Colecta y aislamiento

De jardines y zonas urbanas de Hermosillo, Sonora, se colectaron muestras de tejido con síntomas de muerte descendente de árboles de F. benjamina, se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1 % por 1 min, se enjuagaron tres veces con abundante agua destilada esterilizada y se colocaron en papel secante esterilizado. Los fragmentos de tejido se sembraron en medio PDA (Difco^®) e incubaron a 28 °C durante tres días.

Para la identificación morfológica se realizaron montajes de tejido de cultivos de 10 días de edad y la clasificación del género y especie se realizó con las claves de ^{Crous et al. (2006)} y ^{Phillips et al. (2013)}.

Pruebas de patogenicidad

Se utilizaron cuatro aislamientos de plantas de F. benjamina con síntomas de muerte descendente. Para ello, se inocularon cinco plantas de F. benjamina, de aproximadamente un año de edad, con cada uno de los aislados. Adicionalmente, se utilizaron cinco plantas como control. Para la inoculación de las plantas, se realizaron cortes superficiales en la corteza de aproximadamente 2 x 5 mm y 2 mm de profundidad con una navaja desinfestada con alcohol. En el corte realizado se colocaron trozos del medio PDA con micelio del hongo. En las plantas control se realizaron heridas similares, pero se les colocó medio de cultivo sin el hongo. Para evitar la desecación y contaminación, se cubrieron las heridas con cinta de parafilm.

Identificación molecular y análisis filogenético

El ADN extraído de los cuatro aislamientos inoculados se amplificó parcialmente con los iniciadores: ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) / ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) (^{White, Bruns, Lee, & Taylor, 1990}), RPB2-5F (5’-GAY GAY MGW GAT CAY TTY-3’) / fRPB2-7cR (5’-GGC CCA TWG CYT GCT TMC CC AT-3’) (Liu, Whelen, & Hall, 1999) y LROR (5’-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3’) / LR5 (5’-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3’) (^{Vilgalys & Hester, 1990}), que amplifican las regiones ITS1-5.8S-ITS2, RPB2 y 28S, respectivamente. Los amplicones purificados se secuenciaron en ambas direcciones, usando el respectivo par de iniciadores por separado. El equipo de secuenciación utilizado fue ABI PRISM^® 3700, Genetic-Analyser - Applied Biosystems. Las secuencias de dos aislados representativos de N. dimidiatum, junto con otras secuencias de la familia Botryosphaeriaceae, se alinearon utilizando Clustal W, editadas y analizadas con el método de máxima verosimilitud con el software MEGA 7 (^{Kumar, Stecher, & Tamura, 2016}). Se analizaron un total de 1,345 posiciones. La robustez de los nodos se examinó con un análisis de bootstrap con 2,000 réplicas. Se utilizó a Aplosporella hesperidica CBS:732.79 como grupo externo.

Aislamiento e identificación

Se aisló a Neoscytalidium dimidiatum con una frecuencia de 100 % de plantas de F. benjamina con síntomas de muerte descendente de ramas (Figura 1A), desprendimiento de corteza y cancros en el fuste del tronco; que como consecuencia provocó la emergencia de raíces adventicias. Neoscytalidium pertenece a la familia Botryosphaeriaceae, siendo un género recientemente creado (^{Crous et al., 2006}). Los hongos de la familia Botryosphaeriaceae son organismos típicamente patógenos oportunistas, causando enfermedades solo cuando las plantas están estresadas y con distribución cosmopolita; asimismo, están comúnmente asociados con muerte descendente y cancros de plantas leñosas y arbustivas (^{Bush, 2015}). Neoscytalidium dimidiatum presentó las siguientes características morfológicas: micelio de color verde claro a verde-olivo cuando joven (tres días) y gris-oscuro a negro cuando viejo (siete a diez días), picnidios obscuros en troncos afectados y conidias en cadena de forma elipsoides y globosas, con 0-2 septas al madurar de aproximadamente 3 a 5.5 y 6 a 9.5 µm (Figura 1B).

Figura 1 Características de Neocytalidium dimidiatum. A) Muerte descendente en plantas de F. benjamina; B) artroconidias (arriba) y crecimiento micelial en medio PDA (abajo).  

Las secuencias de la región espaciadora interna transcrita (ITS; KU141333 y KU141334), subunidad grande (LSU; MF508739 y MF508740) y ARN polimerasa subunidad II (RPB2; MF508741 y MF508742) del ADN de los aislados representativos NDFB002 y NDFB003 se depositaron en el Banco de Genes del National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dichas secuencias se compararon mediante la herramienta BLAST del NCBI, mostrando de 99 a 100 % de similitud con Neoscytalidium dimidiatum.

Pruebas de patogenicidad

Las plantas de Ficus benjamina inoculadas con los aislados fúngicos mostraron necrosis y ligero descortezamiento en la zona inoculada a los 40 días después de la inoculación (ddi) (Figura 2D, E, G y H): mientras que en las plantas control no se observaron dichos síntomas (Figura 2C y F):. Las características morfológicas de los aislados obtenidos de las plantas inoculadas coincidieron con los aislados inoculados, cumpliéndose los postulados de Koch.

Figura 2 Síntomas en Ficus benjamina a los 40 días después de la inoculación. C) y F) plantas control, sin y con corte, respectivamente; D) y G) necrosis inducida por N. dimidiatum (aislado NDFB002), sin y con corte, respectivamente; E) y H) necrosis inducida por N. dimidiatum (aislado NDFB003), sin y con corte, respectivamente. 

Las enfermedades ocasionadas por Botryosphaeriaceae spp. son mayores cuando las plantas afectadas están bajo condiciones de estrés. Bajo las condiciones ambientales de Hermosillo, Sonora, de extremo calor y humedad relativa baja, las plantas de Ficus tienen mayor probabilidad de infectarse con N. dimidiatum. La mayor predisposición de las plantas a infecciones por especies de la familia Botryosphaeriaceae por efecto de condiciones ambientales específicas fue reportada por ^{Hassan et al. (2011)}. Ellos expusieron plantas de eucalipto (Eucalyptus camaldulensis) y álamo (Populus nigra) a temperaturas cálidas (32 °C), muy cálidas (40 °C) y a N. dimidiatum, observando que las temperaturas extremas predispusieron a las plantas a una mayor infección por parte del hongo. De igual forma, ^{Sadowsky et al. (2007)} reportaron el efecto de las temperaturas 25, 32 y 40 °C en plantas de pomelo, indicando que las temperaturas extremas (40 °C) son un factor crucial para predisponer a las plantas a la infección por Scytalidium lignicola. En este sentido, ^{Jami et al. (2013)} y ^{Slippers y Wingfield (2007)} mencionan que varios miembros de la familia Botryosphaeriaceae son patógenos latentes que viven como endófitos en sus hospedantes asintomáticos por periodos extensos y que causan enfermedades bajo condiciones de estrés. Particularmente, N. dimidiatum se ha reportado como patógeno de plantas leñosas como nogal (Juglans regia), mango (Mangifera indica), vid (Vitis vinifera L.), Ficus carica y Ficus spp., en las cuales produce síntomas como muerte descendente, necrosis de ramas y cancros en el tallo; así como, muerte de la unión del injerto en plantas de nogal en viveros, entre otros síntomas (^{Al-Saadoon, Ameen, Hameed, Al-Badran, & Ali, 2012}; ^{Chen, Fichtner, Morgan, & Michailides, 2013}; ^{El Atta & Aref, 2013}; ^{Ray, Burgess, & Lanoiselet, 2010}).

Análisis filogenético

Las secuencias concatenadas de las regiones ITS, RPB2 y LSU se compararon con las de aislados de hongos de especies pertenecientes a la familia Botryosphaeriaceae. El análisis multilocus indicó que los aislados de N. dimidiatum (CBS:204.33, CBS:125616 y CBS:125695) se agruparon en la misma rama filogenética que los hongos obtenidos en el presente estudio. Por el contrario, las especies de Botryosphaeria, Macrophomina, Neofusicoccum, Dothiorella, Lasiodiplodia y Diplodia se agrupan en nodos filogenéticamente diferentes (Figura 3).

Figura 3 Árbol filogenético de especies de la familia Botryosphaeriaceae usando el método de Máxima Verosimilitud con secuencias combinadas de la región ITS, LSU y RPB2. Solo se muestran valores de bootstrap ≥ a 60 %. La longitud de las ramas es proporcional a las distancias genéticas. Todas las secuencias relacionadas se tomaron de la base de datos de la colección de cultivos CBS-KNAW del Instituto Westerdijk de Holanda.