Introducción

En los sistemas de producción vegetal modernos, el trasplante ha sustituido la siembra directa de manera importante. El trasplante en contenedores permite un incremento en los rendimientos, uniformidad del cultivo y un mayor control en la calendarización de la producción, en comparación con la siembra directa. Sin embargo, la necesidad de reducir los costos del trasplante ha impulsado el uso de charolas de germinación con celdas pequeñas. Esto implica una limitación física al desarrollo del sistema radical (^{Di Benedetto, 2011}). Las consecuencias de las restricciones al desarrollo temprano de la raíz pueden extenderse hacia el ciclo de vida de la planta, afectando negativamente la producción.

La lechuga es uno de los cultivos más importantes a nivel mundial (^{Stagnari, Galieni, & Pisante, 2015}; ^{Shehata, Schmidhalter, Valšíková, & Junge, 2016}; ^{Kim, Moon, Tou, Mou, & Waterland, 2016}), y frecuentemente se cultiva en charolas de germinación de celdas pequeñas, por lo que es necesario superar las restricciones radicales para minimizar pérdidas en el rendimiento. Los efectos de la restricción radical sobre el crecimiento de los brotes son causados, principalmente, por un bajo suministro de citoquininas desde las raíces, y pueden ser parcialmente superados por el suministro exógeno de esta hormona (^{Richards & Rowe, 1977}), pero su aplicación en hortalizas sólo ha cobrado atención recientemente (^{Di Benedetto, Giardina, de Lojo, Gandolfo, & Hakim, 2020a}). Las citoquininas son sintetizadas en los ápices de las raíces y transportadas a través del xilema al brote, donde promueven la división celular, la expansión foliar y el desarrollo del aparato fotosintético, además de retrasar la senescencia, lo cual resulta en un mayor desarrollo y tamaño de la planta (^{Hönig, Plíhalová, Husičková, Nisler, & Doležal, 2018}; ^{Glanz-Idan, Tarkowski, Turečková, & Wolf, 2020}).

El suministro exógeno de citoquinina al follaje puede contrarrestar los efectos de la restricción radical en varias especies hortícolas y ornamentales (^{Di Benedetto, Tognetti, & Galmarini, 2010}; ^{Di Benedetto et al., 2020b}). La aspersión temprana de citoquinina sintética 6-bencilaminopurina (BAP) a menudo promueve la tasa de crecimiento relativo relacionada con un aumento de la tasa de asimilación neta y la tasa fotosintética, más que con un aumento de la partición de carbono al brote (^{Di Benedetto, Tognetti, & Galmarini, 2015a}). Asimismo, dicha hormona puede mejorar la fijación de carbono mediante el desarrollo y el mantenimiento de cloroplastos funcionales y la síntesis de clorofila (^{Boonman et al., 2007}; ^{Cortleven & Schmülling, 2015}; ^{Liu, Li, & Zhong, 2017}).

Se ha comprobado que la citoquinina suministrada a plantas in vitro aumenta el contenido de clorofila (^{Muniz-de Oliveira et al., 2008a}; ^{Dobránszki & Drienyovszki, 2014}), mientras que en plantas en etapa avanzada ayuda a postergar la senescencia (^{Hönig et al., 2018}). No obstante, no se encontraron cambios importantes en el contenido de clorofila después del suministro exógeno de BAP en algunas ornamentales con restricción de raíces como Epipremnum aureum (^{Di Benedetto et al., 2015a}) y Ficus benjamina (^{Di Benedetto, Galmarini, & Tognetti, 2020c}), a pesar del efecto promotor de la hormona en la tasa de asimilación neta. Es importante dilucidar si la citoquinina puede promover la concentración de clorofila en lechuga bajo restricciones radicales, dada la asociación entre la clorofila y la calidad de la lechuga.

Las citoquininas también se asocian positivamente con la concentración de nitrógeno y las proteínas fotosintéticas en las hojas, mediante la regulación de la expresión de los genes relacionados con la captación de nitrógeno y la asimilación de carbono (^{Ruffel et al., 2011}). Dicha hormona también mejora el transporte del nitrógeno a las hojas (^{Ookawa, Naruoka, Sayama, & Hirasawa, 2004}) y dentro de ellas (^{Gu et al., 2018}), desde las hojas más viejas y sombreadas hacia las más jóvenes e iluminadas por el sol, donde se estimula la expresión de la rubisco (^{Ookawa et al., 2004}; ^{Boonman et al., 2007}). La citoquinina retrasa la senescencia asociada con los niveles de nitrógeno, proteínas y rubisco de las hojas, así como las tasas de fotosíntesis (^{Jordi et al., 2000}).

Estudios sobre Epipremnum aureum y Ficus benjamina con restricción radical mostraron un aumento en la concentración de nitrógeno foliar como resultado de las aspersiones de BAP (^{Di Benedetto et al., 2010}; ^{Di Benedetto, Galmarini, & Tognetti, 2018}; ^2020c), que a su vez se asoció con un aumento en la tasa de asimilación neta (TAN) respecto de los testigos no tratados. El aumento en el contenido de nitrógeno foliar en plantas de lechuga a las que se les suministró citoquinina también podría ser un atributo deseable desde el punto de vista de la calidad nutricional.

Los cambios en la asimilación de carbono provocados por la citoquinina también pueden ser consecuencia de un aumento de la difusión de CO₂ debido a cambios anatómicos, aunque se han reportado resultados contradictorios. ^{Bosselaers (1983)} reportó una disminución de la densidad estomática en hojas de Phaseolus vulgaris tratadas con BAP, pero no con otra citoquinina (kinetina). En cambio, ^{Gandolfo et al. (2014)} encontraron un aumento de la densidad estomática de Impatiens wallerana al aplicar BAP, el cual fue más pronunciado en las plántulas sometidas a una restricción radical severa. Este efecto dependió de la concentración de la BAP, siendo las dosis más bajas (5 mg·L^-1) las más efectivas.

La proporción de espacios intercelulares en el mesófilo de la hoja, los cuales influye en la difusión del CO₂ dentro de ésta, también se modifica por la citoquinina, aunque algunos trabajos han reportado el efecto contrario. ^{Bosselaers (1983)} encontró una disminución en la proporción de espacios aéreos intercelulares en Phaseolus vulgaris tratado con kinetina y BAP; respuesta similar a la reportada por ^{Muniz-de Oliveira et al. (2008b)} en Annona glabra. Sin embargo, ^{Gandolfo et al. (2014)} encontraron que en las hojas de Impatiens wallerana la proporción de espacios intercelulares aumentó cuando fueron tratadas con 5 mg·L^-1 de BAP, pero con concentraciones mayores revirtieron el efecto.

Varios reportes indican que la citoquinina puede promover un incremento en el grosor de la hoja (^{Bosselaers, 1983}; ^{Di Benedetto, Tognetti, & Galmarini, 2015b}, ²⁰¹⁸), lo cual podría jugar un papel en la difusión del CO₂. El incremento en el grosor de la hoja, como consecuencia de la aplicación de citoquinina, sería una respuesta de interés en lechuga debido a su asociación con la vida útil poscosecha (^{Lee, Nath, Goswami, & Nou, 2017}).

Investigaciones realizadas sobre lechugas cabeza de mantequilla de verano rociadas con BAP y cultivadas en pequeñas macetas sugieren que esta especie también responde a la citoquinina exógena, al aumentar la tasa de asimilación neta, aunque los procesos biológicos implicados continúan siendo desconocidos (^{Campolongo et al., 2020}). La comprensión de la respuesta de la lechuga a la citoquinina bajo diferentes grados de restricciones radicales es necesaria, no sólo para obtener mayores rendimientos comerciales, sino también por su impacto potencial en los atributos de calidad. Para optimizar el uso comercial de este tratamiento, también se necesita información sobre el mejor momento de aplicación (ya sea previa o posterior al trasplante) (^{de Lojo, Gandolfo, Boschi, Giardina, & Di Benedetto, 2019}; ^{Hakim, Gandolfo, Giardina, & Di Benedetto, 2017}).

El objetivo de este estudio fue evidenciar si las aspersiones de BAP pueden mejorar la acumulación de biomasa en lechugas mediante una asimilación alta de carbono, dependiendo del tamaño de la celda, la concentración de la hormona y el momento de aplicación; asimismo, documentar los cambios causados por BAP en los contenidos de clorofila y nitrógeno, aunados a cambios en la anatomía de la hoja, lo cual podría explicar la promoción de la asimilación de carbono mediante esta hormona.

Materiales y métodos

El experimento se llevó a cabo en la Facultad de Agronomía de la Universidad de Buenos Aires, Argentina (34° 35’ 59’’ latitud sur y 58° 22’ 23’’ longitud oeste), desde el 6 de marzo hasta el 15 de mayo de 2017, y se repitió una vez del 5 de marzo al 21 de mayo de 2018.

Las semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) Crimor INTA se sembraron y cultivaron en charolas de germinación con 128, 200 y 288 celdas (17.37, 13.90 y 6.18 cm³ por celda, respectivamente), en sustrato Klasmann411® (GmbH, Alemania) por 35 días. El sustrato contenía turba rubia de 0-5 mm, pH de 6 y estructura extra fina con Hydro S como agente humectante. Las plántulas de lechuga se asperjaron con diferentes concentraciones de BAP (0, 5, 50 o 100 mg·L^-1) (EC 214-927-5, Sigma-Aldrich®, EUA) cuando el primer par de hojas verdaderas se desarrollaron (tratamientos pre-trasplante para la BAP). Adicionalmente, las plántulas sin tratamiento pre-trasplante se asperjaron con BAP siete días después del trasplante (tratamientos post-trasplante). La BAP se diluyó previamente en alcohol etílico al 80 %.

Las plántulas de lechuga se trasplantaron a macetas de 3 L llenas con un medio de Sphagnum maguellanicum - residuo de río - perlita (40:40:20, v/v) y se cultivaron por 60 días aproximadamente. Los residuos de río son el resultado de la acumulación de residuos vegetales bajo un ambiente anaeróbico, que se degradaron en las orillas de ríos o lagos ubicados en climas subtropicales con precipitaciones pluviales mayores a 1,000 mm. Al principio del experimento, la porosidad total (%), la porosidad con aire (%), la capacidad del contenedor (%) y la densidad aparente (g·cm^-3) fueron 63.50, 17.06, 10.06 y 0.35, respectivamente. Las malezas se retiraron manualmente.

Las plantas se regaron con agua de grifo de alta calidad (pH de 6.64 y conductividad eléctrica de 0.486 dS·m^-1), utilizando rocío elevado intermitente y una fertirrigación semanal (1, 0.5, 1 y 1.5 de N:P:K:Ca, v/v). La concentración de nutrientes se modificó conforme el desarrollo de la plántula: 50 mg_N·L^-1 desde la protrusión radical hasta la expansión de las primeras hojas verdaderas, 100 mg_N·L^-1 de esta etapa hasta el trasplante y 150 mg·L^-1 durante los experimentos en las macetas. El volumen de solución de la fertilización varió de acuerdo con el volumen de la maceta.

La temperatura ambiental promedio de cada media hora se registró utilizando un data logger (H08-001-02, HOBO®, EUA), protegido de la irradiación directa con papel aluminio. La radiación solar global se registró con un data logger PAR. Las temperaturas promedio oscilaron entre 14.4 y 16.1 °C, y la radiación fotosintéticamente activa promedio varió de 13.46 a 17.33 mol fotones·m^-2·día^-1. Las macetas se acomodaron a una densidad de 6 plantas·m^-2, evitando sombreo mutuo.

Las plantas para mediciones (diez por tratamiento) que implicasen su destrucción se cosecharon en la etapa del trasplante y posteriormente en intervalos de 20 días. Las raíces se lavaron y se registraron los pesos frescos (PF) de raíz, tallo, hoja y peciolo, así como la longitud de raíz. Los pesos secos (PS) se obtuvieron después de secar las raíces, los tallos y las hojas a 80 °C hasta peso constante (aproximadamente 96 h). El número de hojas se registró y el área foliar de cada una de ellas se determinó utilizando el programa ImageJ®.

La tasa de aparición foliar (TAF), la tasa de expansión relativa del área foliar (TERAF), la tasa de crecimiento relativo (TCR), la tasa de asimilación neta (TAN) y la relación de área foliar (RAF) se calcularon de acuerdo con ^{Di Benedetto y Tognetti (2016)}.

La TAF se calculó como la pendiente del número de hojas visibles (incluidas las desenrolladas > 1 cm) contra el tiempo (en semanas). La TERAF se calculó como la pendiente de la regresión del logaritmo natural de las áreas foliares totales contra el tiempo (en días). La TCR de toda la planta se determinó como la pendiente de la regresión lineal del logaritmo natural de los PS contra el tiempo (en días), y la TCR promedio se calculó a partir de la TCR/TAN. La TAN promedio se calculó como:

donde W ₀ es el valor extrapolado del PS (g) en el momento cero, k _w es la TCR (días^-1), A ₀ es el valor extrapolado del área foliar (cm²) en el momento cero, k _a es la TERAF (días^-1), t es el tiempo (días) en el punto medio del periodo experimental y e es la base de logaritmo natural.

La tasa fotosintética neta se midió en concentraciones ambientales de O₂ y CO₂ a una densidad de flujo de fotones en saturación (> 1,700 µmol de fotones·m^-2·s^-1), entre las 11:30 y las 13:00 horas de un día soleado, justo antes de la cosecha final. Se seleccionó la hoja más joven, completamente expandida, de tres plantas de cada tratamiento hormonal para las mediciones, las cuales se realizaron en un sistema fotosintético portátil (LI-COR LI-6200, LI-COR®, EUA).

Para el análisis de clorofila, se cortaron discos de las hojas de la zona central, cerca de la nervadura central, y se colocaron en viales que contenían 3 cm³ de N, N-dimetilformamida. Dichos discos se infiltraron al vacío y se almacenaron durante tres días en completa oscuridad, momento en el cual la clorofila se había eluido completamente hacia el disolvente. La absorbancia a 647 y 664 nm se midió con un espectrofotómetro (Metrolab 1600, Metrolab UV-Vis, Argentina), y el contenido de clorofila se calculó según lo indicado por ^{Inskeep y Bloom (1985)}.

La concentración de nitrógeno foliar en el muestreo final se analizó por el método Kjeldahl. Las muestras de hojas se introdujeron en un tubo con ácido sulfúrico y se calentaron por aproximadamente 1.5 h para elevar la temperatura hasta 310-320 °C. Después de 1 h de digestión, los tubos se retiraron y se enfriaron hasta 20 °C. El ácido digerido se diluyó a 10 mL con agua y se transfirió una alícuota de 3 mL a otro tubo, donde se añadió el reactivo de Nessler. La absorbancia a 500 nm se midió con un espectrofotómetro.

Los azúcares no reductores de las hojas en el muestreo final se analizaron por el método de la Antrona. Las hojas se extrajeron con etanol al 70 % (v/v) y los extractos se evaporaron al vacío hasta su secado. Posteriormente, se pasaron por agua caliente y se aclararon con hidróxido de aluminio. El reactivo Antrona (5 mL) se pipeteó en tubos Pyrex y se enfrió en agua helada. La solución a ensayar (1 mL) se colocó en capas sobre el ácido, enfriando durante 5 min más, y luego se mezcló vigorosamente mientras seguía sumergida en agua helada. Los tubos se cubrieron holgadamente con tapones de corcho, se calentaron a 80 °C en un baño de agua de ebullición vigorosa y nivel constante, y luego se enfriaron en agua durante 5 min.

En la cosecha final, se colectaron muestras de hojas jóvenes completamente expandidas para examinar la anatomía foliar; es decir, el grosor total de la hoja y el volumen de los espacios intercelulares. El tejido de la región media de la lámina se fijó en una mezcla de etanol, formalina, ácido acético glacial y agua destilada (70, 5, 5 y 20 %, respectivamente) antes de deshidratarlo en una serie de etanol y alcohol tert-butílico. Las muestras se seccionaron en trozos de 10 a 20 µm con un micrótomo rotatorio y se tiñeron con safranina cristal-violeta verde rápido. Los datos obtenidos fueron las medias de tres hojas por tratamiento, utilizando diez cortes transversales por hoja. Los datos anatómicos cuantitativos se obtuvieron con el programa Image Pro Express versión 6.0 (Media Cybernetics, EUA).

El diseño experimental fue un factorial aleatorizado con tres bloques de cinco repeticiones de cada tratamiento (volumen de celda x concentración de BAP x experimento). La unidad experimental fue una maceta. Los datos se sometieron a un análisis de varianza de tres vías utilizando el programa STATISTICA 8 (StatSoft). Dado que no hubo diferencias significativas entre los dos experimentos anuales, estos se agruparon para el análisis (Cuadro 1). La comparación de medias se realizó mediante la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). Las pendientes de las regresiones de TERAF, TCR y TAN se obtuvieron con el programa SMATR (^{Warton, Duursma, Falster, & Taskinen, 2012}).

Resultados

Acumulación de biomasa

Se observó un efecto altamente significativo del tamaño de celda, el tratamiento con BAP y su interacción, sobre la TCR, TAN y RAF (Cuadro 1). El efecto de las aplicaciones exógenas de BAP sobre la acumulación de PS en la lechuga se muestra en la Figura 1. Se encontraron incrementos de la TCR, en relación con los testigos, en las plantas cultivadas en charolas de germinación de 288 celdas; sin embargo, la mayoría de las concentraciones de BAP aumentaron la TCR también en las plantas cultivadas en 128 y 200 celdas, aunque en menor medida (Figura 1A). En cuanto a los componentes de la TCR, se encontró un incremento relativo en la TAN (Figura 1B) y una disminución relativa en la RAF, como consecuencia de la aplicación de BAP. En ambos casos, las respuestas más altas se encontraron en las plantas cultivadas en charolas de germinación de 288 celdas.

Figura 1 Efecto del asperjado de diferentes concentraciones (5, 50, o 100 mg·L^-1) de citoquinina 6-bencilaminopurina (BAP) en pre- o post-trasplante: a) tasa de crecimiento relativo (TCR), b) tasa de asimilación neta (TAN) y c) relación de área foliar (RAF) en lechugas. Los datos están expresados como porcentajes de cambio en los valores del testigo. Los datos de los testigos de las charolas de germinación de 128, 200 y 288 celdas fueron 0.0823, 0.0808 y 0.0788 (g·g^-1·día^-1) para TCR, 21.28, 16.73 y 13.21 (g·cm^-2·día^-1 x 10^-5) para TAN, y 287.09, 537.97 y 611.49 (cm²·g^-1) para RAF, respectivamente.  

Para analizar la contribución de los cambios en la TAN y en la RAF sobre la variación debida a la BAP en la TCR, se realizó un análisis de regresión, el cual mostró que la TAN estaba fuerte y directamente asociadas con la TCR. Mientras tanto, se encontró una asociación inversa y moderada entre TCR y RAF (Figura 2).

Figura 2 Contribución de los cambios: a) tasa de asimilación neta (TAN) y b) relación de área foliar (RAF) sobre la variación en la tasa de crecimiento relativo (TCR) de plantas de lechuga cultivadas en charolas de germinación de 128, 200 y 288 celdas, y asperjadas con diferentes concentraciones (0, 5, 50 o 100 mg·L^-1) de citoquinina 6-bencilaminopurina (BAP) en pre- y post-trasplante. Las ecuaciones de la regresión lineal son TAN = 1081.60TCR - 63.11 (r² = 0.581; P < 0.001) y RAF = -13106.00TCR + 1455.30 (r² = 0.495; P < 0.05). Los símbolos indican testigos (negro), BAP en pre-trasplante (blanco) y BAP en post-trasplante (gris), correspondientes a charolas de germinación de 128 (círculos), 200 (cuadros) y 288 (triángulos) celdas.  

Fijación de carbono

La tasa fotosintética al final del experimento se vio afectada significativamente por el tamaño de celda, el tratamiento con BAP y su interacción (Cuadro 1). Esta variable mostró un comportamiento similar al de la TAN; es decir, un incremento general significativo con la aplicación de BAP en relación con las plantas testigo, observándose las mayores respuestas en las plantas cultivadas en charolas de germinación de 288 celdas (Figura 3A). De acuerdo con estos resultados, la tasa fotosintética se correlacionó linealmente con la TAN (Figura 3B).

Figura 3 Efecto de la aplicación de diferentes concentraciones (5, 50, o 100 mg·L^-1) de citoquinina 6-bencilaminopurina (BAP) sobre la tasa fotosintética relativa (a). Los datos están expresados como cambios porcentuales observados después de la aplicación de BAP. El panel b muestra la interrelación entre la tasa de asimilación neta (TAN) y la tasa fotosintética neta (mol CO₂·m^-2·s^-1). La ecuación de la regresión lineal fue TAN = 2.40tasa fotosintética + 9.00 (r² = 0.631; P ≤ 0.001). Los símbolos indican testigos (negro), BAP en pre-trasplante (blanco) y BAP en post-trasplante (gris), correspondientes a charolas de germinación de 128 (círculos), 200 (cuadros) y 288 (triángulos) celdas. Los datos de los testigos de las charolas de germinación de 128, 200 y 288 celdas fueron 7.93, 5.22 y 4.16 mol CO₂·m²·s^-1, respectivamente. 

Relación entre la fijación de carbono y las variables anatómicas foliares

Tanto la tasa de asimilación neta (Figura 4 a ) como la tasa fotosintética (Figura 4 b ) se correlacionaron directamente con el grosor de la hoja, y los mejores ajustes se obtuvieron con ecuaciones curvilíneas (Figura 4 a y b, respectivamente). Ambas variables relacionadas con la fijación de carbono también se correlacionaron directamente con la proporción de espacios intercelulares (Figura 4c y d).

Figura 4 Relación entre la asimilación de carbono y las variables anatómicas foliares. Las ecuaciones de regresión fueron: a) TAN = -0.0008grosor de la hoja² + 0.455grosor de la hoja - 23.63 (r² = 0.726; P ≤ 0.001), b) tasa fotosintética = -0.0004grosor de la hoja² + 0.181grosor de la hoja - 11.25 (r² = 0.442; P ≤ 0.001), c) TAN = 0.48espacios intercelulares + 7.87 (r² = 0.618; P ≤ 0.001) y d) tasa fotosintética = 0.15espacios intercelulares + 5.28 (r² = 0.679; P ≤ 0.001). Los símbolos indican testigos (negro), BAP en pre-trasplante (blanco) y BAP en post-trasplante (gris), correspondientes a charolas de germinación de 128 (círculos), 200 (cuadros) y 288 (triángulos) celdas.  

Relación entre fijación de carbono y contenido de nitrógeno foliar

Se observó una asociación directa entre la TAN, o la tasa fotosintética, y el contenido de nitrógeno foliar por unidad de superficie. Los mejores ajustes se obtuvieron con una relación curvilínea, alcanzando la respuesta de la planta un óptimo por encima (Figura 5a y b), aunque las correlaciones fueron un poco más débiles que las observadas entre la fijación de carbono y las variables anatómicas foliares.

Figura 5 Relación entre la asimilación de carbono y las variables metabólicas foliares. Las ecuaciones de regresión fueron: a) TAN = 7.78contenido de nitrógeno foliar + 37.12 (r² = 0.558; P ≤ 0.001) y b) tasa fotosintética = 2.00contenido de nitrógeno foliar² + 11.14 (r² = 0.338; P ≤ 0.01). Los símbolos indican testigos (negro), BAP en pre-trasplante (blanco) y BAP en post-trasplante (gris), correspondientes a charolas de germinación de 128 (círculos), 200 (cuadros) y 288 (triángulos) celdas. 

Relación entre el grosor de la hoja y las variables anatómicas o metabólicas de las hojas

La posibilidad de autocorrelación entre el grosor de la hoja y otras variables analizadas (porcentaje de espacios intercelulares, nitrógeno por unidad de superficie, clorofila por unidad de superficie y concentración de azúcares no reductores) se estudió mediante un análisis de regresión. Mientras que se observaron relaciones no significativas entre la proporción de espacios intercelulares (Figura 6a), el contenido de nitrógeno de la hoja (Figura 6b), el contenido de clorofila (Figura 6c) y el grosor de la hoja, se encontró una correlación significativa entre el contenido de azúcares no reductores y el grosor de la hoja (Figura 6d) (r² = 0.606).

Figura 6 Relación entre grosor de la hoja y las variables anatómicas y metabólicas de las hojas. Las ecuaciones de la regresión lineal son: a) Espacios intercelulares = 0.15grosor de la hoja + 14.17 (r² = 0.103), b) contenido de nitrógeno foliar = 0.001grosor de la hoja + 0.22 (r² = 0.076), c) contenido de clorofila = 0.07grosor de la hoja + 194.25 (r² = 0.021) y d) azúcares no reductores = 0.04grosor de la hoja - 5.67 (r² = 0.606; P ≤ 0.001). Los símbolos indican testigos (negro), BAP en pre-trasplante (blanco) y BAP en post-trasplante (gris), correspondientes a charolas de germinación de 128 (círculos), 200 (cuadros) y 288 (triángulos) celdas. 

Cuando todos los datos de la tasa fotosintética se graficaron contar el volumen del mesófilo foliar (Figura 7a), se encontró una relación directa significativa (r² = 0.612). Sin embargo, relaciones más altas se encontraron al analizar los datos de pre- y post-trasplante por separado (r² = 0.757 y r² = 0.866, respectivamente) (Figura 7).

Figura 7 Relación entre la tasa fotosintética y el volumen del mesófilo foliar de plantas de lechuga aspejadas con BAP en pre- y post-trasplante (a). La figura b muestra la diferencia de los datos para cada tratamiento (número de celdas y aspersiones con BAP). Las ecuaciones de regresión lineal son: tasa fotosintética_{BAP pre-transplante} = 0.0004volumen de espacio aéreo + 7.06 (r² = 0.757), tasa fotosintética_{BAPpost-transplante} = 0.0009volumen de espacio aéreo + 4.29 (r² = 0.866) y tasa fotosintética_{datos combinados} = 54.92volumen de espacio aéreo + 6.77 (r² = 0.612). Los símbolos indican testigos (negro), BAP en pre-trasplante (blanco) y BAP en post-trasplante (gris), correspondientes a charolas de germinación de 128 (círculos), 200 (cuadros) y 288 (triángulos) celdas.  

Discusión

Diversos artículos realizados en especies hortícolas y ornamentales indica que los efectos de la restricción de raíces debida a macetas de trasplante pequeñas pueden ser, al menos parcialmente, superados mediante el suministro exógeno de citoquinina (^{Di Benedetto et al., 2020b}). La aplicación de esta hormona, ya sea en etapas previas o tempranas después del trasplante, a menudo revierte la restricción radical al promover la asimilación de carbono, lo cual finalmente resulta en la recuperación del desarrollo de la planta y la acumulación de biomasa, aunque esto puede depender de la severidad de la restricción radical, la concentración de la hormona y el momento de la aplicación de citoquinina (^{Di Benedetto et al., 2020a}). Los datos obtenidos en este trabajo coinciden, en gran medida, con informes de otras especies, ya que se observó un aumento en la acumulación de biomasa de la planta y una promoción del desarrollo del área fotosintética (Cuadro 2) asociado a una producción foliar más rápida y a una mayor área foliar individual.

La disminución del volumen de las celdas (de 128 a 288), por charola dio lugar a una marcada reducción de los valores de la TAN (Figura 1b) y de la fotosíntesis neta (Figura 3a). Sin embargo, el impacto en la TCR fue, en general, menor (Figura 1a), debido al aumento progresivo de la RAF observado en las plantas cultivadas en celdas más pequeñas (Figura 1c). Por ello, el cambio en la asignación de recursos, priorizando el desarrollo del área foliar, se puede considerar como una respuesta adaptativa que tiende a compensar el fuerte impacto negativo de la restricción radical sobre la fijación de carbono. El deterioro de la asimilación de carbono debido a la restricción de las raíces se ha reportado en cultivos hortícolas y ornamentales como el tomate (^{Shi, Ding, Dong, Zhou, & Yu, 2008}), pothos (^{Di Benedetto et al., 2015b}) y ficus (^{Di Benedetto et al., 2020c}).

Como se esperaba, la aplicación exógena de citoquinina contrarrestó, en general, el impacto negativo de la restricción radical en el crecimiento de la planta, dando como resultado un mayor desarrollo del área foliar y un mayor crecimiento de la planta que los testigos no tratados (Cuadro 3); principalmente, se observó un aumento de la TAN promedio (Figura 1c) y de la tasa fotosintética neta (Figura 3a). Además, las aspersiones de BAP fueron relativamente más efectivas para promover la TAN en las plántulas cultivadas en las celdas más pequeñas (es decir, las cultivadas en charolas de germinación de 288 celdas). Esto es coherente con las expectativas, ya que se supone que las plantas sometidas a una severa restricción radical producen la menor cantidad de citoquinina, la cual se sintetiza en los ápices de las raíces (^{Zhang et al., 2014}).

Trabajos realizados en otras especies han demostrado que la respuesta de las plantas al aumento de la concentración de BAP suele alcanzar un máximo, lo cual sugiere la existencia de una concentración óptima de dicha hormona en los tejidos (^{Araki, Rattin, Di Benedetto, & Miravé, 2007}). En concordancia con esto, los resultados obtenidos en este trabajo muestran que al duplicar la concentración de BAP de 50 a 100 mg·L^-1 no se observó un efecto significativo en la promoción del crecimiento, encontrándose respuestas similares cuando el BAP se aplicó en cualquiera de las etapas (pre- o post-trasplante).

A pesar de promover el desarrollo del área foliar, el tratamiento con BAP produjo una disminución de la RAF, lo cual fue más notable en las plantas cultivadas en las celdas más pequeñas. Dicha disminución se podría atribuir a un mayor crecimiento de las raíces, junto con una menor área foliar específica, que a su vez se asoció con un mayor grosor de las hojas (Cuadro 5) y una mayor concentración de azúcar en las plantas asperjadas, en comparación con los testigos (Cuadro 6). Así, las plantas tratadas con BAP mostraron cambios morfo-fisiológicos que tendieron a compensar los efectos provocados por la restricción radical.

Los procesos fisiológicos involucrados en la promoción del crecimiento mediada por la citoquinina en plantas con raíces restringidas han recibido poca atención. Se sabe que las citoquininas promueven el desarrollo del aparato fotosintético, incluyendo la ultra-estructura del cloroplasto y la síntesis de la clorofila, especialmente durante la transición de etioplasto a cloroplasto (^{Cortleven & Schmülling, 2015}).

Entre los procesos más importantes relacionados con la asimilación de carbono, la citoquinina incrementa la abundancia de proteínas para ejercer su papel en el desarrollo y la función del cloroplasto. La citoquinina aumenta la expresión de genes nucleares relacionados con los plastos, como CAB, que codifican las proteínas de unión de la clorofila del fotosistema II, y también los genes que codifican las subunidades pequeñas y grandes de la rubisco (^{Cortleven & Schmülling, 2015}; ^{Liu et al., 2017}). Asimismo, la citoquinina acelera la biosíntesis de la clorofila, promoviendo la síntesis del precursor ácido 5-aminolevulínico y aumentando la actividad de la NADPH:protoclorofilida oxidorreductasa, que convierte la protoclorofilida en clorofilida (^{Cortleven & Schmülling, 2015}).

Se ha planteado la hipótesis de que los efectos promotores del crecimiento de la citoquinina exógena sobre las plántulas con raíces restringidas se podrían explicar por el aumento del contenido de clorofila o de nitrógeno, lo cual, en última instancia, daría lugar a la promoción de la tasa fotosintética (^{Di Benedetto et al., 2020c}).

Los resultados obtenidos muestran que el contenido de nitrógeno se vio afectado principalmente por el tamaño de la celda (Cuadro 5), siendo significativamente variable el impacto de las aplicaciones de BAP. La variación en el contenido de nitrógeno sólo podría explicar los cambios en la fijación de carbono a valores de nitrógeno muy bajos (es decir, inferiores a 0.5 mg·cm^-2), observados en las plantas cultivadas en las celdas más pequeñas (Figura 5). Debido a la fertirrigación aplicada semanalmente, la disponibilidad de nitrógeno en el sustrato se puede considerar como no limitante, y bajo estas condiciones se espera que las plantas C₃, como la lechuga, sinteticen grandes cantidades de proteínas fotosintéticas, lo cual hace que la fotosíntesis limitada por la actividad de la rubisco sea mayormente improbable (^{Sage & Coleman, 2001}).

Adicionalmente, se observó que la concentración de clorofila en las hojas no fue modificada por la BAP, ni en la aplicación previa ni en la posterior al trasplante, independientemente del tamaño de la celda (Cuadro 5). Además, cualquier variación en la concentración de clorofila entre los tratamientos no se asoció con las variables de fijación de carbono, lo cual contrasta con la sugerencia de ^{Croft et al. (2017)}, ya que afirman que el contenido de clorofila en las hojas se puede considerar como un indicador de la capacidad fotosintética de las mismas. Aunque la razón de esta aparente discrepancia no está clara, hay que tener en cuenta que la promoción de la síntesis de clorofila por parte de la citoquinina se ha observado sobre todo en plántulas cultivadas en oscuridad (^{Cortleven & Schmülling, 2015}), y que estudios realizados con plantas cultivadas en invernadero de varias especies también han mostrado una falta de respuesta de la clorofila a las aspersiones de BAP (^{Di Benedetto et al., 2015a}). Esto se puede interpretar desde un punto de vista eco-fisiológico, ya que los valores máximos de intensidad lumínica diaria en los presentes experimentos estaban cerca de los reportados como intensidades de saturación para lechuga (^{Wang, Lu, Tong, & Yang, 2016}), por lo que no se esperaría que cualquier aumento adicional en la captura de luz promueva significativamente la fotosíntesis.

Otra posible explicación de la promoción de la fijación del carbono, inducida por citoquinina en plantas con raíces con espacio restringido, es que los cambios morfo-anatómicos impulsados por la hormona pueden afectar la difusión del carbono hacia los cloroplastos. En este estudio, la proporción de los espacios intercelulares se vio severamente disminuida al reducir el volumen de las celdas. Por el contrario, la BAP indujo una notable recuperación de sus valores en las plantas cultivadas en bandejas de 288 celdas, particularmente en las aplicaciones previas al trasplante (Cuadro 4). Esta respuesta, junto con un incremento en el grosor de la hoja observado frecuentemente en plantas tratadas con BAP (Cuadro 4), generó un incremento en el volumen del espacio libre por unidad de superficie foliar, el cual estuvo fuertemente correlacionado con la tasa fotosintética (Figura 4b); esto puede ayudar a la difusión del CO₂ hacia los cloroplastos.

^{Bosselaers (1983)} abordó la posible asociación entre la promoción de la fotosíntesis por la citoquinina y el aumento de la difusión de gases en su estudio sobre los cambios estructurales de las hojas de Phaseolus como consecuencia de la aplicación de kinetina o BAP. Sin embargo, en ese estudio se concluyó que los cambios debidos a la aplicación de citoquinina parecían tener poco impacto en la resistencia a la difusión de las hojas. No obstante, hay que considerar que en el estudio de Booselaers las plantas no estaban restringidas radicalmente, y que se aplicaron altas dosis de hormonas durante cinco días consecutivos, lo cual pudo haber aumentado la concentración endógena de citoquinina por encima de los niveles óptimos.

En cualquier caso, existe interés en estudiar el impacto de la anatomía foliar en la difusión de CO₂ (^{Evans, Kaldenhoff, Genty, & Terashima, 2009}; ^{Kaldenhoff, 2012}; ^{Han et al., 2018}; ^{Ren, Weraduwage, & Sharkey, 2019}; ^{Roig-Oliver et al., 2020}). Un trabajo reciente de Rhodospatha oblongata sometida a ambientes lumínicos contrastantes enfatiza el impacto de las hojas más gruesas, con parénquima esponjoso más grande y mayores espacios intercelulares, en la tasa fotosintética máxima (^{Mantuano, Ornellas, Aidar, & Mantovani, 2021}). Por ello, el papel de la citoquinina en los cambios de la anatomía foliar asociados a la capacidad fotosintética merece más estudios.

En condiciones de irradiación no limitante, la tasa fotosintética neta de las plantas C₃ suele estar limitada por el CO₂ (^{Sage & Coleman, 2001}), condición que, probablemente, ha impulsado la evolución de las plantas (^{Beerling, 2012}). Décadas de estudios centrados en el efecto del enriquecimiento de CO₂ en aire libre en la biología de las plantas han puesto de manifiesto que las plantas C₃, a diferencia de las C₄, aumentan su tasa fotosintética y la producción de biomasa (^{Long, Ainsworth, Leakey, Nösberger, & Ort, 2006}; ^{Donohue, Roderick, McVicar, & Farquhar, 2013}). En lechuga, el enriquecimiento de CO₂ (de 355 a 800-900 ppm [^{Mortensen, 1994}], de 400 a 800 ppm [^{Kitaya, Niu, Kozai, & Ohashi, 1998}] y de 200 a 1,000 ppm [^{Becker & Kläring, 2016]} ) ha mostrado una promoción de la acumulación de masa seca en la parte aérea, que va del 18 al 100 %, dependiendo de los experimentos.

La posibilidad de que la reversión de la restricción radical por citoquinina se vea mediada por cambios en la vía de difusión del CO₂ hacia los cloroplastos es coherente con el hecho de que varias respuestas de las plantas observadas en el presente trabajo son similares a las reportadas en plantas de lechuga cultivadas bajo enriquecimiento de CO₂, como el aumento del grosor de la hoja (^{Giri, Armstrong, & Rajashekar, 2016}), el aumento de la concentración de azúcar (^{Becker & Kläring, 2016}) y la disminución del área foliar específica (^{Kitaya et al., 1998}), siendo esta última una variable que depende tanto del grosor de la hoja como de la concentración de metabolitos. En el presente trabajo, se encontró una correlación significativa entre la concentración de azúcar y el grosor de la hoja (Figura 6d), lo cual podría estar asociado al agrandamiento de las células del mesófilo impulsado por efecto osmótico. Además, los aumentos en la concentración de azúcar y en el grosor de la hoja son características de calidad deseables en la lechuga, especialmente porque contribuyen a una vida poscosecha prolongada (^{Zhang et al., 2007}; ^{Lin et al., 2013}).

La lechuga es un cultivo hortícola importante en todo el mundo, y maximizar tanto la producción como la calidad es un objetivo central que se debe alcanzar. Los sistemas de producción modernos pueden imponer condiciones estresantes que deben ser superadas para lograr este objetivo (^{Rao, Laxman, & Shivashankara, 2016}; ^{Wien & Stützel, 2020}). Se ha sugerido el uso de diferentes bioestimulantes como mitigadores de estrés abiótico, incluyendo las restricciones radicales durante el almácigo, y muchos de estos compuestos contienen hormonas vegetales, como la auxina y la citoquinina (^{Bulgari, Franzoni, & Ferrante, 2019}; ^{Di Benedetto et al., 2020a}, ^2020b).

El presente trabajo muestra que la producción y ciertos atributos de la lechuga se pueden incrementar en plantas con raíces restringidas cuando se someten a una aplicación exógena única de citoquinina. Además, dichas respuestas se pueden asociar con ciertas características anatómicas foliares, las cuales pueden mejorar la difusión de CO₂ y, por lo tanto, incrementar la capacidad fotosintética de las plantas.

Conclusiones

La asimilación de carbono de las plántulas de lechuga cultivadas en celdas pequeñas se vio potenciada por la aplicación exógena de BAP. Este efecto se asoció a cambios en la anatomía foliar, como el aumento de la proporción de espacios de aire libre y del grosor de la hoja, que en conjunto pueden favorecer la difusión de CO₂ hacia los cloroplastos. Por el contrario, a pesar de suposiciones previas, no se observaron cambios en la concentración de clorofila, mientras que el aumento de la concentración de nitrógeno en las hojas por unidad de superficie foliar pareció desempeñar un papel relativamente menor. Se encontró una correlación significativa entre el aumento de la concentración de azúcar impulsados por el BAP y el grosor de las hojas, lo cual puede representar características de calidad deseables en esta especie.

En resumen, el presente trabajo muestra que tanto la producción, como ciertos atributos de calidad de la lechuga, pueden ser promovidos en plantas con raíces restringidas cuando son sometidas a una aplicación exógena de citoquinina, en asociación con cambios anatómicos en las hojas que podrían potenciar la capacidad fotosintética de la planta.