Material biológico y sitio experimental

Se utilizaron manzanas (Malus domestica Borkh) de las variedades ‘Golden Delicious’, ‘Red Delicious’, ‘Joya’, ‘Rayada’, ‘Royal Gala’, ‘Agua Nueva’, ‘Rosada’, ‘424’, ‘428’, ‘429a’, ‘429b’, ‘436’, ‘467’ y ‘Malus x Micromalus’ establecidas en un huerto fenológico en San José Itho, Amealco, Querétaro, México, localizado a 20° 11’ latitud norte y 100° 08’ longitud oeste, a 2,275 msnm. El huerto se encuentra bajo temporal, con riegos de auxilio durante el periodo seco de primavera. La temperatura media anual es de 15.2 °C, con una precipitación media anual de 927.7 mm (^{Servicio Meteorológico Nacional [SMN], 2016}) y acumulación promedio de horas frío de 500. El suelo es profundo (> 50 cm) y arcilloso, con un pH de 5.6, baja salinidad (0.03 dS·m^-1) y bajo contenido de materia orgánica (0.53 %).

Las cepas de levadura de referencia de Saccharomyces cerevisiae fueron K1-V1116 (LALVIN^®) y AH22 (sensible al genotipo killer).

Aislamiento de las levaduras

Las manzanas se cosecharon de acuerdo con su madurez aparente (apreciación visual del color) debido a la escasez de material; a partir de éstas se obtuvieron los mostos con un extractor estándar (TU04, Turmix, México). Todos los mostos se ajustaron a 20 °Brix con sacarosa, se sulfitaron (50 mg·L^-1 de SO₂), se desfangaron a 3 °C por 24 h y se dejaron fermentar espontáneamente a 19 °C. A la mitad de la fermentación (ρ = 1.03 g·mL^-1) y a su término (ρ = 0.99 g·mL^-1, o bien cuando la densidad permaneció constante) se tomaron alícuotas, se realizaron diluciones decimales seriadas, se sembraron 100 μL por extensión en superficie en agar nutritivo-dextrosa para levaduras (NYDA) ‒suplementado con cloranfenicol (100 mg·L^-1) y rosa de bengala (60 mg·L^-1)‒ y se inocularon durante dos días a 28 °C.

De las placas correspondientes a cada variedad de manzana, se aislaron cinco colonias con morfologías contrastantes en cada etapa de la fermentación. Las cepas aisladas se diferenciaron mediante tres pases consecutivos en medio agar lisina incubado a 25 °C durante dos días. Las cepas que no crecieron en el medio se consideraron del género Saccharomyces (^{Medina et al., 2007}).

Pruebas de selección de levaduras Saccharomyces

Para determinar el efecto killer, se empleó la metodología propuesta por ^{Lopes y Sangorrín (2010)}, con algunas modificaciones. Se inocularon por vaciado en placa 6 Log de UFC·mL^-1 de la cepa sensible al efecto killer (AH22) en medio NYDA con azul de metileno (0.2 %), NaCl (1 %) y fosfato-citrato para ajustar el pH a 4.6. Una vez solidificado el medio, se inocularon en forma de gota 5 μL de cada cepa a una concentración de 6 Log UFC·mL^-1 y se incubaron durante 72 h a 25 °C. Las cepas se consideraron killer cuando a su alrededor se observó un halo de inhibición enmarcado en azul.

La actividad β-glucosidasa se determinó en medio agar esculina-glicerol a pH 6, para lo cual cada cepa se inoculó por estría y por separado, e incubó a 25 °C por dos días. La actividad β-glucosidasa se evidenció por la hidrolisis del sustrato, en la cual se forma un precipitado color marrón alrededor de la colonia (^{Pérez et al., 2011}).

La capacidad de floculación se determinó de acuerdo con lo reportado por ^{Suárez-Valles et al. (2008)}, con algunas modificaciones. Las cepas se inocularon en 5 mL de caldo NYDB y se incubaron a 25 °C durante 72 h. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron y se resuspendieron en 5 mL de solución amortiguadora de Helm (3 mmol·L^-1 de CaCl₂ y 50 mmol·L^-1 de solución amortiguadora de acetato-acético, pH de 4.5). El índice de floculación (IF) se determinó mediante la relación, en porcentaje, de la densidad óptica a 620 nm de la suspensión de cultivo y la obtenida 120 min después de añadir la solución de Helm. Las cepas se clasificaron como: altamente floculantes (IF < 30 %), medianamente floculantes (IF entre 30 y 70 %) y ligeramente floculantes (IF > 70 %).

Para la velocidad de fermentación, cada cepa se inoculó a una concentración de 6 Log UFC·mL^-1 en tubos con 15 mL de mosto estéril ajustado a 25 °Brix y se incubaron a 25 °C durante ocho días. Se midió la pérdida de peso por día y se obtuvo una pendiente negativa (g·día^-1), en la cual se formaron tres grupos de acuerdo con su velocidad de fermentación: lenta (< -0.07 g·día^-1), media (entre -0.071 y -0.08 g·día^-1) y rápida (> -0.081 g·día^-1), prefiriéndose aquellas cepas que presentaran cualquiera de las dos últimas.

La tolerancia a etanol y a SO₂ se determinó por turbidimetría. Se inocularon 5 Log UFC de cada cepa en fosas individuales de microplacas que contenían 200 μL de medio NYDB (pH = 3.8), adicionado con etanol (8 %) y metabisulfito de potasio (50 mg·L^-1 de SO₂). Las microplacas se incubaron durante 72 h a 25 °C y al final se midió la densidad óptica a 600 nm en un analizador Varioskan^TM (Thermo Fisher®, Finlandia). Se consideraron tolerantes aquellas cepas con una DO₆₀₀ > 0.7.

La tolerancia a la presión se evaluó a partir de microfermentaciones. Primero se obtuvo la sidra de base a partir de mosto pasteurizado y ajustado a 25 °Brix, para lo cual se empleó la levadura comercial K1-V1116. Al término de la primera fermentación, se vaciaron 300 mL de sidra tranquila en botellas de PET desinfectadas y adaptadas con una válvula tipo Schrader, se agregaron 30 g·L^-1 de azúcar y 6 Log UFC·mL^-1 de la levadura nativa a evaluar. Finalmente, se midió la presión cada semana durante 49 días con un manómetro neumático (Autotec 77992, AutoZone, México).

Elaboración de sidra espumosa

El mosto de manzana ‘Golden Delicious’ se sulfitó, desfangó e inoculó (1x10⁵ UFC·mL^-1) con la cepa nativa más sobresaliente para obtener la sidra tranquila. El jugo se fermentó a 19 ± 1 °C, de acuerdo con lo propuesto por ^{Soto-Herrera, Castillo-Castañeda, y Martínez-Peniche (2008)}. La sidra obtenida se trasegó, clarificó con albúmina y se dividió en lotes correspondientes a las cepas preseleccionadas a evaluar. En cada lote se adicionó licor de tiraje (1x10⁵ UFC·mL^-1 de la cepa de levadura y 30 g·L^-1 de sacarosa) y 50 mg·L^-1 de sulfato de amonio, y se distribuyó en seis botellas de PET de 250 mL modificadas con válvula Schrader. Las botellas se dejaron fermentar a 16 ± 1 °C durante 28 días. La presión interna se midió cada semana con el manómetro.

Al término de la segunda fermentación se removieron los sedimentos mediante puesta en pupitre (25 días) y posterior degüelle. Finalmente, siguiendo los protocolos válidos ante la Organización Internacional de la Viña y el Vino (^{OIV, 2017}), se determinó: grado alcohólico (GA; °GL) por destilación y densimetría, azúcares residuales (AR; g·L^-1) por Fheling-Causse-Bonnans, pH por medio de un potenciómetro, acidez total titulable (ATT; g·L^-1) por titulación, acidez volátil (AV; g·L^-1) con la metodología de García-Tena y anhídrido sulfuroso total (SO₂) por yodimetría (mg·L^-1).

Análisis sensoriales

Se realizaron dos pruebas hedónicas lineales no estructuradas con límites de 0 a 10 (donde el 0 corresponde a “me disgusta mucho” y 10 a “me gusta mucho”) y 10 panelistas semientrentados. En la primera prueba se evaluaron las características espumantes de las sidras: a) altura de la corona (espuma formada en la superficie del líquido), b) tiempo de reducción de la corona, c) número de trenes (correspondientes a las líneas de burbujas que se forman en el seno del líquido y ascienden a la superficie), d) diámetro de la burbuja y e) velocidad de la efervescencia. En la segunda se evaluó la aceptabilidad de la apariencia, el aroma y el sabor (^{Soto-Herrera et al., 2008}).

Identificación de las levaduras seleccionadas

La identificación a nivel especie de las levaduras seleccionadas se realizó mediante amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y posterior secuenciación de la región ITS1/ITS4 con los oligonucleótidos ITS1 (5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’) e ITS4 (5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’), utilizando las siguientes condiciones: 2 min a 95 °C, 35 ciclos (30 s a 95 °C, 1 min a 56.75 °C y 1 min a 72 °C) y 10 min a 72 °C. Los amplicones se enviaron al LANBAMA del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICYT, SLP) para su purificación y posterior secuenciación con la técnica de Sanger y un analizador genético (3130 Genetic analyzer, Thermo Fisher^®, EUA). Las secuencias obtenidas se compararon con las del GenBank mediante el programa Blast.

Análisis estadísticos

Se empleó un diseño experimental unifactorial completamente al azar con distinto número de repeticiones, siendo el factor de estudio las cepas de levaduras. Todas las determinaciones para la preselección de las levaduras se realizaron por triplicado. Los datos de las variables cuantitativas se sometieron a un análisis de varianza y una comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05), para lo cual se utilizó el programa estadístico JMP versión 11. Para determinar diferencias entre las características sensoriales de las sidras, se utilizó la prueba de Friedman con el programa Prism-GraphPad.

Características iniciales del mosto

El Cuadro 1 muestra las características iniciales de cada variedad de manzana empleada, y se puede observar que presentan diferencias importantes entre ellas. Los mayores rendimientos de mosto se obtuvieron con ‘429a’, ‘428, ‘Red Delicious’ y ‘Rayada’ (0.45, 0.45, 0.44 y 0.43 L·kg^-1 de manzana, respectivamente), los cuales contrastan con ‘Malus x Micromalus’ (02.26 L·kg^-1 de manzana); esto debido, probablemente, al bajo porcentaje de jugo y mayor firmeza de la pulpa de ‘Malus x Micromalus’. La mayor concentración de azúcares se presentó en ‘Agua Nueva’ y ‘Royal Gala’ (17 °Brix), lo que difiere de la obtenida con ‘424’ y ‘Rayada’ (11.2 y 11.4 °Brix, respectivamente). Finalmente, el mayor valor de pH lo tuvo el mosto obtenido con ‘428’ (pH = 4.37), y el menor valor lo presentó ‘Malus x Micromalus’ (pH = 2.97).

Aislamiento y diferenciación de levaduras

La evolución de las fermentaciones espontáneas, medidas por la densidad, resultó muy variable (Figura 1). La variedad ‘436’ finalizó la fermentación a los cinco días, mientras que ‘467’ y ‘Golden Delicious’ lo hicieron en 24 días. Por su parte, ‘Malus x Micromalus’, ‘Rayada’, ‘429b’ y ‘Joya’ no finalizaron el proceso fermentativo. Los factores que intervienen en el desarrollo de la fermentación son muchos, entre ellos la concentración de nutrientes, la forma en que se combina el anhídrido sulfuroso adicionado, así como los tipos de microorganismos presentes en el mosto de la manzana, ya que éstos pueden competir con las levaduras fermentativas por espacio y nutrientes, o producir compuestos de tipo proteico (efecto killer) o ácidos grasos de cadena corta o media que inhiban la fermentación (^{Irastorza & Dueñas, 2010}). En general, se prefiere una fermentación rápida, ya que de lo contrario se corre el riesgo de contaminación microbiológica y aumentan los costos de producción.

Figura 1 Evolución de la densidad del mosto de 14 variedades de manzana. 

De las fermentaciones espontáneas producidas con las 14 variedades se aislaron 135 levaduras, ya que no fue posible recuperar levaduras viables de la variedad ‘429’ al final de la fermentación. Lo anterior debido, probablemente, a que ninguna de las levaduras fue capaz de tolerar las condiciones inhibitorias que se generaron durante la fermentación de esta variedad. De las 135 levaduras aisladas, 102 (75.5 %) correspondieron al género Saccharomyces, lo que coincide con lo reportado por ^{Suárez-Valles et al. (2008)}, quienes obtuvieron 70 % de levaduras Saccharomyces spp. en aislamientos realizados en diferentes etapas de la fermentación de sidra.

Caracterización y selección de las cepas de levaduras

Para seleccionar las levaduras Saccharomyces spp. se consideraron dos factores: la actividad β-glucosidasa y la presencia de fenotipo killer. De las 102 cepas iniciales, 60 (58.8 %) presentaron actividad β-glucosidasa, lo que contrasta con ^{Pando-Bedriñana et al. (2010)}, quienes únicamente encontraron 2 de 134 cepas. La divergencia de los resultados puede deberse a que en este estudio las levaduras se aislaron de 14 variedades, por separado, mientras que en el trabajo reportado los aislamientos se realizaron en bodegas de sidra asturiana, frecuentemente elaborada con mezclas (^{Boletín Oficial de Estado [BOE], 2003}). Un mayor número de variedades obtenidas del campo aumenta las posibilidades de obtener diversidad fenotípica de los microorganismos aislados.

Los terpenos glucosilados presentes en la manzana se pueden hidrolizar por la β-glucosidasa, lo que libera compuestos volátiles que potencian el aroma y permiten revelar características varietales típicas (^{Carrau, Dellacassa, & Boido, 2008}). Sin embargo, la presencia de la enzima no asegura su acción en el medio fermentativo, debido a que se encuentra asociada con la pared celular de la levadura, lo que la hace susceptible a la inhibición por etanol (^{Mateo & Maicas, 2016}).

Por otro lado, del total de cepas iniciales, únicamente 18 (17.5 %) presentaron efecto killer. Estos resultados contrastan con lo reportado por ^{Pando-Bedriñana et al. (2010)}, quienes observaron que de 134 cepas aisladas de sidra, únicamente dos (1.9 %) exhibieron dicho efecto. Estas diferencias pueden ser debidas a la procedencia de las levaduras. En el campo, las levaduras compiten con una mayor diversidad de microorganismos, por lo que deben desarrollar mecanismos, como el fenotipo killer, para sobrevivir; mientras que en bodegas, las levaduras se encuentran adaptadas a las condiciones limitantes del medio, las cuales favorecen el no requerir ciertos mecanismos antagónicos.

La secreción de toxinas que inhiben el desarrollo de microorganismos susceptibles funge como un mecanismo de regulación de la dinámica poblacional en los ecosistemas microbianos y se considera un factor favorable para la selección de microorganismos fermentativos, pues brindan una ventaja competitiva. La susceptibilidad a estas toxinas está regulada por receptores en la pared celular del microorganismo sensible (^{García, Esteve-Zarzozo, & Arroyo, 2016}).

En total, 66 cepas mostraron una o dos características señaladas anteriormente, por lo que para el resto de las pruebas sólo se consideraron éstas (Cuadro 2).

Respecto a la capacidad floculante, 30 levaduras, de las 66 evaluadas, resultaron mediana o altamente floculantes de acuerdo con la escala propuesta por ^{Suárez-Valles et al. (2008)}. Esta característica resulta fundamental para las levaduras, principalmente en la segunda fermentación por el método champenoise, ya que para eliminar las lías en el degüelle se requiere que la levadura tenga la capacidad de generar flóculos y precipitar sin añadir ningún clarificante (^{Garofalo et al., 2016}).

En cuanto a la velocidad de fermentación, 38 cepas mostraron valores medios o altos, lo cual depende de la capacidad de cada levadura para responder a las condiciones de estrés: contenido de nutrientes del mosto, temperatura, toxicidad por etanol o por ácidos grasos, proporción de fuentes de nitrógeno, entre otras (^{Irastorza & Dueñas, 2010}; ^{Varela, Pizarro, & Agosin, 2004}). Para fines de selección, si la fermentación es lenta se corre el riesgo de contaminación y aumentan los costos de producción al usarse por más tiempo los tanques de fermentación; no obstante, si es muy rápida, la temperatura tiende a incrementar, lo que causa que se detenga la fermentación y haya pérdida de compuestos aromáticos. La temperatura alta y la fermentación rápida se consideran controlables mediante sistemas de enfriamiento, por lo que resultan recomendables velocidades medias a altas (^{Bisson & Batszuke, 2000}).

Para evaluar la tolerancia de las cepas a etanol y a SO₂, se consideraron únicamente las 45 cepas (incluyendo K1-V1116) que presentaron al menos dos de las cuatro características evaluadas previamente (efecto killer, β-glucosidasa, floculación y velocidad de fermentación). La presencia de turbidez en el medio que contenía 8 % de etanol y 50 mg·L^-1 de SO₂, después de una incubación de 48 h, indicó crecimiento de las levaduras y, por lo tanto, tolerancia a estos dos compuestos; en la prueba destacaron 15 cepas con esta característica (Cuadro 2).

El etanol es uno de los compuestos más inhibitorios que se forman durante la fermentación, ya que afecta la fluidez de la membrana plasmática, la morfología de la vacuola, la actividad de enzimas glucolíticas y el ADN mitocondrial (^{Miranda et al., 2017}). ^{Mukherjee et al. (2014)} mencionan que algunas cepas de levaduras pueden crecer o sobrevivir en presencia de etanol debido a ciertos alelos que permiten contrarrestar los efectos tóxicos de este compuesto. Asimismo, los esteroles y los ácidos grasos insaturados sintetizados en presencia de oxígeno, como el palmitoleico (D9-cisC16:1) y el oleico (D9-cisC18:1), juegan un papel fundamental en la tolerancia a etanol (^{García, Quintero, & López-Munguía, 2004}). Además, es importante que las levaduras seleccionadas toleren concentraciones altas de SO₂, ya que esto les permitirá sobrevivir al sulfitado, lo que les ayudará a imponerse sobre las levaduras silvestres (^{Ubeda, Briones, Izquierdo, & Palop, 1995}). La prueba realizada (combinando dos inhibidores) resulta más exigente y más representativa que la condición que se presenta en el medio de fermentación, donde interactúan diversos factores que limitan el desarrollo de los microorganismos.

De las 66 levaduras evaluadas, cuatro (incluida la de referencia K1-V1116) mostraron las cinco características deseables consideradas, mientras 34 (51 %) presentaron al menos tres de dichas características (Cuadro 2). De estas últimas, 19 (56 %) se aislaron a la mitad de la fermentación y 15 (44 %) al final del proceso; etapa en la que se esperaba que predominaran las levaduras con las mejores características fermentativas, ya que estarían adaptadas al medio y tolerarían las condiciones más inhibitorias presentes en estados avanzados de la fermentación (^{Steensels & Verstrepen, 2014}).

Respecto a las variedades de manzana, las que presentaron el mayor número de cepas con al menos dos características deseables fueron ‘436’ (rápida fermentación), ‘428’ y ‘Royal Gala’ (con ocho, siete y seis cepas, respectivamente), mientras que con ‘467’, ‘Agua Nueva’ y ‘Rayada’ se encontraron cuatro cepas. Las variedades que aportaron cepas con tres o menos características deseables fueron ‘Red Delicious’, ‘424’, ‘429b’, ‘Joya’, ‘Malus x Micromalus’ y ‘Golden Delicious’. De manera general, las variedades donde no se finalizó la fermentación, o donde tardó más, fueron las que tuvieron menor número de cepas con características positivas; sin embargo, la cepa MM7, proveniente de una fermentación incompleta, manifestó las cinco características deseables evaluadas.

Considerando los resultados anteriores, se seleccionaron diez cepas para las pruebas siguientes: tres que presentaron las cinco características evaluadas (MM7, 436.4 y RG6), tres con cuatro características (AN5, RG8 y 429a.9) y cuatro con tres características (428.3, RY3, RY5 y 428.6). De esta manera se cubrieron distintas variedades y diferentes combinaciones de aspectos de interés.

Tolerancia a la presión

En la Figura 2 se observa un comportamiento similar de la evolución de la presión generada en la botella por las distintas cepas de levaduras a lo largo del proceso, a excepción de la cepa 428.6, la cual generó una presión inferior al resto de las levaduras. Después de 49 días, se presentan diferencias entre las levaduras, destacando MM7, cepa similar al testigo comercial K1-V1116 y contrastante con 428.6.

Figura 2 Presión generada por diez cepas de levaduras nativas y el control comercial K1-V1116 al interior de botellas. ^zMedias con la misma letra no difieren estadísticamente (Tukey, P ≤ 0.05). 

El dióxido de carbono en el medio resulta inhibitorio para las levaduras, ya que puede disminuir ligeramente el pH, aunque, fundamentalmente, aumenta la presión atmosférica, lo que limita el desarrollo de los microorganismos. Las levaduras toleran alrededor de 7 atm (máxima alcanzada en vinos espumosos), una presión mayor inhibe su metabolismo y ralentiza su desarrollo (^{Borrull, Poblet, & Rozès, 2015}). Como muchos tipos de estrés, la presión disminuye el ciclo celular y reduce la viabilidad de los microorganismos conforme aumenta; por encima de 30 atm genera inhibición y cuando es mayor a 500 atm altera la morfología de los microorganismos. Adicionalmente, se sabe que, como otros agentes causantes de estrés, la presión puede generar una tolerancia cruzada; es decir, la barotolerancia puede ser adquirida mediante pretratamientos subletales con otros agentes estresantes como temperatura, etanol o la misma presión (^{Fernandes, 2005}).

Comportamiento de levaduras nativas seleccionadas en la elaboración de sidra espumosa

Considerando las pruebas anteriores, se seleccionó la cepa MM7 para la primera fermentación, ya que presentó efecto killer, actividad β-glucosidasa y velocidad de fermentación media. Para la segunda fermentación se eligieron MM7 y 436.4, las cuales presentaron las cinco características deseables, y RY5 que presentó tres de dichas características, incluyendo efecto killer, velocidad de fermentación media y tolerancia a etanol y SO₂; además, estas tres cepas fueron las más tolerantes a la presión. Adicionalmente, se incluyó la levadura comercial K1-V1116.

La primera fermentación transcurrió de forma normal, alcanzando una densidad constate hacia el sexto día, lo que indicó su término. La evolución de la segunda fermentación, medida por el incremento de la presión en la botella, se presenta en la Figura 3 y se puede observar que para el día siete la levadura de referencia K1-V1116 ya tenía una presión de 5.10 atm, seguida de 436.4 (4.39 atm), MM7 (3.25 atm) y RY5 (2.91). El día 21 se consideró el final de la segunda fermentación, momento en el que K1-V1116, 436.4 y MM7 alcanzaron una presión similar (5.93, 5.83 y 5.75 atm, respectivamente), siendo superiores a RY5 (5.49 atm).

Figura 3 Evolución de la presión de la botella en función de la levadura utilizada para la segunda fermentación de la sidra tranquila. Medias de seis observaciones ± error estándar. 

Durante la segunda fermentación, el CO₂ producido eleva la presión interna de la botella y genera efervescencia al momento de servirlo (^{Liger-Belair et al., 2009}). Se considera que 5 g·L^-1 de azúcar incrementan la presión en aproximadamente 1 atm (^{Navarre, 1998}), lo cual coincide con este estudio, debido a que con 30 g·L^-1 de azúcar se obtuvieron cerca de 6 atm de presión con las cuatro cepas evaluadas. La levadura RY5 resultó la menos eficiente en este aspecto, lo que coincide con el hecho de que fue la menos sobresaliente de las tres en los otros criterios de selección.

Con respecto a los análisis físicos y químicos de las sidras (Cuadro 3), las tres cepas seleccionadas obtuvieron valores similares a los de la cepa comercial. El GA fluctuó entre 8.13 y 8.89 °GL, siendo superior con la cepa RY5. Los AR variaron de 1.65 a 1.96 g·L^-1, lo que corresponde con fermentaciones completas. La AV varió de 0.04 a 0.48 g·L^-1, obteniéndose la mayor concentración con RYS; el pH, de 3.61 a 3.66; la ATT, de 4.05 a 4.28 g·L^-1, y el SO₂, de 202 a 226 mg·L^-1, valores que se encuentran dentro de los estándares establecidos por la norma oficial mexicana para bebidas alcohólicas (^{NOM-199-SCFI-2017, 2017}).

Análisis sensoriales

La prueba de Friedman mostró diferencias significativas (P ≤ 0.05) en todas las variables sensoriales evaluadas (Cuadro 4). En la altura de la corona, la sidra elaborada con 436.4 obtuvo el mayor valor en la suma de rangos (SR = 34.5), correspondiente a una mayor preferencia. De acuerdo con ^{Esteruelas et al. (2015)}, se busca que las sidras tengan una mayor altura de la corona al momento de servirla. Por su parte, con K1-V1116 se alcanzaron los mayores valores de tiempo de reducción de la corona (SR = 40.0), número de trenes (SR = 38.5) y diámetro de la burbuja (SR = 37.5); los valores mayores en esta última variable indican burbujas más pequeñas. Finalmente, con las cepas MM7 y 436.4 se consiguieron los valores más elevados en velocidad de efervescencia (mayor velocidad en el ascenso de las burbujas a la superficie del líquido) (SR = 36.0 y 34.0, respectivamente).

La efervescencia es un atributo fundamental en las bebidas espumantes, ya que es lo primero que perciben los consumidores (^{Brissonnet & Maujean, 1993}; ^{González, 2010}). La levadura utilizada en la segunda fermentación de sidra espumosa afecta su composición, debido, principalmente, a la velocidad de autolisis que permite la liberación de polisacáridos, proteínas, péptidos, aminoácidos libres, lípidos y nucleótidos al medio (^{Alexandre & Guilloux-Benatier, 2008}; ^{Comuzzo et al., 2015}), lo que proporciona a la sidra estabilidad de la espuma, disminución de la astringencia, protección frente a la oxidación, y mayor complejidad aromática y de sabor (^{Pozo-Bayón, Andujar-Ortiz, Alcaide-Hidalgo, Martín-Álvarez, & Moreno-Arribas, 2009}).

En cuanto a la preferencia a nivel visual, destacaron las sidras elaboradas con K1-V1116 y MM7 (SR = 35.5 y 33.5, respectivamente), lo cual coincide con los resultados obtenidos en la evaluación sensorial de la efervescencia producida. En el aspecto olfativo sobresalió la cepa comercial K1-V1116 (SR = 40.0), lo que concuerda con su ficha técnica en la que se reconoce como una levadura productora de ésteres que libera aromas florales y afrutados (^{LALVIN, 2014}). Por su parte, con la cepa RY5 se obtuvo un valor muy bajo (SR = 10.0) en este aspecto; sin embargo, esta cepa alcanzó la mayor preferencia a nivel gustativo (SR = 40.0), encontrándose por encima del testigo. Lo anterior contrasta fuertemente con los valores obtenidos en el resto de las variables, tanto a nivel sensorial como analítico. En términos generales, entre las cepas nativas destacó MM7, contrastando fuertemente con RY5.

Los resultados obtenidos muestran que las cepas nativas pueden producir sidras espumosas de calidad y aceptabilidad comparables con las producidas con cepas comerciales. Los beneficios económicos de contar con una cepa de levadura que produzca una sidra espumosa que destaque en sus características son que puede ser reconocida por el consumidor conocedor y, por lo tanto, puede generar un mayor prestigio y ganancia, tal como ocurre con el champaña.

Identificación molecular de las levaduras

Las homologías con la base de datos mostraron, con suficiente confianza (E-Values de 0 & Query Cover de 99 %), que la cepa RY5 pertenece a Saccharomyces paradoxus (100 % ID), mientras que MM7 y 436.4 pertenecen a S. cerevisiae (99 y 87 % ID, respectivamente). La cepa RY5, con las características menos destacadas, pertenece a una especie poco relacionada con ambientes fermentativos, más bien se ha detectado su presencia en campo (^{Kowallik, Miller, & Greig, 2015}). No obstante, esta cepa tuvo una destacada aceptación gustativa y una alta producción de alcohol, lo cual no ha sido reportado para producción de sidra, por lo que se deberá seguir estudiando.