Localización del estudio

El experimento se estableció en campo bajo condiciones de lluvia estacional en la población de Cajones, perteneciente al municipio Gabriel Zamora, Michoacán, México (19º 10’ 49” latitud norte y 101º 58' 13” longitud oeste, a 503 msnm). El clima de este lugar es Aw₀ que corresponde a cálido subhúmedo con lluvias en verano (^{García, 2004}).

Establecimiento del experimento y aplicación de tratamientos

El 8 de julio de 2015 se realizó la siembra de los genotipos de jamaica: Criolla Guerrero (CG), Criolla Michoacán (CM) y Reina Roja (RR) (Figura 1); los cuales son altamente comercializados en Guerrero y Michoacán. Para el estudio, las semillas fueron proporcionadas por productores de estos estados. Los tres genotipos se sometieron a aspersiones foliares con Zn y Cu por separado, y al testigo (sin aplicación foliar, 0). La combinación de genotipos con tratamientos generó nueve combinaciones (CG-0, CG-Zn, CG-Cu, CM-0, CM-Zn, CM-Cu, RR-0, RR-Zn, RR-Cu), que se distribuyeron en campo bajo un diseño experimental de bloques completos al azar en arreglo de parcelas divididas, con cuatro repeticiones. La parcela grande fue el genotipo y la parcela chica los micronutrimentos. En total fueron 36 unidades experimentales, cada una con tres surcos de 3 m de longitud y separación de 0.8 m. Se sembraron dos semillas por mata cada 0.5 m para una densidad de población de cinco plantas por m². A partir de los 15 días después de la emergencia se realizaron aplicaciones foliares hasta punto de goteo con 300 mg. L^-1 de zinc (Zn) y de cobre (Cu), más un testigo sin aspersión. En total se realizaron cuatro aplicaciones cada una con intervalos de siete días.

Figura 1 Genotipos de jamaica utilizados en el presente estudio: A) Criolla Guerrero, B) Reina Roja y C) Criolla Michoacán. 

Las fuentes de los micronutrimentos fueron: sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO₄. 7H₂O) y sulfato cúprico pentahidratado (CuSO₄. 5H₂O). Adicionalmente, a cada mezcla se le agregó 1 mL. L^-1 de adherente Inex^®. Para su aplicación, se utilizó una bomba de 15 L de capacidad equipada con una boquilla de cono vacío (hueco).

La fertilización al suelo se realizó con 80 y 40 kg. ha^-1 de N y P₂O₅, aplicados como urea (46-0-0) y superfosfato de calcio triple (0-46-0). Además, se aplicó 100 % de P₂O₅ y 50 % de N a los 15 días después de la siembra (dds), y el resto del N a los 45 dds.

Determinación del rendimiento y componentes del rendimiento

La cosecha se realizó a madurez fisiológica, cuando los frutos iniciaron con coloración café y las semillas presentaron coloración negra. Esta etapa varió entre genotipos, en Criolla Guerrero y Reina Roja ocurrió aproximadamente a los 145 dds y en Criolla Michoacán a los 156 dds. Del surco central de cada unidad experimental se cosecharon los cálices sin fruto, y en estas estructuras se midieron los componentes del rendimiento: longitud y diámetro de cálices, número de cálices por planta y peso de 10 cálices. Posteriormente, se secaron en una estufa de circulación de aire forzado a 50 °C hasta peso constante.

Determinación de características físico-químicas en cálices secos

De cada repetición de los diferentes tratamientos se prepararon por duplicado extractos acuosos; para lo cual, 15 g de cálices en base seca se pulverizaron en un molino (marca IKA^® modelo MF 10) con malla de 0.5 mm. Del polvo se pesaron 2.5 g que se colocaron en frascos de vidrio (marca Schott Duran^®) de 250 mL, en donde se agregaron 200 mL de agua destilada. La mezcla se dejó reposar 24 h a temperatura ambiente en oscuridad, posteriormente los extractos se colocaron en baño maría a 40 °C por 15 min. En los extractos obtenidos se midió: pH con un potenciómetro Beckman pH Meter^® (método 981.12), sólidos solubles totales (método 932.12) con un refractómetro digital marca ATAGO^® (escala 0 a 32 %), acidez titulable como porcentaje del ácido cítrico presente (método 942.15) y contenido de ácido ascórbico (método 967.21) con 2,6-diclorofenolindofenol. Las determinaciones se realizaron de acuerdo con la metodología de la Association of Official Analytical Chemists (^{AOAC, 1980}).

La concentración de antocianinas se determinó con el método de ^{Abdel-Aal y Hucl (1999)}, para lo cual se pesaron 100 mg de cada muestra pulverizada y se transfirieron a tubos de centrifuga, a cada muestra se le agregaron 10 mL de solución extractora de metanol acidificado (metanol: HCl 1.5N en proporción 85:15 v/v). La mezcla se dejó reposar por 24 h en condiciones de oscuridad a 4 °C. Posteriormente, para evitar variación en el volumen de la solución extractora por efecto de evaporación, se aforó al volumen inicial. Las muestras se centrifugaron a 5,000 rpm por 20 min en una centrifuga Heraeus™ Biofuge Primo R. Se realizó una dilución 1:10 (100 µL del extracto concentrado + 900 µL de metanol acidificado). Finalmente, se leyó la absorbancia del extracto diluido a una longitud de onda de 533 nm en un espectrofotómetro Genesys^® 10 UV (Termo Spectronic), como blanco se usó la solución extractora.

El contenido de antocianinas se estimó como equivalentes de cianidina-3-glucósido con la ecuación: A = (Ab/ɛ)(Ve/1,000)PM(1/Ph)(10 ⁶ ), donde A es la concentración de antocianinas, Ab es la absorbancia del extracto, ɛ es el coeficiente de extinción molar de la cianidina-3-glusósido (25,965 cm^-1. mol^-1), Ve es el volumen total del extracto, PM es el peso molecular de la cianidina-3-glucósido (449) y Ph es el peso de la muestra. El contenido total de antocianinas se expresó en mg de antocianinas por g de materia seca de cálices.

Análisis estadístico

Los datos de las variables se analizaron mediante un análisis de varianza y prueba de comparación de medias entre tratamientos (Tukey, P ≤ 0.05), ambos con el paquete Statistical Analysis System (^{SAS, 2002}).

Rendimiento de cálices y componentes del rendimiento

La aplicación de Zn y Cu no modificó estadísticamente (P ≤ 0.05) la longitud y diámetro de cálices, pero redujeron el número de cálices por planta en Criolla de Guerrero y Reina Roja. En estos mismos genotipos, el Zn incrementó de manera significativa el peso de los cálices, mientras que el Cu favoreció esta variable solo en Reina Roja (Cuadros 1 y 2). Esto generó variación en el rendimiento en la interacción genotipo x micronutrimento; así, en Criolla Guerrero el suministro foliar de estos micronutrimentos redujeron el rendimiento, con Zn la disminución fue 21 % y con Cu 12 %, aunque estas reducciones no difirieron estadísticamente (P ≤ 0.05). Dicho resultado puede ser atribuido a que estos elementos provocaron, en las plantas de Criolla Guerrero, reducciones en el tamaño del dosel vegetal (índice de área foliar) y en el diámetro del tallo; en promedio, estas variables fueron 15 % menores que en plantas sin aplicación.

^{Xing, Huang, y Liu (2010)} mencionan que en algunas plantas el uso de metales pesados en concentraciones altas provoca estrés oxidativo, debido a la producción de especies reactivas que dañan los componentes celulares como el ADN, proteínas y lípidos, lo que afecta el crecimiento y rendimiento de los cultivos. Algunas plantas presentan mecanismo para tolerar el estrés por metales pesados como la exclusión del metal, acumulación del metal y la unión de estos con proteínas ricas en cisteína y metaloproteínas. Además, algunos compuestos en las plantas que actúan como señalizadores pueden estimular el sistema antioxidante para combatir los daños oxidativos en los tejidos como parte de su metabolismo o mecanismo de defensa (^{Thounaojam et al., 2012}). Así, en Criolla Michoacán, la aplicación de estos elementos no provocaron modificaciones significativas (P ≤ 0.05); mientras que en Reina Roja, el Zn incrementó el rendimiento 15.9 %, por lo que esta combinación presentó el rendimiento de cálices más alto (1,232 kg. ha^-1) de todos los tratamientos evaluados (Figura 2).

Figura 2 Rendimiento de cálices secos de jamaica (Hibiscus sabdariffa) en función del genotipo y aplicación de micronutrimentos. 0 = sin aplicación de micronutrimentos, Zn = aplicación de Zn, Cu = aplicación de Cu y DMSH = diferencia mínima significativa honesta. ^zMedias con letra igual entre barras no difieren estadísticamente (P ≤ 0.05). 

Los resultados indican que los genotipos estudiados mostraron diferente grado de sensibilidad a las altas concentraciones de micronutrimentos suministrados vía foliar (300 mg. L^-1 por aplicación); respuesta que también puede ser atribuida a las diferencias entre genotipos. En este sentido, Reina Roja presenta hojas de mayor grosor y tamaño que los otros dos genotipos; asimismo, Criolla Michoacán es el genotipo con el ciclo de cultivo más prolongado. Ambas características pudieron haber reducido el estrés provocado por la aplicación de metales pesados. Las diferencias en el efecto a la aplicación de estos micronutrimentos se han observado en otros cultivos agrícolas como trigo (Triticum aestivum L.), arroz (Oryza sativa L.) y frijol (Phaseolus vulgaris L.), ya que solo en algunos casos el rendimiento agronómico se mejoró con el uso de Zn (^{Ram et al., 2016}).

Resultados similares a los de este trabajo en Reina Roja con aplicación foliar de Zn son reportados por ^{Aziz et al. (2007)}, quienes mencionan que en jamaica con suministro al suelo de Co (20 y 40 mg. kg^-1) y Ni (25 y 50 mg.kg^-1), por separado y combinaciones, obtuvieron un incremento en el rendimiento de cálices frescos y secos de hasta 137 %, donde el componente del rendimiento que más se favoreció fue el número de frutos. De igual manera, los cultivares ‘Jumbo’, ‘Drakkar’, ‘Cossair’ y ‘Pactol’ de Brassica napus L. sometidos a concentraciones de 2,000 µM de ZnSO₄ y 250 µM de CdCl₂ presentaron variación en la producción de materia seca. El ZnSO₄ aumentó 71 % la producción de ‘Jumbo’, mientras que en los otros cultivares ocasionó reducciones de 34 % y el Cd en todos los genotipos provocó el abatimiento de 40 % en sus rendimientos (^{Ghnaya, Charles, Hourmant, Hamida, & Branchard, 2009}). Lo anterior confirma el hecho de que cada especie responde de manera diferente al estrés por metales pesados (^{Alves-Leão et al., 2014}).

Independientemente de la aplicación de metales pesados, se encontró que Reina Roja presentó el rendimiento de cálices más alto, seguido de Criolla Guerrero y Criolla Michoacán, esto como consecuencia de que los cálices de Reina Roja fueron los más largos y de mayor peso. El genotipo con el diámetro de cálices mayor fue Criolla Guerrero, mientras que Criolla Michoacán presentó más cálices por planta, pero ambos fueron los de menor peso (Cuadro 2). Esto demuestra variación en el rendimiento y en los componentes del rendimiento entre estos genotipos. Resultados similares fueron encontrados por ^{Atta et al. (2011)} en ecotipos de jamaica cultivados en campo bajo condiciones de clima cálido y lluvia estacional en Nigeria.

Características físico-químicas del extracto de cálices

La aplicación de Cu y Zn en dosis elevadas provocó diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01) en la acidez titulable, contenidos de antocianinas y de ácido ascórbico, y en ninguno de los genotipos modificó el pH ni los sólidos solubles totales (Cuadro 3). Sin embargo, por ser menos ácidos los cálices de Criolla Guerrero, en cualquier combinación con micronutrimentos, estos presentaron los valores más elevados de pH en comparación con los otros tratamientos (Cuadro 4).

La respuesta de acidez titulable por suministro de micronutrimentos varío en función del genotipo. En Criolla Guerrero se registró un aumento de 41 % con Zn y 33.7 % con Cu, mientras que en Reina Roja no se detectaron diferencias significativas (P ≤ 0.05) y en Criolla Michoacán el Cu redujo la acidez titulable en 15.6 %. De todas las combinaciones de tratamientos, Criolla Michoacán sin aplicación de estos metales y con Zn presentó el más alto porcentaje de acidez titulable, y el más bajo correspondió a Criolla Guerrero.

En la mayoría de los casos, la concentración de ácido ascórbico disminuyó cuando se aplicó Cu y Zn. Criolla Michoacán mostró mayor reducción, 40.9 % con Zn y de 55.8 % con Cu. En Criolla Guerrero con aspersiones de Zn, los cálices presentaron 34.6 % menos de ácido ascórbico y con Cu el decremento fue de 44.9 %, mientras que en Reina Roja el Cu causó la disminución de 23.5 % de ácido ascórbico (Cuadro 4).

Con Zn y Cu, la concentración de antocianinas incrementó en todos los genotipos. En Criolla Michoacán se registró el mayor aumento, donde se aplicó Zn los cálices registraron 175 % más de antocianinas y 187 % con Cu. En Criolla Guerrero, el Zn incrementó 60 % el contenido de antocianinas y el Cu 39 %. El incremento más bajo lo presentaron los cálices de Reina Roja, con Cu 30 % y con Zn la concentración de antocianinas no difirió estadísticamente (P ≤ 0.05) al tratamiento testigo. No obstante, debido al contenido alto de antocianinas en el testigo de Reina Roja, más del doble que Criolla Guerrero y Criolla Michoacán, este genotipo registró 22.7 mg. g^-1 de antocianinas en los cálices secos con la aplicación foliar de Cu, superior a todas las combinaciones de tratamientos (Figura 3).

Figura 3 Concentración de antocianinas en cálices de jamaica (Hibiscus sabdariffa) en función del genotipo y aplicación de micronutrimentos. 0 = sin aplicación de micronutrimentos, Zn = aplicación de Zn, Cu = aplicación de Cu y DMSH = diferencia mínima significativa honesta. ^zMedias con letras iguales entre barras no difieren estadísticamente (P ≤ 0.05). 

Las antocianinas son pigmentos producidos por el metabolismo secundario que pueden incrementar su concentración en las plantas como respuesta al estrés oxidativo, causado por diversos factores, entre ellos la exposición a concentraciones altas de metales (Azis et al., 2007). En el presente estudio, el suministró vía foliar de soluciones de Cu y Zn (300 mg. L^-1) a concentraciones superiores a las requeridas por los cultivos provocaron que los tres genotipos de jamaica aumentarán el contenido de antocianinas en sus cálices con respecto al testigo. Las propiedades antioxidantes de las antocianinas surgen de su alta reactividad como donadores de electrones, de la capacidad de los radicales para estabilizar y deslocalizar al electrón no apareado y de su capacidad para quelar los iones metálicos de transición (^{Alves-Leão et al., 2014}).

Resultados similares a los del presente estudio se han documentado en varios cultivos, como en lenteja de agua (Lemna gibba) por exposiciones con arsénico (^{Alves-Leão et al., 2014}), en Arabidopsis thaliana bajo condiciones in vitro por la adición al medio de cultivo de Cu, Zn, Mn, Pb y Hg (^{Baek et al., 2012}) y en Capsicum annum con la aplicación foliar de Cu y Zn a las hojas jóvenes (^{Stavreva-Veselinovska, Ziranovik, & Djokic, 2010}).

Con el uso de Zn y Cu se incrementó el porcentaje de acidez titulable, lo cual es importante, ya que la acidez tiene un efecto antibacterial y contribuye a la absorción de iones metálicos en el cuerpo humano. Además, la sensación de frescura percibida al tomar una bebida fría de jamaica está relacionada con esta característica (^{Prenesti et al., 2007}). Tanto el Cu como el Zn redujeron el contenido de ácido ascórbico en todos los genotipos, efecto contrario a lo ocurrido con las antocianinas. Al respecto, se ha encontrado que el contenido de ácido ascórbico en cálices de jamaica es inversamente proporcional a la concentración de antocianinas (^{Salinas-Moreno et al., 2012}). Aunque el ácido ascórbico también presenta actividad antioxidante, ésta es menor a la que tienen las antocianinas (^{Hernández et al., 2009}; ^{Sytar et al., 2013}).