Material vegetal, ubicación del experimento y diseño experimental

Se utilizaron semillas de tres variedades de C. arabica (Geisha, Oro Azteca y Marsellesa), las cuales se obtuvieron del Banco Nacional de Germoplasma de Café de la Universidad Autónoma Chapingo (UACh) en el Centro Regional Universitario Oriente (CRUO), ubicado en Huatusco, Veracruz, México (19° 10’ 27” latitud norte y 96° 57’ 50” longitud oeste, a 1,345 m s. n. m.). La irradiación de la semilla se realizó en el Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (ININ) ubicado en Salazar, Estado de México, México. El irradiador utilizado fue el Transelektro LGI-01, con una razón de dosis de 752.76 Gy·h^-1. Las dosis de rayos gamma de ⁶⁰Co empleadas fueron 0, 100, 200, 300, 400 y 500 Gy, sobre 700 semillas de cada variedad cosechadas en el ciclo 2017-2018, las cuales presentaban una humedad de 10 %. Las semillas testigo de cada material genético no se irradiaron.

Las semillas irradiadas se establecieron en un invernadero con cubierta de vidrio y estructura de acero con ventilación lateral los días 15 y 16 de mayo de 2018, en Montecillo, Texcoco, Estado de México. La temperatura promedio fue de 29.0 °C y la humedad relativa de 27.10 %. La siembra de las semillas se realizó de forma manual en camas de madera (1.5 x 3 x .25 m) con tierra. Se trazaron surcos a distancias de 5 cm entre líneas y 1.5 cm entre semillas. Las camas se revisaron regularmente por requerimientos hídricos.

El experimento se estableció conforme a un diseño factorial completamente al azar con dos factores (variedad, con tres niveles, y dosis de irradiación, con seis niveles), lo cual resultó en 18 tratamientos con tres repeticiones (225 semillas por repetición).

Parámetros evaluados

Para determinar el efecto de los tratamientos, las variables evaluadas fueron: germinación (%), supervivencia (%) y variables morfológicas de cada variedad. El registro de datos para la germinación se realizó a los 20 días después de la siembra (dds). La supervivencia y el resto de las variables se determinaron a los 120 dds. Para las variables morfológicas, se seleccionaron 10 plantas al azar por unidad experimental, en las cuales se midió AP (cm), APPH (cm), DT (mm; a 1 cm de distancia entre la base de la raíz y la primera hoja de la planta) y AF (cm²; con el programa ImageJ).

Análisis estadístico

El modelo estadístico empleado fue Y _ijk = µ + A _i +Bj + AB _ij + ɛ _ijk ; donde Y _ijk es el valor de la variable respuesta correspondiente a la repetición k del nivel i de A (variedad) al nivel j de B (dosis [Gy]), µ es la media general, A _i es el efecto del nivel i de A, B _i es el efecto del nivel j de B, AB _ij es la interacción AxB (correspondiente al nivel i de A y nivel j de B) y ε _ijk es el error experimental correspondiente a la repetición k del nivel i de A al nivel j de B. Mediante el paquete estadístico SAS versión 9.4 (^{SAS Institute, 2002}), se realizó un análisis de varianza para cada variable y la comparación de medias de los tratamientos mediante la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). Los datos obtenidos del porcentaje de supervivencia se utilizaron para determinar la dosis letal media (DL₅₀) de las variedades, la cual se estimó mediante un modelo de regresión lineal simple.

Porcentaje de germinación y supervivencia de las plantas

Las tres variedades mostraron un efecto negativo en la germinación a partir de la dosis de 100 Gy (Figura 1). Se observó un decremento de 60 % en la germinación de la variedad Geisha con respecto a su testigo, así como una disminución significativa a partir de las dosis de 200 y 400 Gy para las variedades Oro Azteca y Marsellesa, respectivamente. Estos resultados concuerdan con los reportados por ^{Quintana et al. (2019)}, quienes observaron una disminución drástica en la germinación de semillas de café variedad Típica con las dosis de 100 y 150 Gy. En otras especies, ^{Kumar, Nepolean, y Gopalan (2003)} demostraron que la germinación de semillas de Phaseolus lunatus disminuyó con el aumento de la irradiación gamma en un rango de 200-1,000 Gy. ^{Cheema y Atta (2003)} demostraron que la germinación de semillas de tres variedades diferentes de Oryza sativa redujo con el aumento de la dosis de irradiación. Por lo tanto, la exposición a dosis altas de radiación gamma suele inhibir la germinación de semillas de gimnospermas y angiospermas (^{Thapa, 2004}).

Figura 1 Efecto de la radiación gamma (⁶⁰Co) sobre el porcentaje de germinación de las variedades Geisha, Oro Azteca y Marsellesa de C. arabica. ^zBarras con la misma letra no difieren estadísticamente (Tukey, P ≤ 0.05). 

El porcentaje de supervivencia se vio significativamente afectado (P ≤ 0.05) por la radiación gamma (Figura 2). Hubo una disminución significativa a partir de la dosis de 100 Gy en las tres variedades en comparación con sus respectivos testigos. Una tendencia similar fue descrita por ^{Ramírez, González, Camejo, Zaldívar, y Fernández (2006)}, quienes observaron que dosis mayores a 200 Gy disminuyeron el porcentaje de supervivencia de plántulas de S. lycopersicum L. Estos autores observaron que, aunque se produjo emisión de la radícula y aparición de los cotiledones, a los pocos días de germinadas y con crecimiento lento, las plántulas finalmente murieron. Del mismo modo, se demostró que con dosis de 600 Gy en semillas de Jatropha curcas L., la supervivencia de las plantas disminuyó significativamente (^{Sonsgri, Suriharn, Sanitchon, Srisawangwong, & Kesmala, 2011}).

Figura 2 Efecto de la radiación gamma (⁶⁰Co) sobre el porcentaje de supervivencia de las variedades Geisha, Oro Azteca y Marsellesa de C. arabica. ^zBarras con la misma letra no difieren estadísticamente (Tukey, P ≤ 0.05). 

Un indicador general que define el rango de dosis medias de radiaciones ionizantes (RI) es un período de activación a corto plazo que precede al inicio de la inhibición de los procesos fisiológicos. Las dosis medias de RI varían de 20 a 100 Gy (irradiación de semillas) o de 5 a 50-70 Gy (irradiación de partes vegetativas de las plantas); por lo tanto, dosis por encima de estos niveles se denominan altas (^{Gudkov, Grinberga, Sukhova, & Vodeneeva, 2019}). En términos generales, los agentes mutagénicos utilizados para inducir cambios hereditarios se dividen en físicos y químicos, de los cuales, las RI constituyen los mutágenos físicos más utilizados, y sus componentes ionizantes dentro del espectro electromagnético incluyen a los rayos cósmicos, rayos gamma (γ) y rayos X. Debido a esto, los rayos gamma se usan comúnmente como mutágenos físicos, los cuales se emiten por el proceso de descomposición de los radioisótopos de cobalto (⁶⁰Co) o cesio (¹³⁷Cs) (^{Mba, 2013}).

En el presente estudio, el uso de diferentes dosis de radiación gamma con ⁶⁰Co mostró que las semillas de C. arabica de las variedades Geisha, Oro Azteca y Marsellesa son muy susceptibles a los efectos de este agente mutagénico en dosis altas. Para las variedades Geisha y Oro Azteca, a partir de la dosis de 200 Gy el efecto fue letal. La disminución de la germinación y la casi nula supervivencia en las dosis altas de radiación se puede atribuir a alteraciones a nivel celular (causadas a nivel fisiológico o bioquímico), incluyendo daños en cromosomas.

El impacto de la RI en una planta depende de la especie, la variedad, la etapa de desarrollo y el estado fisiológico de la planta (^{Kim et al., 2011}). Cuando las dosis recibidas por las plantas exceden los límites indicados, su crecimiento y desarrollo se inhiben (^{Gudkov et al., 2019}). La RI también puede dañar el ADN indirectamente a través de los productos de la radiólisis, lo cual provoca una cascada de moléculas reactivas. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) resultantes de la radiólisis del agua producen efectos negativos a altas dosis, ya que se producen concentraciones inusuales de ROS en las células, lo cual provoca la alteración del equilibrio redox celular (^{Caplin & Willey, 2018}). La producción o sobreproducción de •OH y otras ROS desencadena, inmediatamente, sistemas de defensa contra el estrés oxidativo al modular las actividades de las enzimas desintoxicantes (por ejemplo: peroxidasas, ascorbato peroxidasa, superóxido dismutasa y glutatión reductasa) (^{Esnault, Legue, & Chenal, 2010}). Estos radicales no matan las células, sino que producen anormalidades genéticas (^{Koyama et al., 1998}).

Altura de planta, altura al primer par de hojas y diámetro de tallo

En el análisis de varianza factorial se detectó significancia estadística en los factores variedad y dosis, donde al menos un nivel de cada factor tuvo un efecto significativo en las variables AP y DT (Cuadro 1). La AP, en la variedad Marsellesa, se vio afectada significativamente (P ≤ 0.05) por la irradiación gamma con la dosis de 100 Gy, aunque esta variedad fue la única que presentó respuesta a la dosis de 400 Gy (Cuadro 2). En las variables APPH y AF no se encontraron diferencias significativas entre variedad y dosis con respecto al testigo.

Los resultados obtenidos coinciden con los reportados por ^{Quintana et al. (2019)}, quienes observaron una disminución significativa en la AP y DT en plantas de café de la variedad Típica irradiadas con 100 Gy. Por otro lado, ^{Dada et al. (2018)} demostraron que en plantas de C. arabica de las variedades Mundo Novo, Kents y Geisha, irradiadas con 25 Gy, hubo una reducción significativa en la AP, y en variedad Kents el efecto fue letal. ^{Marcu, Damian, Cosma, y Cristea (2013)} reportan que en semillas de Zea mays L., con dosis de 200 Gy, hubo decremento en la longitud de brotes y raíces. Asimismo, en semillas de Glycine max L. Merrill, ^{Alikamanoglu, Yaycili, y Sen (2011)} observaron que con dosis de 200 Gy disminuyó la longitud de la planta.

Área foliar y determinación de DL₅₀

Las tres variedades analizadas no mostraron diferencias significativas en el AF con ninguno de los tratamientos de radiación gamma (Cuadro 2). En semillas de Phaseolus vulgaris L., ^{Arena, de Micco, y de Maio (2014)} reportan que con dosis altas disminuye el AF. En plantas de café de la variedad Típica, ^{Quintana et al. (2019)} observaron una reducción significativa en el largo y ancho de la hoja a partir de la dosis de 100 Gy. ^{Dada et al. (2018)} demostraron que en plantas de café de las variedades Mundo Novo, Kents y Geisha, irradiadas con 25 Gy, hubo un decremento significativo en el número de hojas.

En café, la irradiación gamma se ha utilizado principalmente para eliminar insectos en granos almacenados (^{Ahmad, Tharappan, & Bongirwar, 2003}). Por lo tanto, en experimentos con semillas se debe estimar, previamente, la DL₅₀ y establecer un rango adecuado de exposición a la radiación gamma. La DL₅₀ corresponde a la cantidad de radiación absorbida con la cual sobrevive 50 % de la población que ha sido expuesta; en este rango, se favorece la aparición de mutaciones útiles en los programas de mejoramiento genético (^{Morela, González, & Castro, 2002}).

^{Bolívar-González, Valdez-Melara, y Gatica-Arias (2018)} realizaron una investigación relacionada con la generación de variabilidad genética en café por mutagénesis química en cultivos de suspensión embriogénica de C. arabica var. Catuaí, incubados a diferentes dosis de azida de sodio (NaN₃) y etilmetanosulfonato (EMS). Estos autores demostraron que la DL₅₀ para NaN₃ fue de 5 mM durante 15 min y para el EMS fue de 185.2 mM durante 120 min. También observaron una reducción significativa de la viabilidad celular a medida que aumentaba la concentración de NaN₃ y EMS.

En el presente estudio, la DL₅₀ para supervivencia de plantas de C. arabica var. Geisha se estimó en 70 Gy, para Marsellesa fue de 85 Gy y para Oro Azteca fue de 90 Gy. En razón de lo anterior, dosis de irradiación gamma entre 70 y 100 Gy pueden inducir variación genética en C. arabica. Por lo tanto, este estudio es un avance en el desarrollo de protocolos para generar y mejorar genéticamente las variedades de café arábica para que sean resistentes a diferentes tipos de estrés abiótico, así como para tolerancia a plagas y enfermedades, en especial para la roya naranja (Hemileia vastatrix) de la hoja del café.