^{Bermejo, Pereira, Cintra y Morales, 2014}). Una vez obtenidas las muestras secas de cada estructura, fueron procesadas en un molino de cuchillos (Thomas-Wiley Miller) hasta pasar por una malla de 2 mm.

A través de métodos de maceración e hidrodestilación, se obtuvo el extracto vegetal (^{Taborda, Sánchez, Bonilla y Huertas, 2014}). Para la preparación de los extractos se colocaron 500 mL de metanol con 250 g (relación líquido sólido 2:1) de materia seca de cada estructura de la planta y se dejó reposar por 24 h aproximadamente. Después los macerados se centrifugaron (Centrifugue 5810 R) por 5 min a 3500 min^-1 (rpm) y se recuperaron los sobrenadantes, que constituyen los extractos crudos. Enseguida, los sobrenadantes se concentraron por separado a sequedad en un rotoevaporador digital. De este procedimiento se extrajeron líquidos viscosos, los cuales se alcalinizaron con hidróxido de amonio (NH₄OH) y cada muestra se extrajo con 250 mL de cloroformo. Los alcaloides se obtuvieron de la solución de cloroformo con ácido sulfúrico (H₂SO₄) 1N, en forma fraccionada. Una vez obtenidos los extractos crudos, estos se concentraron de nuevo a sequedad por rotoevaporación a vacío, los cuales constituyeron los extractos concentrados de alcaloides.

El análisis cualitativo de alcaloides se basó en las pruebas de Mayer, de Dragendorff y de Wagner (^{Enrico, 2006}). Estas técnicas se realizaron directamente con los extractos crudos de alcaloides resuspendidos en 10 mL de metanol. Se aplicaron, para cada estructura, (hoja, tallo y raíz) cuatro gotas de la solución de alcaloides y se hicieron reaccionar de manera individual con cada reactivo.

Para cuantificar los metabolitos presentes en las muestras del extracto crudo, estas se analizaron mediante un Cromatógrafo de Gases (GC Hewlett-Packard modelo 5890) equipado con una columna capilar HP-1MS (30 m × 0.25 mm, i.d.; 0.25 ím film thickness) acoplado a un espectrómetro de masas. El extracto se cuantificó con base en la curva de calibración realizada previamente en el laboratorio.

Los extractos crudos de cada estructura se diluyeron en agua destilada y metanol a 10%. A partir de esta solución se prepararon concentraciones a 10 mg/L, 30 mg/L y 50 mg/L, las cuales se aplicaron sobre las larvas de cuarto y quinto instar, para después contabilizar el porcentaje de mortalidad de los individuos a las 0 h, 3 h, 6 h, 12 h y 24 h. Paralelamente, se corrió un ensayo de control que fue el testigo a base de agua destilada. Para cada tratamiento se hicieron tres repeticiones, en total se analizaron 60 muestras. Para llevar a cabo la aplicación de los extractos se utilizaron 1550 larvas de Neodiprion autumnalis Smith, las cuales se colectaron en el ejido los Bancos de Pueblo Nuevo, Durango. Se utilizaron 30 insectos por caja (20 cm × 30 cm), las cajas fueron cubiertas con una malla para permitirles la respiración y se mantuvieron a temperatura ambiente; para alimentar a los insectos se les suministraron acículas de Pinus leiophylla.

La aplicación de los extractos se hizo mediante aspersión manual, el volumen asperjado fue de 5 mL por caja, de esta manera se visualizaron los efectos ocasionados a las larvas (mortalidad y/o repelencia). El criterio que se tomó para determinar la muerte de las larvas fue su inmovilidad manifiesta, o la exhibición de movimientos anormales o la ausencia de reacción al someter presión en el dorso (^{Leal, 2011}).

Los datos se evaluaron con el programa estadístico SAS® y los experimentos fueron dispuestos en un esquema de diseño factorial. Los resultados obtenidos de los bioensayos se sometieron a un análisis donde las medias fueron comparadas por la prueba de Tukey a 5% de probabilidad, lo cual permitió observar las diferencias existentes entre los parámetros de cada tratamiento (entre las estructuras de la planta con respecto a las concentraciones, tiempo y a la mortalidad).

Con el propósito de conocer las mejores dosificaciones, se realizaron proyecciones utilizando el software Minitab 17®.

Resultados

La estructura que presentó mayor rendimiento fue la raíz, la cual es la que presenta menor proporción con respecto al tejido y volumen obtenido de las otras estructuras (hoja y tallo), esto se muestra en la Tabla 1.

En la Tabla 2 se muestran los resultados del análisis cualitativo de alcaloides para cada estructura con respecto a los reactivos de diagnóstico utilizados. Se observó que las tres estructuras analizadas poseen una evidencia positiva de alcaloides tropánicos (se observan precipitados que varían entre colores claros, verdes, hasta rojo marrón, dependiendo del reactivo utilizado).

Tabla 2 Características de los extractos crudos concentrados de las diferentes estructuras de Datura. stramonium 

Estructuras	Extractos (mL)	Aspecto	Opalescencia Dragendorff Mayer y Wagner	Turbidez Dragendorff Mayer y Wagner	Precipitado Dragendorff Mayer y Wagner	Evidencia visual
raíz	160	resinoso	+++	+++	+++
tallo	168	resinoso	+++	+++	+++
hoja	170	cristalizado	+++	+++	+++

Reacción positiva:

+++ Alta y clara formación del precipitado, turbidez y opalescencia

++ Media formación del precipitado, turbidez y opalescencia

+ Baja y tenue formación del precipitado, turbidez y opalescencia

En los análisis comatográficos (Fig. 1, 2 y 3), se revela un compuesto mayoritario que eluye a los 17.809 min en las tres estructuras analizadas de la planta, el cual al ser comparado con la biblioteca W10N11, confirma que los compuestos de mayor presencia en la raíz (a), tallo (b) y hoja (c) de Datura stramonium son la atropina y la hiosciamina.

Figura 1 Cromatograma de la estructura de la hoja, de Datura stramonium donde se observa el área bajo la curva de los compuestos. 

Figura 2 Cromatograma de la estructura del tallo, de Datura stramonium donde se observa el área bajo la curva de los compuestos. 

Figura 3 Cromatograma de la estructura de la raíz, de Datura stramonium donde se observa el área bajo la curva de los compuestos. 

Se observa una relación entre los resultados de los análisis de detección de alcaloides por los métodos cualitativo y cuantitativo (Tablas 3 y 4), lo que destaca la utilidad del ensayo cualitativo cuando se desea estudiar el contenido químico de la planta. Al realizar el análisis estadístico, se obtuvo que la mortalidad y la concentración presentan una alta correlación (81%). Por otro lado, se comprobó que a mayor tiempo de exposición se eleva el porcentaje de mortalidad lo que, según ^{Ávalos y Pérez-Urrutia (2009)}, se debe principalmente a que los metabolitos secundarios modifican el olor y el sabor de la planta y comienzan a actuar como inhibidores del apetito de los insectos hasta, finalmente, causar la muerte por inanición.

Como se observa en la Tabla 4, existen diferencias significativas entre las tres estructuras analizadas, con respecto a las concentraciones. Sin embargo, en el testigo no se observaron diferencias, por lo que se puede inferir que cada una de las estructuras de la planta de Datura stramonium cuenta con características similares en su composición química (alcaloides).

La dosis que mostró mayor efectividad fue la concentración de 50 mg/L de raíz, la cual presentó una mortalidad de 23% y por último las concentraciones de 30 mg/L y 10 mg/L, solo generaron mortalidad a 10% y 3% respectivamente; el mayor porcentaje de mortalidad se presentó a partir de las 24 h.

Además, tomando en cuenta las proyecciones realizadas, se observa que el aumentar la concentración no aumenta la mortalidad, considerando que existe una relación inversamente proporcional entre el tiempo de exposición (48 h) y la concentración de 60 mg/L, logrando el 100% de mortalidad para el caso del extracto de raíz (Tabla 5).

La dosis evaluada de la estructura de la hoja presentó una mortalidad de 30% a partir de las 3 h a una concentración de 30 mg/L, lo que fue muy similar a lo encontrado por ^{Kumral, Çobanoğlu y Yalcim (2010)}, ya que sobre la población de ácaros ocasionó 98% de mortalidad; dicho porcentaje difiere debido a la composición físico-química de la estructura de cada insecto. En lo que respecta a la concentración de 50 mg/L, se obtuvo 24% de mortalidad, porcentaje muy bajo la para la concentración aplicada de 10 mg/L con 10% y del testigo con 1%.

En la Tabla 6 se observan las proyecciones que muestran la dosis en intervalos de 50 mg/L a 70 mg/L de extracto de la hoja, la cual aumenta la mortalidad a partir de 60 mg/L, considerando el tiempo de exposición (48 h). Por lo que se requiere aumentar las dosis aplicadas de extractos vegetales, para obtener una mayor mortalidad del defoliador del pino en el cuarto y quinto instar.

En el caso de la estructura de tallo sucede el mismo patrón que en el de la raíz: el porcentaje de mortalidad se da a partir de las 3 h, obteniendo el mejor efecto a partir de las 24 h con 26% de mortalidad de larvas, con la concentración de 50 mg/L. Para la concentración del 30 mg/L se obtuvo 25% de mortalidad muy cercana a la anterior, y a 10 mg/L solo se obtuvo una mortalidad de 14%. En lo que respecta al testigo, las larvas del defoliador no mostraron efecto alguno; además cabe destacar que llegaron al estado de pupa.

Las proyecciones realizadas en los extractos de tallo muestran que la concentración a 190 mg/L logra una alta mortalidad (91%), mientras que al aumentar el tiempo a 48 h a una concentración de 200 mg/L se logra 100% de mortalidad. Vale la pena evaluar si se desea utilizar mayor dosis o mayor tiempo para valorar los resultados en el caso de esta estructura vegetal (Tabla 7).

De manera general, se observa que los extractos vegetales favorecieron el control de larvas del cuarto y quinto instar del defoliador del pino, fueron las tres estructuras analizadas. Sin embargo, la raíz fue la que presentó mejor respuesta, seguida por las hojas y el tallo a partir de 50 mg/L. Por lo que se esperaría que con una mayor concentración de extracto y mayor tiempo de exposición se presentara una mayor mortalidad de larvas del defoliador, lo cual ayudaría a que existiera una baja emergencia de adultos y una menor perdida foliar de los pinos que son afectados por la mosca sierra.

Discusión

La cantidad de extracto metanólico de alcaloides obtenidos, así como los aspectos físicos analizados, muestran que los valores correspondientes a los mililitros de cada extracto crudo, representan una estimación relativa de las cantidades de alcaloides presentes en los diferentes tipos de tejidos analizados. Los principales metabolitos presentes son la atropina, que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, lo que conlleva a tener algunos efectos sobre el sistema nervioso central y, con esto, un aumento de la frecuencia cardiaca, entre otros (^{Zavaleta, 2007}). La hiosciamina provoca desorientación, alucinaciones, sequedad de boca y garganta, visión borrosa, agitación, mareos y arritmias. Por otro lado, se observa la escopolamina que eluye a los 20.77 min, la cual produce delirios y, en grandes cantidades, la muerte (^{Pérez, Martinez, Hernández y Rojas, 1998}). Estos resultados concuerdan con los encontrados por ^{Ávalos y Pérez-Urrutia (2009)}, quienes señalan que existe presencia de alcaloides trópanicos en la planta como: la hiosciamina, atropina y escopolamina.

Debido a lo anterior, se afirma que cada estructura analizada contiene alcaloides tropánicos y la toxicidad se debe a que los alcaloides contienen un átomo de nitrógeno metilado (N-CH₃), lo cual hace que sea considerado un insecticida orgánico potente después de un insecticida comercial (^{Alí et al., 2017}; ^{Deng, Jelesko y Hatzios, 2006}), dichos metabolitos son variables y dependen de la etapa en que se encuentra la planta y de la variabilidad química y ecológica que suelen presentar este tipo de extractos (^{Granados-Echegoyen, Ortega-Morales, Chan-Bacab, Reyes-Estébanez y Camacho-Chab, 2016}). Por otra parte es importante destacar que los metabolitos secundarios presentes en las plantas muestran propiedades químicas específicas y realizan un papel importante en el manejo integrado de plagas forestales (^{Satish, Mohana, Ranhavendra y Raveesha, 2007}).

Los resultados analizados estadísticamente mostraron que el extracto de D. stramonium mostraron una alta tasa de mortalidad de 30% a las diferentes dosis aplicadas, similar a lo señalado por ^{Islam, Nazir, Noman, Zaynab y Wu (2016)}, quienes obtuvieron una mortalidad de 39%, al aplicar el extracto sobre Trogoderma granarium.

El extracto vegetal comienza a tener mejor efecto sobre las larvas después de las 24 h. ^{Granados-Echegoyen et al. (2016)} muestran que el extracto de D. stramonium, una vez aplicado sobre el gorgojo del maíz, es susceptible a partir de las 24 h, tiempo en el que se observa un incremento significativo, lo cual evidencia el potencial insecticida de los extractos.

La estructura que muestra mayor contenido de alcaloides es la raíz, esto puede deberse a que, a través del xilema, se recicla el contenido excedente de nutrientes, entre ellos el nitrógeno componente primordial de los alcaloides (^{Valencia, 2013}; ^{Loyola-Vargas et al., 2004}). La concentración de 50 mg/L afectó significativamente a las larvas de la mosca sierra, la cual presento una mortalidad de 23%, lo cual coincide con lo publicado por ^{Gosh et al. (2015)}, quienes afirman que D. stramonium llega a causar de 20% a 50% de mortalidad sobre Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Sin embargo, ^{Esmaeily y Bandani (2016)} e ^{Hanif et al. (2016)} consiguieron obtener una mayor mortalidad que varía desde 31% hasta 71% con el extracto de semillas de D. stramonium.

La dosis evaluada de la hoja presentó una mortalidad de 30% a partir de las 3 h con una concentración de 30 mg/L, muy similar a lo observado por ^{Din, Ashraf y Hussain (2016)} ya que, conforme avanza el tiempo de aplicación, el extracto presenta mayores efectos registrando una mortalidad de 98% y 82% después de las 48 h, dicho porcentaje difiere en cuanto a la composición físico-química de la estructura de cada insecto.

La principal modificación que provocan los extractos vegetales en los insectos es la inhibición del apetito, pero también influye el tiempo que requiere el metabolismo del insecto para desdoblar las moléculas de los alcaloides, es decir, pueden llegar a causar la muerte por inanición o por intoxicación (^{Abbasipour, Mahmoudvand, Rastegar y Hosseinpour, 2011}).

Las tres estructuras analizadas muestran propiedades insecticidas, lo que coincide con lo registrado por ^{Quintana-Obregón et al. (2010)} quien, al aplicar extractos metanólicos sobre Ramularia cercosporelloides, afirma que 75% de insectos se vieron afectados al utilizar una concentración de 5% a 10% de cada estructura. Mientras que al aumentar las dosis y las horas puede obtenerse mayor mortalidad, como lo indican ^{Kumral et al. (2010)} al evaluar a D. stramonium sobre Tetranychus urticae.

Conclusiones

Las hojas, los tallos y las raíces de Datura stramonium presentan alcaloides tropánicos. Los principales metabolitos son atropina, hiosciamina y escopolamina, los cuales actúan directamente en el sistema nervioso central del insecto.

De acuerdo con lo observado en este estudio, se espera que al incrementar el tiempo de exposición al extracto vegetal, mayor será el porcentaje de mortalidad de las larvas del cuarto y quinto instar de Neodiprion autumnalims.

La mortalidad ocasionada a las larvas varía entre las estructuras vegetales y entre las dosificaciones. Las estructuras que mostraron mejores resultados fueron raíz, hoja y tallo en este orden. Por otro lado, el porcentaje de mortalidad se incrementa después de las 24 h. La dosis de 50 mg/L del extracto de raíz fue la que mostró mejores resultados; sin embargo, si se incrementara dicha dosis hasta 70 mg/L, la mortalidad de las larvas llegaría a su 100%, es decir que a una mayor concentración de extracto se provocaría una alta mortalidad de larvas del defoliador, lo cual ayudaría a que exista una baja emergencia de adultos y una menor pérdida foliar de los pinos afectados por la mosca sierra.

De manera general en lo que respecta a la mortalidad de las larvas afectadas por cada estructura analizada, estas se relacionan positivamente con las concentraciones aplicadas, ya que provocaron una mortalidad significativa (P < 0.05) respecto al testigo. Por lo tanto, se infiere que el uso del extracto vegetal de Datura stramonium puede ser una alternativa de control de las larvas del defoliador del pino, además de ser eficiente en la primera aplicación.