Introducción

El olivo (Olea europaea L.) es un cultivo preferentemente alógamo que responde positivamente a la polinización cruzada, lo que produce un incremento del amarre de frutos (^{Cuevas & Polito, 1997}; ^{Lavee & Datt, 1978}; ^{Sibbett, Freeman, Ferguson, & Polito, 1992}). El sistema que domina las relaciones de autoincompatibilidad en el olivo es complejo (^{Franklin-Tong & Franklin, 2003}; ^{Seifi, Guerin, Kaiser, & Sedgley, 2011}), lo cual genera que su estudio sea de gran importancia por su trascendencia en la fecundación de las flores y amarre de frutos, y por ende en los diseños de polinización (selección, número y ubicación de pies polinizadores) en las parcelas.

Algunos autores afirman que el olivo presenta una autoincompatibilidad de tipo esporofítico (^{Breton, Farinnelli, & Shafiq, 2014}; ^{Collani et al., 2012}), mientras que otros, atribuyen al olivo una autoincompatibilidad de tipo gametofítico (^{Ateyyeh, Stosser, & Qrunfleh, 2000}; ^{Cuevas & Polito, 1997}; ^{Serrano & Olmedilla, 2012}). Esta última se caracteriza, aunque con excepciones, por la inhibición del crecimiento del tubo polínico, lo que evita (o dificulta) la autofecundación (^{de Nettancourt, 1977}).

Se han desarrollado diferentes métodos para estudiar el nivel de autocompatibilidad de las plantas cultivadas y silvestres. Uno de los métodos más aceptados es el análisis bajo microscopía de fluorescencia de los procesos que conducen al amarre de frutos (^{Heslop-Harrison & Heslop-Harrison, 1970}), en el cual se analizan los niveles de adhesión y germinación del polen sobre el estigma, el crecimiento del tubo polínico a través del estilo y los niveles de fecundación (^{Vuletin-Selak, Cuevas, Goreta-Ban, & Perica, 2018}). Estos análisis permiten identificar la reacción de autoincompatibilidad de una manera clara cuando se comparan muestras de flores sometidas a tratamientos de autopolinización contra polinización libre o cruzada, con polen de otros cultivares seleccionados previamente. Dada la controversia existente al respecto y la trascendencia de la respuesta autoincompatible del olivo, se planteó como objetivo de este trabajo determinar el grado de autoincompatibilidad e identificar el obstáculo a la autofecundación en ‘Manzanilla de Sevillaʼ.

Materiales y métodos

Resultados y discusión

El análisis de la interacción polen-pistilo no mostró diferencias entre tratamientos en la adhesión de los granos de polen (P > 0.05). Se apreció un ligero aumento en el número de granos adheridos en las flores de mayor edad, lo que indica que la receptividad del estigma se mantuvo hasta 9 ddp. Los tratamientos de PL y XS presentaron cerca de 1,900 granos de polen por flor, mientras que con XP y AP se contaron unos 2,000 y 2,200 granos de polen por flor, respectivamente, a los 3 ddp. A los 6 ddp, las diferencias fueron escasas y no significativas (2,700 granos de polen por flor para AP y PL, y 2,800 granos de polen por flor para XS y XP). Las flores de mayor edad (9 ddp) mostraron el mayor número de granos de polen, alcanzando los 3,000 granos en todos los tratamientos, con excepción de XP que obtuvo en promedio 5,500 granos de polen en el estigma (Figura 1a).

Figura 1 Análisis de la varianza de la adhesión (a) y germinación del polen (b) en flores de olivo ‘Manzanilla de Sevilla’ bajo condiciones de autopolinización (AP), polinización libre (PL), y polinización cruzada con polen de ʻGordal Sevillanaʼ (XS) y polen de ‘Picualʼ (XP). Las barras representan la media de 20 observaciones (flores) y su error estándar. Los datos porcentuales fueron sometidos a transformación angular previo a su análisis. ^zMedias con la misma letra en cada día de muestreo no difieren significativamente (Tukey, P ≤ 0.05). 

El porcentaje de granos de polen germinados a los 3 ddp fue de 11.7 % en flores AP, 29.9 % bajo PL, y de 17.1 % en XS y XP. Un notable incremento en la germinación del polen se observó a los 6 ddp para AP, PL y XP, alcanzando valores de 30.6, 44.3 y 22.1 %, respectivamente. El menor nivel de germinación se observó en el tratamiento XS a los 6 ddp, el cual mostró una disminución anómala en los valores (Figura 1b), que se revirtió a los 9 ddp. En esta última fecha, no hubo diferencias significativas entre tratamientos (P > 0.05) (Figura 1b).

La dinámica del crecimiento del tubo polínico en el estilo varió mucho dependiendo del tratamiento de polinización. En este sentido, se observó mayor porcentaje de flores con más tubos polínicos en flores sometidas a los tratamientos de PL, XS y XP. El porcentaje de flores que mostró más tubos polínicos en el estilo fue mucho mayor en condiciones de PL y polinización cruzada (tanto XS como XP), que con AP. Estas diferencias fueron especialmente notables a los 6 y 9 ddp. Con el tratamiento de PL no sólo se observó un número mayor de flores que presentaban tubos polínicos creciendo, sino que, además, fue común ver un número mayor de tubos polínicos por flor. Esto último también se observó en polinización cruzada (XS y XP), situación que rara vez ocurrió con la AP, donde la mayoría de las flores no mostraron ningún tubo polínico en el estilo debido a su detención temprana en el estigma (Figuras 2a y 2b). Como se esperaba, la cantidad de tubos polínicos observados en el tejido de transmisión del estilo fue mayor en las flores más viejas (Cuadro 1), como consecuencia del crecimiento progresivo de tubos polínicos. Este efecto fue más acentuado en los tratamientos de PL y XP, lo que indica la ausencia de rechazo al polen y el crecimiento del tubo polínico sin obstáculos en estos tratamientos.

Figura 2 Crecimiento del tubo polínico en el estilo de ʽManzanilla de Sevillaʼ bajo condiciones de (a) autopolinización y (b) polinización cruzada con polen de ʽGordal Sevillanaʼ a los 9 días después de polinización. 

Debido al diferente crecimiento del tubo polínico entre tratamientos de polinización, los niveles de fecundación fueron más altos en flores de PL, XS (Figura 3) y XP, que en las AP, especialmente a los 9 ddp. Con la PL, más de la mitad (65 %) de las flores muestreadas estaban fecundadas a los 9 ddp, mientras que los porcentajes fueron más bajos con XS y XP, con valores de 20 y 15 %, respectivamente. Por su parte, con AP los niveles de fecundación fueron aún más bajos (5 % de las flores) en el mismo periodo muestreado (Cuadro 2). Una prueba de chi-cuadrado señala que a los 9 ddp la tabla de contingencia muestra alejamiento del patrón esperado, lo que indica que los tratamientos de polinización produjeron diferentes niveles de fecundación. Los resultados no fueron significativamente diferentes en las fechas previas, en donde los porcentajes de flores fecundadas fueron superiores con la PL a los 6 ddp (Cuadro 2).

Figura 3 Fecundación de óvulos procedentes de flores de ʽManzanilla de Sevillaʼ bajo condiciones de polinización cruzada con polen de ʽGordal Sevillanaʼ a los 9 días después de la polinización. Los óvulos se extrajeron del ovario para facilitar su observación. 

Los resultados confirman que ʻManzanilla de Sevillaʼ es un genotipo de olivo fuertemente autoincompatible, ya que el tratamiento de AP derivó en niveles muy bajos y significativamente (P ≤ 0.05) menores de fecundación que la PL. La respuesta autoincompatible en ‘Manzanilla de Sevilla’ se caracterizó, sobre todo, por un escaso crecimiento del tubo polínico en el estilo de las flores AP, además de los niveles menores de germinación del polen a los 3 ddp, tal y como lo reportan ^{Vuletin-Selak, Cuevas, Goreta-Ban, y Perica (2014)}.

Diferentes autores han señalado que en olivo la reacción autoincompatible se caracteriza por la baja capacidad de los tubos polínicos para penetrar más allá de las primeras capas de las células del estigma (lo que pudiera medirse como una menor germinación del polen), así como su incapacidad de crecer en el estilo (^{Bradley & Griggs, 1963}; ^{Cuevas & Polito, 1997}), lo que concuerda con lo observado en este trabajo. Este rechazo al polen propio conduce a una reducción severa en el porcentaje de flores fecundadas bajo autopolinización (^{Shemer et al., 2014}; ^{Vuletin-Selak, Perica, Goreta-Ban, & Poljak, 2014}). Los análisis de interacción polen-pistilo de este trabajo confirman la respuesta autoincompatible de ʻManzanilla de Sevillaʼ y resaltan el fracaso del grano de polen propio en lograr niveles aceptables de fecundación que permitan una productividad suficiente en las parcelas monovarietales.

La adhesión y la germinación del polen en el estigma no mostraron una respuesta clara, aunque hubo ligeras tendencias de mejora bajo los tratamientos de PL, XS y XP, y en flores de mayor edad. Esta evolución confirma una prolongada receptividad del estigma en olivo (^{Vuletin-Selak et al., 2014b}). La PL en la parcela experimental, dada su condición de huerta multivarietal, alcanzó los mayores niveles de fecundación, por encima de los niveles encontrados bajo polinización cruzada (XB y XS).

Conclusiones

'Manzanilla de Sevilla' es un cultivar fuertemente autoincompatible que necesita de polinización cruzada para alcanzar niveles satisfactorios de fecundación de las flores. Los resultados obtenidos en el análisis de la interacción polen-pistilo indican que el escaso crecimiento del tubo polínico, y por ende los bajos niveles de fecundación, comprometen los niveles de amarre de frutos y la productividad en parcelas estrictamente monovarietales. Esta respuesta sugiere una autoincompatibilidad de tipo gametofítico en ʻManzanilla de Sevillaʼ. La polinización libre en un huerto multivarietal mejora los niveles de fecundación. ʻGordal Sevillanaʼ y ʻPicualʼ aparecen como potenciales polinizadores de ʻManzanilla de Sevillaʼ en España, aunque sus niveles de fecundación quedaron por debajo de los obtenidos con polinización libre.