Prueba de germinación y fitotoxicidad en semillas de girasol

El ensayo de germinación de semillas de girasol se realizó en el Laboratorio de Gestión Agroambiental de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa - Perú (LGA-UNSA). Para determinar su viabilidad, se depositaron 10 semillas sobre una bandeja de plástico con papel absorbente (^{Dos-Santos et al., 2017}). El ensayo se realizó por triplicado, y cada bandeja se regó con agua. El número de semillas germinadas se registró a los 10 días, y los resultados se expresaron en porcentaje de semillas germinadas.

La prueba de fitotoxicidad en las semillas de girasol se efectuó en el mismo laboratorio, y se realizó con la finalidad de verificar su viabilidad al ser expuestas a soluciones de Pb en concentraciones de 35, 70 y 105 ppm aplicadas mediante riego. Como fuente de Pb se utilizó una disolución de Pb(NO₃)₂ para definir la concentración más apropiada para los tratamientos. En esta prueba, los niveles de Pb estuvieron relacionados con los estándares de calidad ambiental (ECA) para suelos agrícolas establecidos en la normativa de Perú (^{Ministerio del Ambiente del Perú [MINAM], 2017}). Para la prueba, se depositaron 10 semillas de girasol en una bandeja de plástico con papel absorbente (^{Dos-Santos et al., 2017}) y la disolución de Pb correspondiente. El ensayo se realizó por triplicado por cada concentración.

Análisis inicial de suelo y vermicompost

El suelo agrícola expuesto a remediación se recolectó en terrenos adyacentes a una zona de alto tránsito vehicular denominada vía de evitamiento de Arequipa - Perú (coordenadas UTM WGS-84 Norte: 8188920 y Este: 223859). La concentración de Pb en la muestra inicial de suelo se obtuvo en el Laboratorio de Investigación y Servicios (LABINVSERV) de la UNSA con un espectrofotómetro de absorción atómica (Analyst™ 300, Perkin Elmer®). Las propiedades complementarias de la muestra de suelo y el análisis del vermicompost se determinaron en el Laboratorio de Análisis de Suelos, Aguas y Semillas de la Estación Experimental Agraria (LAS-EEA-INIA, Arequipa) a partir de las metodologías propuestas por ^{Bazán-Tapia (2017)}: Walkley-Black (materia orgánica), potenciómetro (pH), conductímetro (conductividad eléctrica [CE]), saturación con acetato de amonio (capacidad de intercambio catiónico [CIC]), micro Kjeldahl (N total), olsen modificado (P disponible) y espectrofotometría (K cambiable). Las partículas de arena, limo y arcilla en el suelo se determinaron con un hidrómetro, la textura se obtuvo con el triángulo textural, y la densidad aparente se determinó relacionando la masa seca y volumen de suelo (^{Bazán-Tapia, 2017}).

Desarrollo de la investigación

El estudio se llevó a cabo en el invernadero de propagación de plantas de la Facultad de Agronomía de la UNSA. Para ello, se utilizaron 12 macetas, cada una con 5 kg de suelo agrícola contaminado con 105 ppm de Pb en forma de Pb(NO₃)₂. Dicha concentración se determinó a partir de la prueba de fitotoxicidad. La solución de Pb se aplicó mediante riego localizado, con un periodo de incubación de 15 días. La incorporación de vermicompost fue de 0.25 kg por cada tratamiento (5 % con base al peso del suelo agrícola). Posteriormente, se colocaron tres semillas de girasol por tratamiento. Durante el desarrollo de la planta de girasol, se aplicó riego dirigido y se instaló un recipiente para colectar los lixiviados del drenaje.

Los tratamientos estudiados fueron: T1 (suelo con Pb, vermicompost y girasol), T2 (suelo con Pb y vermicompost), T3 (suelo con Pb y girasol) y T4 (suelo con Pb).

Evaluaciones

Análisis estadístico

Para estudiar el efecto del girasol y el vermicompost en la recuperación de Pb en un suelo agrícola contaminado artificialmente, se estableció un diseño experimental completamente al azar con cuatro tratamientos y tres repeticiones, lo cual generó doce unidades experimentales. La unidad experimental fue una maceta con suelo contaminado. Los valores obtenidos se sometieron a un análisis de varianza y una prueba de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05). Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 22 (^{International Business Machines [IBM], 2013}).

Germinación de semillas de girasol

Después de 10 días, se obtuvo el 96.7 ± 0.47 % de germinación en las semillas de girasol, lo cual demostró su alta viabilidad para continuar su desarrollo. Se consideró una semilla germinada cuando hubo presencia de radícula con una longitud mínima de 2 mm. De acuerdo con ^{Dos-Santos et al. (2017)}, la germinación de semillas de girasol inicia 4 días después de la siembra y termina a los 13 días, tal como sucedió en esta investigación. A los 15 días, todas las semillas habían germinado.

Fitotoxicidad en semillas de girasol

La prueba de fitotoxicidad se desarrolló para determinar la tolerancia de las semillas al Pb (35, 70 y 105 ppm). La tolerancia al Pb se determinó mediante la capacidad de las semillas para germinar. Los resultados mostraron un alto porcentaje de germinación (90 %) a los 10 días, incluso con la concentración de Pb más alta (105 ppm) (Cuadro 1). En todos los niveles de Pb, a los 15 días se logró un 100 % de germinación. Estos resultados permitieron elegir la dosis de 105 ppm de Pb para su aplicación al suelo como parte de los tratamientos.

De acuerdo con los resultados de fitotoxicidad, 105 ppm no afectan la germinación de semillas de girasol. Esto concuerda con lo reportado por ^{Gutiérrez-Espinoza et al. (2011)}, quienes evaluaron el efecto de diferentes concentraciones de Pb(NO₂)₃ (de 25 hasta 400 mg·L^-1) sobre la germinación de semillas de girasol y encontraron que las semillas germinaron en todos los tratamientos. Estos autores argumentan que el girasol puede ser empleado para la fitorremediación de Pb, tal como se señala en otras investigaciones (^{Ahmadreza et al., 2020}; ^{Gómez et al., 2018}; ^{Moslehi et al., 2019}; ^{Munive et al., 2020}; ^{Nehnevajova et al., 2005}; ^{Ortiz-Cano et al., 2009}; ^{Zhao et al., 2019}).

Caracterización inicial del suelo y vermicompost

El suelo presentó una concentración de Pb inicial de 16.05 ppm (Cuadro 2), el cual se contaminó con 105 ppm de Pb, resultando en una concentración de 121.05 ppm de Pb (nivel inicial de Pb en los tratamientos). Dicho valor supera el ECA establecido para suelos de zonas agrícolas, que es de 70 ppm (^{MINAM, 2017}).

El suelo presentaba textura franco-arenosa, la cual facilita el desarrollo radicular del girasol. La presencia de materia orgánica fue moderada, por lo que requiere la incorporación de una fuente de materia orgánica, como el vermicompost, para mejorar el proceso de remediación del Pb (^{Ortiz-Bernad et al., 2007}; ^{Volke-Sepúlveda & Velasco-Trejo, 2002}). El suelo tuvo un pH inicial cercano a la neutralidad, y no presentó problemas de salinidad. Aunque su CIC fue limitada, ésta debería incrementar al incorporar el vermicompost (^{Munive et al., 2020}). El nivel inicial de nitrógeno fue deficiente, pero la mineralización de la materia orgánica incorporada en forma de vermicompost incrementa su contenido (^{Vázquez & Loli, 2018}). La composición de vermicompost aplicado ofrece buen nivel de N, y los valores de P y K fueron suficientes para asegurar el crecimiento del girasol.

En cuanto a la caracterización del vermicompost, se detectó un buen contenido de materia orgánica (Cuadro 2). La relación carbono-nitrógeno fue baja, lo cual facilitó el proceso subsecuente de humificación del medio. La CIC fue elevada en el material, con buenos aportes de nutrientes (N, P, K) para la planta remediadora. La materia orgánica y la CIC favorecen el intercambio de elementos pesados, y hacen viable el proceso de biorremediación de suelos contaminados con elementos pesados (^{Ortiz-Bernad et al., 2007}; ^{Vázquez & Loli, 2018}).

Plomo en el suelo después del proceso de remediación

El T2 (suelo con Pb y vermicompost) presentó el mayor nivel de Pb recuperado (Cuadro 3), lo cual resultó en el menor contenido de Pb remanente en el suelo, con diferencia estadística significativa respecto a los demás tratamientos.

En el suelo, el Pb se encuentra, generalmente, en forma iónica, óxidos e hidróxidos (^{Jiménez et al., 2017}). Su movilidad en el suelo es limitada, por lo que se acumula en la parte superficial. Dicha movilidad depende del contenido de materia orgánica, la CIC, entre otras características del suelo (^{Karande et al., 2019}). Al reaccionar el Pb puede formar compuestos insolubles en forma de fosfatos, carbonatos e hidróxidos de plomo (^{Hettiarachchi & Pierzynski, 2004}).

En este trabajo, fue evidente que el uso de vermicompost facilitó la recuperación de Pb. Dicho comportamiento está asociado, principalmente, al alto contenido de materia orgánica (20.63 %) y a la buena CIC (54.738 cmol·kg^-1). La materia orgánica contenida en el vermicompost es transformada a sustancias húmicas, especialmente ácidos húmicos, durante el proceso de descomposición y mineralización mediante reacciones de resíntesis y polimerización. La recuperación del suelo a elementos pesados, como el Pb, ha sido atribuida a la acción de los ácidos húmicos (^{Rubenacker et al., 2011}). Según ^{Zhang et al. (2019)}, el vermicompost tiene la habilidad de formar complejos organo-metálicos entre el Pb y las sustancias húmicas. Por ello, se cree que la formación de grupos funcionales (-COOH) actuó como centro activo para inmovilizar el Pb. Los resultados obtenidos son similares a los publicados por ^{Carrillo-González, Maldonado-Torres, González-Chávez, y Cruz-Díaz (2014)}, quienes encontraron que la disponibilidad de Pb en un suelo contaminado disminuyó con la adición de vermicompost, siendo inversamente proporcional a la dosis aplicada; esto se asoció con la formación y precipitación de óxido de Pb.

La alta CIC que presentó el vermicompost mejoró la formación de complejos organo-metálicos de Pb y grupos funcionales. De acuerdo con ^{Yuvaraj et al. (2021)}, este efecto se debe a que las sustancias húmicas originadas por el vermicompost viabilizan el proceso de intercambio catiónico de metales pesados fraccionados en los suelos contaminados.

En cuanto a la eficiencia de recuperación, en el Cuadro 4 se puede observar que el T2 tuvo el mejor desempeño en la recuperación de Pb del suelo; aunque todos los tratamientos removieron el Pb por debajo del ECA para suelos agrícolas (70 ppm). Por lo tanto, se dedujo que todos los tratamientos tuvieron buen desempeño en la remoción de Pb.

La mejor eficiencia de recuperación, evidenciada en el T2, permite inferir que la remoción de Pb asistida con enmiendas, como el vermicompost, es un método eficaz para reducir la biodisponibilidad de este elemento tóxico del suelo (^{Branzini & Zubillaga, 2010}); esto debido a su elevada estabilidad, contenido de fibra bacteriana y nutrientes asimilables (^{Manaf et al., 2009}). La incorporación de vermicompost favorece la inmovilización de contaminantes al mejorar la formación de complejos coloidales y la actividad biológica del suelo (^{Carrillo-González et al., 2014}). ^{Obaji et al. (2017)} señalan que el vermicompost, usado como enmienda de suelos, presenta un alto potencial en la remoción de Pb por su naturaleza persistente y formación de sitios activos, los cuales favorecen la sorción de metales pesados.

El desempeño del T1 reveló que el girasol, complementado con vermicompost, también es eficiente en la recuperación de Pb, al removerlo por debajo del ECA. ^{Jun et al. (2020)} mencionan que el Pb puede ingresar a la planta mediante las raíces y concentrarse en la parte foliar; por ello, se debe favorecer el crecimiento y desarrollo de la planta durante el proceso de fitorremediación (^{Rostami & Azhdarpoor, 2019}). ^{Zhang et al. (2019)} sostienen que la fitorremediación debe ser asistida con enmiendas al suelo, como el vermicompost, para facilitar la bioacumulación de metales en los tejidos de las plantas. La incorporación de vermicompost al suelo facilita el establecimiento de plantas de girasol para remover el Pb debido a que favorece la materia orgánica, la CIC y la actividad biológica del suelo (^{Branzini & Zubillaga, 2010}).

Comportamiento de plantas de girasol en la remediación de suelo contaminado

Con relación al FB de la parte aérea y raíces de las plantas de girasol, el Cuadro 5 indica que ambos tratamientos (T1 y T3) mostraron valores < 1, comportándose como una especie vegetal exclusora (^{Audet & Charest, 2007}). Sin embargo, el T1 registró valores menores que el T3 debido al uso de vermicompost, el cual favorece la bioconcentración de Pb en la parte aérea y raíces de girasol. Este comportamiento concuerda con lo observado por ^{Malkowski, Kurtyka, Kita, y Karcz (2005)}, quienes indican que el Pb se acumula en el sistema radicular en forma de fosfato de Pb, lo cual estimula el engrosamiento de la pared celular.

Algunas especies vegetales pueden extraer y acumular Pb en la raíz, el tallo y las hojas para estabilizarlo. Estas especies forman compuestos orgánicos y encierran el Pb en la pared celular y la vacuola (^{Gutiérrez-Espinoza et al., 2011}). El girasol tiene alta capacidad de extracción y tolerancia al Pb debido a que desarrolla mecanismos para mejorar la actividad de las enzimas antioxidantes, la deposición de Pb en partes no activas de la planta y la estimulación de osmolitos vegetales (^{Moslehi et al., 2019}).

^{Marmiroli, Antonioli, Maestri, y Marmiroli (2005)} sostienen que parte del flujo de los metales pesados, como el Pb, puede quedar retenido en la pared celular por la estructura de la lignina y la celulosa. Las especies vegetales pueden disminuir la toxicidad de metales de su entorno al adoptar diferentes habilidades para resistir, como la exclusión del metal, lo cual limita su traslado a la parte aérea, o la acumulación del metal en la parte foliar en formas no tóxicas (^{Alderete-Suarez, Valles-Aragón, Canales-Reyes, Peralta-Pérez, & Orrantia-Borunda, 2019}).

El FT del T1 fue < 1 (Cuadro 6), lo cual revela que las raíces de la planta de girasol, en presencia de vermicompost, fomentan el mecanismo de fitoestabilización del Pb (^{Audet & Charest, 2007}; ^{Deng et al., 2004}). De esta forma, el Pb queda retenido en el sistema radicular del girasol con ayuda del vermicompost, cuya función es capturar Pb en el complejo arcillo húmico del suelo (^{Branzini & Zubillaga, 2010}; ^{Carrillo-González et al., 2014}). El Pb en estado iónico ingresa a la planta a través de las raíces mediante difusión pasiva, y una vez absorbido por la planta, la mayor parte queda retenido en las raíces mediante enlaces de intercambio iónico en la pared celular (^{Alvarado, Dasgupta-Schubert, Ambriz, Sánchez-Yañez, & Villegas, 2011}).

Los resultados del T3 registraron un FT > 1, lo cual advierte que la planta de girasol en ausencia de vermicompost mejora la traslocación de Pb desde las raíces hacia la parte aérea de la planta. En este caso, al no existir vermicompost, se impulsa el mecanismo de fitoextracción de Pb de la planta de girasol (^{Audet & Charest, 2007}; ^{Deng et al., 2004}; ^{Ortiz-Cano et al., 2009}), y concentra el Pb en la parte aérea de la planta (^{Nehnevajova et al., 2005}).

^{Munive et al. (2020)} obtuvieron resultados similares (FB de 0.08 y FT de 1.2) al utilizar vermicompost y girasol como planta fitorremediadora de Pb. ^{Alaboudi, Ahmed, y Brodie (2018)} demostraron que el girasol, al incrementar su biomasa, fue capaz de remover sustancias tóxicas de suelos contaminados por su capacidad de adaptación a ambientes adversos.

Finalmente, se realizó un análisis de suelo en el T2 (suelo con Pb y vermicompost) al culminar el proceso de remediación; esto debido a que dicho tratamiento logró la mayor eficiencia en la recuperación de Pb. El análisis reportó una textura franco-arenosa, sin variación con respecto a la textura inicial del suelo. La materia orgánica incrementó de 3.91 a 4.12 %, lo cual está asociado con la incorporación de materia orgánica a través de vermicompost. El pH se modificó ligeramente de 6.78 a 6.93, y la salinidad aumentó hasta 3.11 dS·m^-1, aunque este valor no implica problemas de salinidad. La CIC pasó de 9.72 a 17.872 cmol·kg^-1 por el incremento de materia orgánica. El N total, el P disponible y el K intercambiable presentaron valores de 0.47 %, 16.250 ppm y 218.733 ppm, respectivamente, que fueron mayores a los identificados al inicio de proceso de remediación y están asociados con procesos de descomposición de la materia orgánica del suelo y con el vermicompost, que a través de su mineralización se liberaron estos nutrientes. En consecuencia, el T2 no solo logró ser el más eficiente en la recuperación de Pb, sino que también favoreció las propiedades del suelo.