Introducción

El desequilibrio nutricional que ocurre en los insectos, debido a una dieta basada únicamente en savia, ha resultado en una asociación mutualista con organismos procariontes o endosimbiontes que se encuentran dentro del insecto en células especializadas denominadas bacteriocitos (^{Baumann et al., 1995}; ^{Buchner, 1965}; ^{Dixon, 1998}). Se ha demostrado que los endosimbiontes se involucran en procesos metabólicos como la síntesis y digestión de alimento, así como en el reciclaje de desechos nitrogenados (^{Subandiyah, Nikoh, Tsuyumu, Somowiyarjo, & Fukatsu, 2000}; ^{Su, Zhou, & Zhang, 2013}). No obstante, algunas de estas bacterias interfieren negativamente en las funciones metabólicas de su hospedero o activan el mecanismo de defensa de la planta durante el proceso de alimentación (^{Chaudhary, Atamian, Shen, Briggs, & Kaloshian, 2014}; ^{Feldhaar & Gross, 2009}).

Los endosimbiontes se clasifican, de acuerdo con su función, en dos grupos: primarios y secundarios. Los primarios presentan una relación obligatoria-mutualista con el insecto hospedero y se transmiten verticalmente de madre a hijos, mientras que los secundarios pueden o no ser necesarios para la supervivencia del insecto; su transmisión es horizontal, pero una vez dentro del insecto se vuelve vertical (^{Eleftherianos, Atri, Accetta, & Castillo, 2013}; ^{Su et al., 2013}).

Se ha encontrado la presencia de una gran diversidad de endosimbiontes asociados a Diaphorina citri, principalmente Candidatus Carsonella ruddii, C. Profftella armatura, C. Wolbachia spp. y C. Liberibacter spp. (^{Gill, Chu, & Pelz-Stelinski, 2016}; ^{Hussain et al., 2017}; ^{Subandiyah et al., 2000}). El psílido asiático de los cítricos, D. citri Kuwayama (Liviidae), se considera la plaga más peligrosa de este cultivo debido a que transmite a C. Liberibacter spp., patógeno causal del Huanglongbing (HLB) (^{Hall, Richardson, Ammar, & Halbert, 2013}). D. citri se describió por primera vez en Shinchiku, Taiwan, en 1907 con el nombre de Euphalarus citri (^{Halbert & Manjunath, 2004}). En India, se determinó la eficiencia de transmisión de C. Liberibacter asiaticus (CLas) por D. citri al observar los primeros síntomas en plantas entre los 25 y 40 días después de la exposición a psílidos previamente alimentados de plantas infectadas. Dichos insectos también portaban al virus de la tristeza de los cítricos (CTV); sin embargo, no fueron capaces de transmitirlo, lo que evidenció su estrecha relación con la bacteria (^{Capoor, Rao, & Viswanath, 1967}).

En México, el HLB se asocia a CLas y afecta principalmente a cítricos agrios como el limón mexicano (Citrus aurantifolia [Christm] Swingle) (^{Esquivel-Chávez et al., 2012}), contrario a lo reportado en Brasil y Estados Unidos, donde esta enfermedad presenta mayor impacto en cítricos dulces (^{Bové, 2006}; ^{Gottwald, da Graça, & Bassaneziu, 2007}). La región del Pacifico en México se considera de alto riesgo epidémico e impacto comercial por el HLB debido a la ocurrencia e intensidad de la enfermedad (^{Mora-Aguilera et al., 2014}; ^{Salcedo et al., 2010}).

Los endosimbiontes, así como su papel en el insecto vector y en la transmisión de CLas, pertenecen a una de las líneas de investigación menos estudiadas en la actualidad. Por ello, el objetivo de la presente revisión fue explorar la importancia y función de los endosimbiontes asociados a D. citri, y su papel en la transmisión de Candidatus Liberibacter asiaticus.

Metodología

La información del presente documento se obtuvo de las siguientes bases de datos, buscadores, revistas y libros de texto completo: ACSESS, Agris, Agricola, American Asociation for the Advancement of Science, Annual Reviews Sciences Collection, Association for Computing Machinery Base, BioOne, Cold Spring Harbor Laboratory, CORE, CRC net BASE, CRC Press, Crossref, Dimensions, EBSCO, ELSEVIER, Europe PubMed Central, Global NDLTD, Google Scholar, Harvard Dataverse, JSTOR, Microsoft Academic, Nature, Oxford Academic, PNAS, PROQUEST, PubMed, Redalyc, Scholexplorer, SciELO, Science, ScienceOpen, Scopus, SpringerLink, SpringerNature, Taylor and Francis, Web of Science Group, Wiley-Blackwell, Wisdom y Zenodo.

Transmisión de Candidatus Liberibacter asiaticus por D. citri

El daño que ocasiona la alimentación de adultos y ninfas de D. citri en árboles de cítricos es la distorsión en brotes y la alteración en el crecimiento de árboles jóvenes. No obstante, su principal importancia radica en su función como transmisor de CLas (^{Ortega-Arenas, Villegas-Monter, Ramírez-Reyes, & Mendoza-García, 2013}). La adquisición de la bacteria por el insecto ocurre entre las 5 y 7 h después de alimentarse de plantas enfermas, con una eficiencia de transmisión de 40 % (^{Ammar, Ramos, Hall, Dawson, & Shatters, 2016}). Los adultos de D. citri tienen un periodo de sondeo de 8 h en plantas infectadas con CLas, mientras que en plantas sanas es menor (^{Luo et al., 2015}). Este comportamiento se puede atribuir al cambio histológico que sufren las hojas debido a las infecciones ocasionadas por CLas, ya que provoca un engrosamiento de la cutícula foliar y la acumulación de almidón, lo que podría explicar la prolongada duración de búsqueda de sitios idóneos de alimentación (sondeo) (^{Cen et al., 2012a}; ^{Luo et al., 2015}).

CLas establece una relación persistente circulativa en su transmisor (^{Inoue et al., 2009}). Cuando los adultos libres de la bacteria se alimentan de árboles positivos a CLas requieren de 1 a 25 días para poder transmitirla a un árbol sano, mientras que los individuos provenientes de ninfas alimentadas de árboles positivos son infectivos tan pronto emergen (^{Ammar et al., 2016}), esto debido a que la carga bacteriana en estados ninfales aumenta considerablemente en un periodo más corto que en adultos (^{Ammar et al., 2016}; ^{Inoue et al., 2009}). Asimismo, la eficiencia de transmisión de CLas es mayor en adultos de D. citri provenientes de ninfas infectivas que en insectos que fueron expuestos a CLas en estado adulto. Estos hechos sugieren que el intestino medio y glándulas salivales fungieron como una barrera en la transmisión de la bacteria (^{Ammar et al., 2016}; ^{Cen et al., 2012a}; ^{Luo et al., 2015}).

El porcentaje de adquisición de CLas por adultos de D. citri alimentados en plantas positivas a esta bacteria varía entre regiones geográficas. En experimentos realizados con poblaciones de origen japonés, 88 % de los psílidos adquirieron a CLas después de 24 h de alimentación (^{Inoue et al., 2009}), mientras que, en poblaciones de Florida, solo 35 % de psílidos adultos adquirieron la bacteria a las cinco semanas de exposición a plantas infectadas (^{Pelz-Stelinski, Brlansky, Ebert, & Rogers, 2010}).

Candidatus Carsonella ruddii

La proteobacteria Candidatus Carsonella ruddii (CCr) es un endosimbionte primario de los psílidos, asociado a la síntesis de alimento (^{Dan, Ikeda, Fujikami, & Nakabachi, 2017}). Dentro del insecto portador, las bacterias se alojan en bacteriocitos uninucleados de forma tubular sobre los ovarios (Figura 1). Los bacteriocitos aumentan de tamaño durante el desarrollo ninfal, y ya que no poseen genes de división celular se sugiere que D. citri controla este proceso (^{Dan et al., 2017}). CCr cuenta con uno de los genomas más pequeños en la naturaleza, con 159,662 pb y 16 % de GC (^{Riley, Kim, & Hansen, 2017}). Algunos estudios proponen su transformación a una nueva entidad subcelular, entre células vivas y organelo, dado que ha perdido genes de biosíntesis de aminoácidos (^{Tamames et al., 2007}).

Figura 1 Localización de endosimbiontes en D. citri mediante hibridación fluorescente in situ (FISH). A) Microfotografía confocal en abdomen de hembra adulta 5 días después de la eclosión (ov = ovarios inmaduros; bo = bacteriosoma), B) microfotografía confocal en sección transversal sagital de hembra adulta (C = bacteriocitos uninucleados de Carsonella con señales en rojo; D = sincitio citoplasmático que aloja a Profftella con señales en verde; bo = bacteriosoma; tg = células de D. citri con señales en azul de los núcleos; ov = ovogonia en ovario; vt = ovocitos vitelogénicos; pv = ovocitos previtelogénicos), C) sección ampliada del recuadro punteado C de la imagen B (bc = bacteriocitos con células grandes [línea punteada amarilla] y tubulares delgados [línea punteada blanca]), D) sección ampliada del recuadro punteado D de la imagen B (sy = sincitio citoplasmático que aloja a Profftella; la flecha entre bacteriocitos [señales en rojo] de Carsonella indican el sincitio en la periferia del bacterioma), E) intestino de psílido adulto de D. citri, se observa a CLas en coloración verde y la flecha señala la sonda de oligonucleotída específica y el cuadro punteando en blanco muestra a Wolbaquia en tonos rojos y rosas. Fuente: A, B, C y D tomadas de ^{Dan et al. (2017)} y E modificado de ^{Mann et al. (2018)}. 

Se considera que a cada especie de psílido le corresponde una cepa bacteriana, para D. citri es la cepa DC (^{Gill et al., 2016}; ^{Katsir et al., 2018}). En hemolinfa de psílidos sanos, la cepa DC se compone de 362 proteínas únicas, mientras que en psílidos infectados con CLas el número disminuye a 91 proteínas. Del total, 162 son proteínas únicas y 109 coinciden con las de CCr. La mayoría de las proteínas de CCr presentes en la hemolinfa de D. citri tienen como funciones principales la producción y conversión de energía, el transporte y metabolismo de aminoácidos, la traducción ribosómica y biogénesis, la renovación de proteínas, las modificaciones postraduccionales y la formación de proteínas chaperonas (^{Gill et al., 2016}). En relación con la síntesis de proteínas chaperonas, se ha comprobado que el endosimbionte Buchenera sp. le permite a los virus fitopatógenos, principalmente luteovirus, moverse libremente dentro del pulgón Myzus persicae sin ser degradado y llegar a las glándulas salivales. La interacción entre virus y endosimbionte está determinada por dichas proteínas, lo cual fue demostrado con tratamientos de antibióticos en áfidos portadores de leutovirus. El antibiótico redujo la concentración de simbionina (proteína chaperona específica) y la formación de la cápside proteica del virus, lo que inhibió la transmisión del patógeno (^{Van den Heuvel et al., 1997}).

Candidatus Profftella armatura

Candidatus Profftella armatura (CPa) es un endosimbionte primario ampliamente estudiado en D. citri. Esta beta-proteobacteria se encuentra en un sincitio citoplasmático dentro del bacterisoma del insecto (^{Ramsey et al., 2015}). Además, presenta genes relacionados con la síntesis de pederina (toxina policetido), la cual le confiere actividad citotóxica a D. citri, lo que le permite protegerse de enemigos naturales (^{Nakabachi et al., 2013}). En psílidos positivos a CLas, la concentración de la toxina policetido es mayor que en psílidos no portadores (^{Nakabachi et al., 2013}; ^{Ramsey et al., 2015}). Este compuesto se relaciona con la supresión de la mitosis celular y síntesis de ADN en los depredadores (^{Nakabachi et al., 2013}; ^{Wu et al., 2015}).

La cepa YCPA de CPa se encuentra en la hemolinfa de D. citri y presenta 263 y 116 proteínas totales en psílidos no portadores y portadores de CLas, respectivamente; de las cuales, 156 son proteínas únicas en insectos no infectivos y 19 en infectivos, y 107 son proteínas únicas en procariontes (^{Gill et al., 2016}; ^{Wu et al., 2015}). Entre las funciones que cumplen las proteínas únicas en el insecto se encuentran la biosíntesis y degradación de aminoácidos, la degradación de carbohidratos, la biosíntesis de aminoacil-tRNA, el metabolismo de carbohidratos, la biosíntesis de carotenoides, la biosíntesis de cofactores, el procesamiento de información genética, el metabolismo de lípidos, el metabolismo de un carbono, la modificación de proteínas, el metabolismo de pirimidina, el metabolismo de azufre y las modificaciones de ARNt (^{Gill et al., 2016}).

Candidatus Wolbachia sp.

Candidatus Wolbachia sp. (CW) es una alfa-proteobacteria que se clasifica en ocho supergrupos con linaje evolutivo distinto. Se estima que CW infecta hasta el 65 % de los individuos de D. citri; sin embargo, no es un endosimbionte específico de artrópodos, ya que se ha reportado su infección en nematodos y mamíferos. La cepa WGS de CW reportada en D. citri corresponde al supergrupo B (^{Ramírez-Puebla et al., 2015}).

Los análisis de hemolinfa de D. citri exhiben una infección imperfecta de CLas y CW, lo que sugiere que son parásitos facultativos (^{Subandiyah et al., 2000}). La mayor concentración de CW en D. citri infectivo se presenta en adultos; no obstante, exhiben niveles altos de necrosis celular o cariorrexis en comparación con las ninfas, por lo que se infiere una estrecha interacción entre CLas y CW durante el desarrollo de psílidos expuestos a plantas infectadas (^{Mann et al., 2018}). Los genes SC1 y SC2 se han descrito en todas las cepas de CLas reportadas en el mundo. SC1 se encuentra involucrado en la síntesis de holina, causante del ciclo lítico de la bacteria, aunque las proteínas de cepas de CW obtenidas de D. citri son capaces de suprimir el promotor de holina, el cual se activa al contacto con la planta, pero no en el psílido hospedero. Tal interacción es vital para la supervivencia de estos procariontes, lo que además explica por qué los adultos provenientes de ninfas positivas son más eficientes en la transmisión de CLas (^{Jain, Fleites, & Gabriel, 2017}).

CW ha sido ampliamente estudiada por su capacidad de interferir con la reproducción de su hospedero (^{Guidolin & Cosoli, 2013}). También, se ha reportado una estrecha relación entre especies de Wolbachia de mosca blanca y psílidos (^{Spaulding & Dohlen, 1998}).

Candidatus Liberibacter asiaticus

El HLB es una enfermedad endémica reportada en Asía desde 1870, y en 1956 se asoció a Candidatus Liberibacter spp. Hasta el momento, se conocen tres géneros de esta bacteria: C. Liberibacter americanus (CLam; reportado en Brasil y Asia), C. Liberibacter africanus (CLaf; registrada y distribuida en África) y CLas (distribuida en Asia, Brasil, Florida, Caribe y México) (^{Bové, 2006}; ^{Santivañez, Mora-Aguilera, Díaz-Padilla, López-Arroyo, & Vernal-Hurtado, 2013}).

La principal forma de dispersión de CLas es por medio de su vector: D. citri (Liviidae); no obstante, se ha observado que Trioza erytreae (triozidae) es capaz de transmitir esta bacteria. Cabe mencionar que el psílido asiático de los cítricos puede actuar como transmisor de Ca. Liberibacter africanus de forma experimental (^{Capoor et al., 1967}; ^{Lallemand, Fos, & Bové, 1986}). Hasta hace unos años, D. citri era la única especie de psílido reportada capaz de adquirir y transmitir a CLas; sin embargo, se han reportado otros insectos asociados con esta bacteria como Diaphorina communis (Liviidae) y Cacopsylla citrisuga (Psyllidae) en Asía, y Ferrisia virgata (Pseudococcidae) en Estados Unidos (^{Cen, Zhang, Xia, Guo, & Deng, 2012b}; ^{Donovan et al., 2012}; ^{Pitino et al., 2014}). Aunque, hasta el momento, no existen estudios donde se demuestre su eficiencia como vectores de la bacteria, y por ello, solo se consideran insectos portadores (^{Cen et al., 2012b}; ^{Donovan et al., 2012}; ^{Pitino et al., 2014}).

La eficacia y propagación de un patógeno depende obligatoriamente de la aptitud, características e interacciones con su transmisor. Los endosimbiontes juegan un papel fundamental en la supervivencia del insecto, y viceversa. En la co-evolución de CLas y D. citri, la bacteria se beneficia del insecto en su transmisión a nuevas plantas hospedantes, además de asegurar su supervivencia dentro del artrópodo (^{Cen et al., 2012a}; ^{Luo et al., 2015}). Esta alfa-proteobacteria se aloja, como cuerpos pleomórficos, en la hemolinfa, el intestino medio, los túbulos de Malpighi, los ovarios y, con mayor concentración, en los tejidos musculares y grasos, el canal alimenticio y las glándulas salivales (^{Ammar, Shatters, & Hall, 2011}).

Por otro lado, la bacteria potencializa el vuelo del insecto a cortas distancias debido a un aumento del receptor de lipoforina y de proteínas de unión de ácidos grasos. Además, las hembras con mayor carga bacteriana son más atractivas para los machos (^{Martini, Hoffmann, Coy, Stelinski, & Pelz-Stelinski, 2015}). En México, la longevidad de los psílidos desarrollados en plantas positivas a CLas disminuyó, mientras que la fecundidad y la tasa de crecimiento poblacional se vieron beneficiadas (^{Ramírez-Sánchez, Ortega-Arenas, Velázquez-Monreal, & Valdez-Carrasco, 2016}). Se ha reportado que adultos de D. citri, positivos a CLas, son más susceptibles a los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Isaria fumosorosea. ^{Tiwari, Pelz-Stelinski, y Stelinski (2011)} observaron que adultos de D. citri infectados con CLas tienen mayor susceptibilidad a insecticidas al compararlos con psílidos sanos (^{Orduño-Cruz, Guzmán-Franco, & Rodríguez-Leyva, 2015}). CLas no solo modifica la aptitud biológica de D. citri, también afecta la interacción entre sus endosimbiontes, lo que provoca una reducción en la síntesis de proteínas. En el caso de CW, puede disminuir el número de proteínas únicas de 737 a 148 (^{Gill et al., 2016}).

Una de las interrogantes en la interacción microbiana de los endosimbiontes encontrados en D. citri es saber quién controla la dinámica preexistente entre estos microrganismos. Estudios realizados en otros procariontes asociados a insectos sugieren que esta actividad puede estar regulada por procesos químicos de señalización, conocidos como quorum sensing, a través de la expresión génica (^{Bassler, 1999}). Durante esta actividad, las bacterias inducen cambios en el comportamiento que regulan la densidad poblacional por medio de la producción y liberación de moléculas químicas llamadas autoinductores, los cuales aumentan su concentración cuando detectan incremento en la densidad celular (^{Miller & Bassler, 2001}). Un ejemplo de lo anterior es el sistema de quorum sensing de Sodalis gossinidus, endosimbionte de la mosca tse-tse que cuenta con dos proteínas reguladoras que sintetizan una molécula de señalización de lactona homoserina acilada, la cual le permite a la bacteria modular la expresión génica de acuerdo con la densidad celular (^{Pontes et al., 2008}).

Perspectivas

Los endosimbiontes se han estudiado ampliamente tanto en mamíferos como en insectos. El estudio de las interacciones cooperativas entre procariontes e insectos vectores permite entender las bases que regulan su mutua supervivencia y éxito de reproducción. C. Carsonella ruddi y C. Profftella armatura se consideran los principales endosimbiontes de D. citri; sin embargo, la interacción con endosimbiontes secundarios, como C. Wolbachia y C. Liberibacter asiaticus, le permite al psílido desarrollar una mayor eficaciencia como vector de la bacteria. El conocimiento actual de la relación endosimbionte-psílido se debe, en gran medida, a los avances moleculares que se basan en el estudio de los genomas e interacción entre organismos, esto aunado a la proteómica. Desde nuestra perspectiva, los principales temas a investigar incluyen la relación de genomas entre hospedante-insecto y endosimbionte-planta-hospedero, así como su función a nivel fisiológico. El estudio de estas interacciones permitiría comprender a profundidad la función de los genes implicados en estas relaciones mutualistas y, por consiguiente, manipular genéticamente al hospedero o silenciar genes en busca de un manejo integrado tanto de D. citri. como de CLas.

Conclusiones

La clave del éxito evolutivo de los insectos está estrechamente ligada a la asociación simbiótica con bacterias. Los endosimbiontes han experimentado grandes cambios, los cuales van desde la reducción de tamaño hasta la disminución de la síntesis de proteínas, como es el caso de Candidatus Carsonella ruddi y C. Profftella armatura endosimbiontes primarios de Diaphorina citri. En psilidos infectivos, C. Wolbachia y C. Liberibacter asiaticus parecen estar complementando las funciones de los endosimbiontes primarios, a tal grado que la presencia de C. Wolbachia es fundamental para que D. citri sea capaz de transmitir a C. Liberibacter asiaticus.