Sitio de estudio

El estudio se realizó de 2015 a 2018 en Delicias, Chihuahua, México, en la huerta Santa María (28° 22’ 88’’ latitud norte y 105° 37’ 67’’ longitud oeste). Para ello, se seleccionaron 15 árboles de la variedad ‘Western’ de 16 a 19 años, injertados sobre portainjertos de nogal nativo (cultivados a partir de semillas). La huerta estaba plantada a 13 x 13 m, y cada árbol tenía un microaspersor (LWP 2450, NETAFIM™, México) de 350 LPH para riego. Las características del suelo eran: textura franco arenoso, pH de 7.9, contenido de materia orgánica muy bajo (0.58 %), 6.0 % de CaCO₃ y baja salinidad (CE de 0.84 dS∙m^-1).

Tratamientos

Los 15 árboles de nogal seleccionados eran homogéneos en cuanto al área de la sección transversal del tronco (en promedio de 18 cm) y el volumen de la copa (abundante y homogéneo en sus cuatro cuadrantes). Se establecieron tres tratamientos para comparar la producción de nueces. El primero fue la fertilización convencional de Zn foliar, el segundo fue fertilización con Zn edáfico quelado, y el tercero fue Zn quelado al suelo más la adición de Azospirillum brasilense, para estimular la solubilización del Zn, y el hongo micorrízico Pisolithus tinctorius (Cuadro 1). La forma quelatada se eligió por favorecer la absorción del Zn por las raíces y la translocación por los tejidos de conducción en el árbol (^{Sharma, Patni, Shankhdhar, & Shankhdhar, 2013}). Los tratamientos se aplicaron a los mismos árboles durante los cuatro años. Cada árbol representó una repetición bajo un diseño completamente al azar.

La concentración inicial de Zn en suelo se determinó mediante espectrofotometría de absorción atómica (Analyst 100, Perkin Elmer®, México) en dos muestras del área de riego, en el estrato de 0-30 cm y de 30-60 cm. La concentración foliar de Zn se analizó en tejido deshidratado mediante digestión triácida (HNO₃, HClO₄ y H₂SO₄, en relación 10:1:0.25) en espectrofotometría de absorción atómica por el método DTPA (^{González, Almendros, & Álvarez, 2009}).

A pesar de encontrar una concentración adecuada de Zn, se decidió aplicar Zn quelado dos veces por temporada, ya que este Zn no necesariamente está disponible para el árbol. Lo anterior debido a que la forma quelatada permite que el elemento permanezca disponible en el suelo y en el agua en condiciones extremas, como pH alto (> 7.5) y alta concentración de carbonatos (> 6 %).

Variables vegetativas y productivas

La longitud de los brotes se evaluó en junio de cada año, en un brote del árbol por cuadrante a una altura de 2 m, el cual se señaló para evaluar siempre el mismo. El rendimiento (kg de nueces por árbol) se determinó en octubre de cada año. El análisis de Zn foliar (mg∙kg^-1) se realizó en 10 foliolos por árbol la primera semana de agosto. Los foliolos se tomaron de la parte externa e interna del árbol, tratando de abarcar los cuatro puntos cardinales del dosel, se lavaron con solución de ácido acético al 10 % en agua destilada y se sometieron a digestión húmeda con una mezcla ácida (HNO₃/HClO₄). La medición se realizó mediante espectrometría de absorción atómica por el método DTPA (^{González et al., 2009}).

Durante los años de estudio, el suelo de la huerta se mantuvo con una cubierta de plantas arvenses con crecimiento controlado mediante siegas periódicas para estimular el establecimiento de micorrizas y la diversidad microbiana en el suelo (^{Madrid-Delgado et al., 2021}). De acuerdo con ^{Dakora y Phillips (2002)}, la cubierta vegetal de arvenses nativas con altura limitada provoca un incremento en la cantidad de exudados radicales, así como en la actividad microbiana y en la transformación química de los nutrientes.

Evaluación de bacterias y hongos totales

La concentración de bacterias y hongos (UFC∙g^-1) del suelo se cuantificó con las técnicas establecidas por las Normas Oficiales Mexicanas NOM-111, NOM-092 y NOM-110-SSA-1994 con la finalidad de relacionar las concentraciones de la microbiota con los tratamientos. El porcentaje de ectomicorrización se determinó mediante la observación de las raíces en el microscopio estereoscopio (GmbH 37081, Carl Zeiss microscopy, Alemania) con la siguiente ecuación: Porcentaje de colonización = número de micorrizas / número total de raíces (^{Aguilar-Ulloa, Arce-Acuña, Galiano-Murillo, & Torres-Cruz, 2016}).

Identificación de hongos micorrízicos

Los esporocarpos encontrados en la huerta se colectaron para su caracterización. La superficie de los esporocarpos se limpió con alcohol al 75 % siguiendo la metodología de ^{Zhang, Li, Wu, Ye, y Kang (2019)}. El hongo se aisló a partir del tejido interno de la zona central de la gleba, y se colocó en agar Melin-Norkrans. A partir del crecimiento en la caja Petri, se realizó la extracción de ADN con el kit comercial Power Soil® (QIAGEN) siguiendo el protocolo del fabricante. La amplificación de la región ITS se llevó a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) con el kit iTaq Universal SYBR® Green Supermix. La concentración de los iniciadores ITS1/ITS4 fue de 250 nM. Las condiciones de la PCR fueron: temperatura inicial de 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, alineación a 57 °C durante 30 s, una extensión a 72 °C durante 30 s, desnaturalización a 95 °C durante 15 s, curva de disociación a 60 °C durante 1 min y desnaturalización final a 95 °C durante 1 min. Se secuenciaron, por el método de Sanger, dos productos de la PCR de dos esporocarpos, se realizó un análisis de calidad de las secuencias obtenidas y se elaboró la secuencia consenso con ambas secuencias. La mayor similitud se determinó con la herramienta NCBI BLASTn.

Costos

El costo de cada tratamiento se calculó incluyendo los costos del Zn foliar, el diésel y el pago al conductor del tractor. En el segundo tratamiento se adicionó el costo del Zn quelado por hectárea y por ciclo de producción. En el tercer tratamiento, además del Zn quelado, se agregó el costo de los microorganismos benéficos.

Análisis estadístico

El análisis de varianza de los datos se realizó de acuerdo con un diseño completamente al azar, y se llevó a cabo una comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05). Ambos con el paquete estadístico MINITAB 18.

Longitud del brote fructífero

Aunque no se encontraron diferencias estadísticas entre los tratamientos (Cuadro 2), el Zn foliar exhibió la mayor longitud de brote, con un promedio de 13.99 cm en los cuatro años. ^{Tarango-Rivero et al. (2009)} mencionan que el crecimiento promedio del brote fructífero para nogales adultos ‘Western’ es de 16 a 20 cm por año. Los resultados de los dos primeros años de estudio reflejan que el tamaño del brote estuvo en el rango que dichos autores consideran convencional; sin embargo, en 2017 y 2018, la longitud promedio del brote fructífero fue menor a 12.6 cm. Lo anterior sugiere que en nogal se presenta variación fisiológica entre años, aunque la razón se desconoce.

Área foliar específica

En relación con el área foliar específica (AFE), no se encontraron diferencias estadísticas significativas entre tratamientos (Cuadro 3).

El AFE obtenida con Zn edáfico y el hongo micorrízico P. tinctorius es similar a la obtenida por ^{Tarango-Rivero y García-Nevárez (2014)}, quienes señalan que la micorrización inducida por P. tinctorius en árboles de nogal mejoró la absorción de Zn, el crecimiento y la producción de nuez (de 4.6 a 22.9 kg·árbol^-1) de 2004 a 2008.

Además del Zn, existen otros factores ambientales y de manejo involucrados en el crecimiento del nogal que deben ser considerados en futuros estudios; entre ellos se encuentran el riego, la poda y la fertilización con nitrógeno. De acuerdo con ^{Lombardini, Restrepo-Diaz, y Volder (2009)}, los nogales necesitan un buen manejo del dosel para evitar la sombra propia y mantener la productividad (^{Smith, 2008}).

Concentración foliar de Zn

El tratamiento foliar generó la concentración más alta de Zn en las hojas (43.64 mg∙kg^-1) durante los cuatro años (Cuadro 4). En general, la concentración foliar de Zn fue baja en todos los tratamientos, excepto en la fertilización de 2016. ^{Heerema et al. (2017)} reportan rangos de dicho elemento en hojas de 14 a 22 mg∙kg^-1 en nogales ‘Wichita’, por lo que los resultados de este estudio están dentro de los límites normales de Zn foliar.

El tratamiento de Zn edáfico combinado con el hongo micorrízico generó un aumento en la concentración foliar de Zn de 24 %, en comparación con el Zn quelado solo (Cuadro 4); además, el crecimiento fue mayor. Un estudio reciente menciona que la fertilización con N tiene una interacción significativa con la concentración de Zn; a mayor concentración de N, mayor contenido de Zn foliar en nogal (^{Cruz-Álvarez et al., 2020}) y en otros cultivos (^{Alloway, 2008}).

Aunque ^{Pond et al. (2006)} mencionan que la concentración normal de Zn foliar en nogales debe ser de 86 a 256 mg·kg^-1, ^{Sherman (2018)} propone estándares más bajos en hojas lavadas antes del análisis para regiones semiáridas (30 a 50 mg∙kg^-1 de Zn). Con base en el rango anterior, únicamente el control alcanzó una concentración adecuada de Zn. Durante décadas se ha argumentado que gran parte del nutriente que se considera suficiente es, en realidad, el depósito residual en la superficie de la hoja y no Zn metabólico (^{Smith & Storey, 1976}); es así que dicho elemento se transloca desde hojas viejas hasta órganos en desarrollo (^{Alloway, 2008}).

En la actualidad, se cuenta con poca información científica sobre aplicaciones foliares de Zn en nogal pecanero (^{Ojeda-Barrios et al., 2014}). ^{Ferrandon y Chamel (1988)}, y ^{Zhang y Brown (1999)} reportan que las aspersiones foliares de Zn sobre Pistacia vera y Pisum sativum mostraron poca movilidad y, aparentemente, poca efectividad, ya que después de 10 días de la aplicación de los tratamientos más del 89 % del elemento aún se encontraba en la hoja de ambos cultivos. Debido a la baja capacidad de translocación del Zn, se requieren muchas aplicaciones foliares (^{Swietlik, 2001}). La absorción foliar y la translocación de nutrientes en nogal son procesos fisiológicos poco comprendidos. Aparentemente, los fertilizantes foliares no están diseñados en función de la fisiología de las plantas. Un ejemplo de ello son las sales de Zn solubles para la fertilización foliar, las cuales pueden provocar quemaduras en las hojas (^{Drissi, Houssa, Bamouh, & Benbella, 2015}).

Rendimiento

Aunque el rendimiento de nogales adultos está estrechamente relacionado con las reservas nutricionales del año anterior, el aporte nutricional del año en curso también afecta la fructificación (^{Smith, 1991}). En este estudio, todos los tratamientos con Zn mostraron una buena producción de nuez. Los tratamientos foliar y edáfico con Zn fueron estadísticamente similares en producción (Cuadro 5). ^{Walworth et al. (2017)} reportan que el rendimiento de nuez fue inferior en los nogales que recibieron 4.4 kg·ha^-1 de Zn, en comparación con los de 2.2 kg·ha^-1, aunque sin diferencias estadísticas. Asimismo, estos autores lograron mayor producción de almendra en los tratamientos con Zn quelado aplicado por fertiirrigación en nogales ‘Western’ y ‘Wichita’ después del tercer año de aplicación.

Poblaciones microbianas y micorrización

La actividad de las comunidades nativas de micorrizas, donde no se aplicó P. tinctorius ni Zn edáfico, permitió que el Zn disponible en el suelo fuera absorbido por las raíces del tratamiento control. En este sentido, ^{Ge, Brenneman, Bonito, y Smith (2017)} informaron que el Zn disponible en el suelo es suficiente para el crecimiento y fructificación del nogal pecanero en presencia de hongos ectomicorrízicos. Por lo tanto, la labranza mínima puede favorecer el ambiente natural de las micorrizas en la huerta nogalera. Aparentemente, al no aplicar Zn al follaje o al suelo, las raíces de los árboles estimulan la actividad microbiana rizosférica para favorecer la adquisición del nutriente del suelo (^{Read & Pérez-Moreno, 2003}), como ocurrió en el tratamiento control de este estudio.

Como era de esperarse, los árboles que recibieron Zn edáfico y hongos micorrízicos presentaron alta concentración de bacterias y hongos en el suelo, y alto porcentaje de ectomicorrización (Cuadro 6). ^{Tarango-Rivero et al. (2004)} encontraron porcentajes de micorrización similares en raíces de nogales jóvenes. ^{Madrid-Delgado et al. (2021)} señalan que existen numerosos factores que influyen en las poblaciones de microorganismos en la rizosfera.

La identidad de la ectomicorriza nativa se confirmó mediante la amplificación y secuenciación del gen ITS, donde se identificó al hongo Pisolithus tinctorius (Cuadro 7). Los basidiocarpos encontrados en el área experimental presentaron las características típicas de dicho hongo (Figura 1), y su forma varió de globoso, obpiriforme a claviforme, de 4 a 11 cm de diámetro y de 3.0 a 8.5 cm de altura, sin considerar la longitud del estípite. Este último era fibroso, amarillento y profundamente enraizado, y alcanzó 5 cm de diámetro por 9 cm de largo. El estípite tenía un peridio fino y suave, de color amarillo brillante a pardo amarillento con tonos oliva oscuro. La textura del basidiocarpo fue carnosa a levemente viscosa en las etapas jóvenes, y pulvinato frágil en las etapas maduras. Cuando éste se abrió, se observaron la gleba y los peridiolos de tono blanco, marrón amarillento, rojizo y oliva. Las esporas eran esféricas de 7 a 8 μm de diámetro, con ornamentaciones de aproximadamente 0.5 μm. La raíces de los nogales ectomicorrizadas tomaron forma del tipo coraloide (Figura 2).

Figura 1 Cuerpo fructífero del hongo ectomicorrízico Pisolithus tinctorius. Huerta nogalera Santa María en Delicias, Chihuahua, México. 

Figura 2 Raíces alimentadoras ectomicorrizadas de nogal pecanero (Carya illinoinensis) tipo coraloide. Huerta nogalera Santa María en Delicias, Chihuahua, México. 

Método de aplicación de zinc

De acuerdo con los resultados del estudio, la aplicación de Zn al suelo es efectiva para los nogales cuando el nutriente se concentra en una banda de aplicación y las raíces superficiales alimentadoras están ectomicorrizadas. ^{Wood (2007)} aplicó sulfato u óxido de Zn en una banda de 10 cm de ancho en la línea de goteo de nogales de cinco años en suelos ácidos. Dicho autor menciona que la aplicación de 264 g de Zn por árbol suple las necesidades del nutriente hasta por tres o cuatro años, ya que el fertilizante profundiza en el suelo lentamente y cada año que pasa las raíces alimentadoras tienen contacto con la banda de Zn.

Costos

El análisis de costos se resume en el Cuadro 8. Los resultados muestran que ambos tratamientos tienen el mismo costo ($116.00 USD·ha^-1), pero si se agregan los hongos micorrízicos se deben aumentar $36.00 USD·ha^-1.

En el modelo convencional de producción de nogales en Chihuahua, se vierten al ambiente 5,400 g·ha^-1·año^-1, mientras que aplicar 280 g·árbol^-1 de Zn quelado en el suelo equivale a 2,660 g∙ha^-1, lo cual es suficiente para el ciclo del nogal. El consumo de diésel del tractor para fertilizar con Zn asperjado al follaje se podría reducir en 65 %, así como el agua, y se evitaría la compactación del suelo, ya que se requieren de cinco o más aplicaciones foliares.