Material vegetal

Se utilizaron semillas de chile serrano var. Camino Real F1 (Harris Moran^®, Seed Company). Las semillas se lavaron con agua corriente para eliminar la cubierta de fungicida y se sembraron en tres charolas plásticas de germinación con 72 cavidades (6×12, una semilla por cavidad); para ello, se utilizó como sustrato una mezcla de arena-turba (Mix No. 3, Sunshine^®) en proporción 1:1 (v/v), esterilizada a 120 °C durante 6 h a una presión de 1.05 kg·cm^-2. Cada charola se colocó dentro de una base y se cubrió con un domo de plástico transparente, luego se colocaron en un cuarto de incubación a 21 ± 1 °C con un fotoperiodo de 16/8 h (luz/oscuridad). El riego se realizó con agua corriente una vez por semana.

Material microbiológico

Se utilizaron actinobacterias de la colección de microorganismos del Laboratorio de Fitopatología de la Unidad de Biotecnología Vegetal del CIATEJ. Las actinobacterias utilizadas fueron ABV38, ABV39 y ABV45, aisladas previamente de la rizosfera de Agave spp. (^{Rincón-Enríquez, López-Pérez, & Quiñones-Aguilar, 2014}). En pruebas anteriores, dichas actinobacterias inhibieron el crecimiento in vitro de Phytophthora capsici CH11 (PC CH11) (^{Reyes-Tena, Fernández-Pavia, Rincón-Enríquez, López-Pérez, & Quiñones-Aguilar, 2014}). Los aislados actinobacterianos se cultivaron de manera rutinaria en medio de cultivo agar papa-dextrosa (PDA) con pH 7 (NaOH 3 M) y se incubaron a 21 ± 1 °C en oscuridad durante 15 días. La cepa de PC CH11 se cultivó en agar V8 clarificado (50 mL·L^-1 de jugo V8, 0.5 g·L^-1 de CaCO₃ y 15 g·L^-1 de agar) e incubó a 21 ± 1 °C en oscuridad durante 10 días.

Bioensayo de actividad antagónica dual

Las actinobacterias ABV38, ABV39 y ABV45 se probaron para determinar su actividad en la inhibición del crecimiento in vitro de PC CH11 en ensayos de confrontación dual. Un disco de un aislado actinobacteriano de 6 mm de diámetro de 15 días de crecimiento se depositó a 1 cm del borde de la caja Petri con medio de cultivo PDA. Las cajas Petri se pre-incubaron antes de inocular el oomiceto fitopatógeno durante 0, 3 y 5 días a 21 ± 1 °C en oscuridad (^{Evangelista-Martínez, 2014}). Después del tiempo de pre-incubación, se depositó un disco de PC CH11 de 6 mm de diámetro (10 días de crecimiento) a 1 cm del borde de la caja Petri y enfrente del disco con actinobacteria. Cajas inoculadas solo con PC CH11 a 1 cm del borde sirvieron como testigo. La actividad antagónica se determinó a los 24 días después de la inoculación a partir del área de inhibición del crecimiento de PC CH11. El crecimiento de PC CH11 en las cajas testigo fue en toda la superficie del medio de cultivo. Para la evaluación, se estableció un diseño experimental completamente al azar con tres repeticiones, en donde se evaluaron tres tratamientos por actinobacteria, correspondientes a los tiempos de pre-incubación (0, 3 y 5 días).

Producción de sobrenadante del caldo de cultivo

Un disco de cada actinobacteria en PDA de 6 mm de diámetro se inoculó de manera independiente en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 125 mL de medio de cultivo (caldo de papa-dextrosa, pH 7) previamente esterilizado (121 °C a 1.05 kg·cm^-2 durante 20 min). Los matraces se colocaron en un incubador orbital a 30 °C y 200 rpm durante 20 días. Se inocularon cuatro matraces por cada actinobacteria. Después de la incubación, el caldo de cultivo se centrifugó a 13,000 rpm durante 15 min. El sobrenadante del caldo de cultivo (SNC) de cada actinobacteria (no filtrado) se recuperó y almacenó a 4 °C hasta su uso.

Producción de zoosporas de Phytophthora capsici CH11

La producción de zoosporas se realizó mediante la técnica de ^{Ristaino (1990)}, con ligeras modificaciones. Se utilizaron cultivos de PC CH11 de 10 días de crecimiento en agar V8 clarificado (50 mL·L^-1 de jugo V8, 0.5 g·L^-1 de CaCO₃ y 15 g·L^-1 de agar). El medio de cultivo de cada caja Petri se cortó a la mitad, y una de las mitades se colocó en otra caja Petri estéril. Con ayuda de un bisturí, se cortaron las mitades del agar V8 clarificado en cuadros de ~1 cm² y se agregó agua destilada estéril hasta cubrir los cuadros de agar. Las cajas Petri se colocaron en un cuarto de incubación a 21 ± 1 °C en oscuridad. El agua destilada se renovó diariamente durante cinco días. Finalmente, las cajas Petri se llevaron a 4 °C durante 1 h para inducir la liberación de las zoosporas. La suspensión se ajustó a 500 zoosporas·mL^-1 con ayuda de un hemocitómetro.

Evaluación del control biorracional de Phytophthora capsici CH11 in vivo

Tres días antes de la aplicación de los tratamientos, las plantas de chile serrano se regaron con abundante agua corriente, y el exceso de agua del contenedor base se eliminó para evitar contaminación cruzada. Se aplicaron, de manera independiente, 10 mL del SNC de las actinobacterias ABV38, ABV39 y ABV45 por cada planta de chile de 25 días de edad. Como testigo negativo se aplicaron 10 mL de agua destilada estéril por planta, y como testigo químico se utilizó el producto comercial Infinito^® (Bayer®, México), recomendado para el control de oomicetos, el cual contiene fluopicolide (62.5 g·L^-1) y propamocarb clorhidrato (625 g·L^-1). Para el testigo químico, se preparó una suspensión a 3 mL∙L^-1 del producto concentrado y se agregaron 10 mL por planta. Después de la aplicación de los tratamientos, cada planta se inoculó con 3 mL de la suspensión de zoosporas (500 zoosporas·mL^-1) de PC CH11, a una concentración final en el sustrato de 50 zoosporas·g^-1. Las plantas testigo se inocularon con 3 mL de agua destilada estéril. Después de la inoculación del oomiceto fitopatógeno, las plantas se incubaron a 21 ± 1 °C con un fotoperiodo de 16/8 h (luz/oscuridad) durante 10 días. No se aplicaron más riegos a las plantas.

Para esta prueba, se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 10 tratamientos: T1) ABV38, T2) ABV38 + PC CH11, T3) ABV39, T4) ABV39 + PC CH11, T5) ABV45, T6) ABV45 + PC CH11, T7) testigo (plantas sanas), T8) testigo + PC CH11 (plantas enfermas), T9) testigo químico y T10) testigo químico + PC CH11. Los tratamientos se aplicaron en charolas con las plantas de chile. Una charola contaba con 12 columnas, cada una con seis plantas de chile. Se excluyeron las columnas extremas de la charola. Las 10 columnas internas se aleatorizaron para aplicar los tratamientos. La unidad experimental constó de seis plantas de chile, y los tratamientos se realizaron por triplicado. El porcentaje de supervivencia de las plantas se determinó con la siguiente fórmula:

Identificación molecular de las cepas de actinobacterias

La identificación de los aislados actinobacterianos ABV38, ABV39 y ABV45 se realizó mediante la amplificación parcial del gen ARNr 16S por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), para ello se utilizaron los oligonucleótidos fD1 (5’-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) y rD1 (5’-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3’) (^{Weisburg, Barns, Pelletier, & Lane, 1991}). La extracción del ADN, la PCR y la secuenciación de los fragmentos amplificados se realizó en el Laboratorio de Biotecnología y Patología de Semillas del Colegio de Postgraduados. Los fragmentos amplificados se secuenciaron en ambos sentidos utilizando los iniciadores 8F, 1492R, U514, 800R, fD1 y rD1 (^{Edwards, Rogall, Blockerl, Emde, & Bottger, 1989}; ^{Stackebrandt & Liesack, 1993}).

Las secuencias consenso de las cepas ABV38, ABV39 y ABV45 se compararon en la base de datos del GenBank/EMBL/DDBJ a través del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (^{McGinnis & Madden, 2004}). Se utilizaron las secuencias de referencia y de cepas tipo filogenéticamente relacionadas con cada actinobacteria. Las secuencias se alinearon con CLUSTAL W (^{Thompson, Higgins, & Gibson, 1994}) y la construcción del árbol filogenético se realizó mediante el método Neighbor-Joining (NJ) (^{Saitou & Nei, 1987}) con 1,000 replicaciones Bootstrap utilizando el programa MEGA-X (^{Kumar, Stecher, Li, Knyaz, & Tamura, 2018}). El modelo de sustitución de nucleótidos seleccionado para NJ fue Kimura-2 parámetros (^{Kimura, 1980}). Las secuencias parciales del gen ARNr 16S de las cepas ABV38, ABV39 y ABV45 se depositaron en la base de datos del GenBank bajo los números de accesión MT435538, MT435539 y MT435540, respectivamente.

Análisis estadístico

Las variables respuesta (porcentaje de inhibición y de supervivencia) se sometieron a un análisis de varianza y una prueba de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05), para lo cual se empleó el paquete estadístico StatGraphics Centurion XV (^{StatPoint Inc., 2005}). Los datos de porcentaje de supervivencia se transformaron con ArcSen√x previo a su análisis.

Actividad antagónica in vitro

Las cepas ABV38, ABV39 y ABV45 presentaron diferente grado de inhibición del crecimiento in vitro de PC CH11 (Figura 1). La pre-incubación (5 días) de las cepas ABV38, ABV39 y ABV45 mostró diferencias significativas (P ≤ 0.05) en la inhibición del crecimiento de PC CH11 (con un incremento de 14.9, 10.4 y 9 %, respectivamente), en comparación con los tratamientos sin pre-incubación (Figura 1). La cepa ABV39 mostró la menor reducción (28 %) del crecimiento micelial de PC CH11 a los 5 días de pre-incubación, mientras que las cepas ABV38 y ABV45 presentaron un porcentaje de inhibición de 51 y 50 %, respectivamente, en el mismo tiempo de pre-incubación (Figura 1 y 2). Los resultados de la actividad antagónica in vitro indican claramente el potencial de las cepas ABV38 y ABV45 como agentes de control biológico de PC CH11, al presentar diferencias significativas en la inhibición del crecimiento micelial de dicho fitopatógeno con respecto a la cepa ABV39 en cualquier tiempo de pre-incubación (Figura 1 y 2).

Figura 1 Comportamiento de la capacidad de inhibición del crecimiento in vitro de Phytophthora capsici CH11 por distintas cepas de Streptomyces spp. (media ± desviación estándar). ^zMedias con la misma letra entre tiempo de pre-incubación (minúscula) o por cepas (mayúscula) no difieren estadísticamente (Tukey, P ≤ 0.05). 

Figura 2 Actividad antagónica in vitro de diferentes cepas de Streptomyces spp. contra Phytophthora capsici CH11. 

Control biorracional de P. capsici CH11 in vivo

El Cuadro 1 presenta el porcentaje de supervivencia de las plantas de chile serrano en los distintos tratamientos. Los resultados indican que el SNC de las cepas ABV45 (T6; 94 %), ABV38 (T2; 77 %) y el testigo químico (T10; 100 %), aplicados a plantas de chile inoculadas con PC CH11, mostraron diferencias significativas en el porcentaje de supervivencia respecto del testigo (T8; 0 %). Las plantas tratadas con el SNC de la cepa ABV39 (T4; 0 %) no mostraron un efecto de control de PC CH11.

El experimento in vivo demostró que la aplicación del SNC de las cepas ABV38 y ABV45 tuvo un efecto supresor de la marchitez en las plantas de chile causada por PC CH11, mientras que en el tratamiento testigo inoculado con PC CH11 se observó una severa defoliación y marchitez a los 10 días después de inocular al oomiceto fitopatógeno (Figura 3). La aplicación del SNC de las actinobacterias no afectó la supervivencia de las plántulas de chile no inoculadas con PC CH11 (Cuadro 1); sin embargo, se observó una disminución de la longitud de las raíces debido a la aplicación del caldo de cultivo (Figura 3).

Figura 3 Control biorracional de marchitez en plantas de chile serrano var. Camino Real mediante actinobacterias a los 10 días después de la inoculación con Phytophthora capsici CH11. Barra = 5 cm. 

Identificación molecular

El análisis comparativo de las secuencias del gen ARNr 16S de las cepas de actinobacteria ABV38 (1,404 pb), ABV39 (1,403 pb) y ABV45 (1,231 pb) confirmó que las tres cepas pertenecen al género Streptomyces (Figura 4). El análisis de dichas secuencias indicó que las cepas ABV38, ABV39 y ABV45 están filogenéticamente relacionadas con S. thioluteus NBRC 13341 (99.36 %), S. galbus DSM 40480 (99.29 %) y S. cinnamoneus NBRC 15926 (99.76 %), respectivamente. No obstante, se necesitan otros estudios para establecer si las cepas ABV38, ABV39 y ABV45 representan nuevas especies para el género Streptomyces.

Figura 4 Árbol filogenético Neighbor-Joining basado en secuencias parciales del gen ARNr 16S que muestra las relaciones filogenéticas entre las cepas ABV38, ABV39 y ABV45 con otras especies del género Streptomyces. Los números a un lado de las ramas son valores Bootstrap (%). La secuencia de Streptosporangium fragile DSM 43847 se utilizó como grupo externo. El número de accesión de cada secuencia se muestra entre paréntesis. Barra = 0.01 sustituciones por posición de nucleótido.