Material vegetal y condiciones de crecimiento

El experimento se llevó a cabo en un invernadero de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, México, ubicado a 25° 21’ 12.8’’ latitud norte y 101° 01° 51.9’’ longitud oeste. La siembra se realizó en 2013 con semilla de jitomate (Solanum lycopersicum L.) var. Rio Grande en contenedores de poliestireno de 355 mL de capacidad. Como sustrato se usó peat moss mezclado con perlita en proporción 5:1. La temperatura promedio del invernadero fue de 20.7 °C, la radiación máxima de 741 W∙m^-2 y la humedad relativa de 62.8 %. El riego se llevó a cabo diariamente de forma manual, aplicando 50 mL de solución ^{Steiner (1961)} al 20 %. La C.E. y pH de la solución nutritiva fueron 1.0 dS∙m^-1 y 6.5, respectivamente. El manejo y cuidado del cultivo se hizo de acuerdo con lo establecido por ^{Villasanti (2013)}.

Los tratamientos consistieron en la aplicación de yoduro (I^-) directo al sustrato (S) o foliar (F) a 1 μM de concentración diariamente (D) o 100 μM quincenalmente (15D). Lo mismo sucedió con los tratamientos de yodato de potasio (IO₃^-). La aplicación inició a las cuatro semanas después de la siembra (dds), cuando las plántulas presentaron cuatro hojas, y continuó hasta el momento del muestreo (ocho semanas dds).

Al sustrato de las plántulas testigo solamente se les aplicó solución nutritiva.

Muestreo

El muestreo se realizó bajo un diseño experimental completamente al azar, transcurridas ocho semanas dds. Se tomaron tres plántulas completas por cada tratamiento para la determinación de biomasa y tres para la cuantificación foliar de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos. Siendo cada plántula una unidad experimental. Con los datos obtenidos se hizo un análisis de varianza (P ≤ 0.05), usando el software estadístico ^{InfoStat (2008)}, y prueba de comparación medias de Tukey (P ≤ 0.05).

Análisis de las plántulas

Las plántulas destinadas a la cuantificación de biomasa se secaron en estufa; mientras que las hojas para la cuantificación de antioxidantes no enzimáticos y enzimáticos fueron liofilizadas.

Una vez preparado el material vegetal, se obtuvieron las siguientes variables:

Biomasa. Las plántulas se dividieron en tallo, raíz y hojas, y se pesaron utilizando una balanza digital marca OHAUS®. Posteriormente, se colocaron en un horno de secado, hasta obtener peso constante, a 60 °C. El peso inicial y final se expresó en gramos.

La extracción de biomoléculas se hizo a través de las hojas de las plántulas liofilizadas maceradas con mortero de mano. En un tubo para centrífuga se colocaron 200 mg del tejido macerado, 20 mg de polivinil pirrolidona y 1.5 mL de 0.1 M de buffer de fosfatos (pH 7-7.2), se sometió a sonificación por 5 min, y posteriormente se centrifugó a 12,500 rpm durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante se recolecto y filtró con una membrana de nylon ^{Ramos et al., 2010}). Se diluyó a una proporción 1:15 con buffer de fosfatos.

Superóxido dismutasa (SOD). Se cuantificó la actividad de esta enzima del extracto de biomoléculas en microplaca, utilizando el kit para determinación de SOD (^{SIGMA-ALDRICH, 2014}). El principio de la metodología empleada es la cuantificación por espectrofotometría de la oxidación del colorante WST (water soluble tetrazolium salt) a WST- formazan por los iones superóxido formados mediante el conjunto xantina (XO)/xantina (X) oxidasa. La inhibición en la oxidación del WST es atribuida a la neutralización de los radicales superóxido por la SOD. Las unidades se expresan en porcentaje de inhibición.

Catalasa (CAT). La actividad de la catalasa se cuantificó mediante espectrofotometría; la cual se realizó midiendo dos tiempos de reacción, tiempo 0 (T0) y tiempo 1 (T1). La mezcla de reacción para el blanco se preparó con 0.1 mL del extracto de biomoléculas, 1 mL de buffer de fosfatos con pH 7.2 y 0.4 mL de H₂SO₄ al 5 %, y la mezcla de reacción para el T0 con 0.1 mL de extracto de biomoléculas, 1 mL de H₂O₂ 100 mM e inmediatamente después se añadieron 0.5 mL de H₂SO₄ al 5 %; del mismo modo sucedió para el T1, salvo que los 0.5 mL del H₂SO₄ al 5 % se aplicaron después de 1 min de reacción entre el extracto y el peróxido. La reacción se efectuó a 20 °C bajo agitación constante. Finalmente, el consumo de H₂O₂ se leyó a 270 nm en el espectro de UV-VIS. Las unidades de la actividad (UI) se presentaron en mM de H₂O₂ por minuto entre el total de proteínas ^{Cansev, Gulen, & Eris, 2011}).

Ascorbato peroxidasa (APX). En un tubo para centrífuga se agregó 0.1 mL del extracto de biomoléculas, 0.5 mL de ascorbato a 10 mg∙L^-1 de concentración y 1 mL 100 mM de H₂O₂, a 22 °C (^{Nakano & Asada, 1987}). Después de 1 min la reacción fue detenida con 0.4 mL de H₂SO₄ al 5 %. La tasa de consumo del ascorbato se cuantificó por espectrofotometría a 266 nm. Las UI fueron se expresaron en mM de ascorbato por minuto entre el total de proteínas.

Glutatión peroxidasa (GPX). La medición se realizó con el método establecido ^{Xue, Hartikainen, y Piironen (2001)}, usando H₂O₂como sustrato. En un tubo de ensayo se colocaron 0.2 mL del extracto de biomoléculas, 0.4 mL de glutatión reducido a 0.1 M y 0.2 mL de Na2HPO4 a 0.067 M. Esta mezcla se pre-calentó en baño de agua a 25 °C por 5 min, posteriormente se le agregaron 0.2 mL de H₂O₂ a 1.3 mM para iniciar la reacción catalítica. Se dejó reaccionar por 10 min y se detuvo mediante la adición de 1 mL de ácido tricloro acético al 1 %. Esta mezcla se llevó a baño de hielo por 30 min. Enseguida, la mezcla se centrifugó a 3,000 rpm durante 10 min. Se tomaron 0.48 mL del sobrenadante y se colocaron en un tubo de ensayo, se adicionó 2.2 mL de Na₂HPO₄ a 0.32 M y 0.32 mL de una solución 1 mM del colorante ácido 5,5 ditio-bis-2-nitro benzoico (DTNB). Se leyó en un espectrofotómetro UV-VIS a 412 nm. Las UI se expresaron en mM de glutatión por minuto entre el total de proteínas.

Glutatión (GSH). El glutatión se cuantificó siguiendo la técnica espectrofotométrica establecida por ^{Xue et al. (2001)}, mediante la reacción con ácido 5,5 ditio-bis-2 nitro benzoico (DTNB). En un tubo para centrífuga se colocaron 0.48 mL del extracto, 2.2 mL de fosfato dibásico de sodio (Na₂ HPO₄ a 0.32 M) y 0.32 mL del colorante DTNB a 1 mM. Se mezcló y se leyó en un espectrofotómetro UV-VIS a 412 nm. Los valores se reportaron en mg∙L^-1.

Ascorbato (Asa). Para la extracción del ascorbato se pesaron 200 mg de las hojas liofilizadas y se les adicionó 1 mL de solución agua:acetona en proporción 1:1 (^{Yu & Dahlgren, 2000}). La mezcla se sometió a vórtex por 30 s, se sonificó por 5 min y finalmente se ultracentrifugó a 4 °C a 12,500 rpm durante 10 min; de este proceso se extrajo el sobrenadante. La cuantificación se llevó a cabo mediante el uso del cromatógrafo de líquidos de alta resolución (HPLC) Thermo Spectra system P4000®, bajo las siguientes condiciones: longitud de onda 230 nm, fase móvil NaH₂PO₄ a 50 mM con pH de 2.8, flujo a 1.0 mL∙min^-1 y la columna utilizada fue aquasil C-18 a 60 °C. Los resultados se reportaron en mg∙L^-1.

Fenoles totales (Ft). La cuantificación se realizó mediante espectrofotometría UV-VIS del extracto agua: acetona, relación 1:1, mediante el uso del reactivo Folin- Ciocalteu. Las unidades de concentración se reportaron en mg∙L^-1 (^{Nsor-Atindana, Zhong, Mothibe, Bangoura, & Lagnika, 2012}; ^{Sultana, Anwar, & Ashraf, 2009})

Biomasa

En el presente trabajo, los tratamientos con aplicación diaria recibieron en total 30 μM de yodo y los quincenales 300 μM. Ninguno de los tratamientos mostró reducción de biomasa respecto de las plantas testigo; por el contrario, las aplicaciones diarias mostraron incremento en la biomasa (Cuadro 1). La reducción de biomasa en las plantas es uno de los indicadores más claros de daño por estrés (^{Blasco et al., 2008}; ^{Sairam, Rao, & Srivastava, 2002}).

^{Weng et al. (2008b)} observaron aumento en la biomasa de espinaca cultivada en hidroponía con concentraciones de I^- hasta de 3.3 μM y de IO₃^- hasta 12.5 μM; las cuales fueron inferiores a las empleadas en esta investigación. Por otra parte, ^{Landini et al. (2011)} usaron altas concentraciones de I^-, que van de 5,000 a 20,000 μM, en plantas de jitomate cultivadas en hidroponía, y observaron que, a pesar de sufrir signos de toxicidad como clorosis y quemaduras en el borde de las hojas, las plantas sobrevivieron y produjeron frutos; por lo que concluyeron que las plantas de jitomate son resistentes a concentraciones elevadas de yodo. De modo similar, ^{Kiferle, Gonzali, Holwerda, Real-Ibaceta, y Perata (2013)} llevaron a cabo un experimento con plantas de jitomate aplicando yodo semanalmente al suelo en concentraciones de 1,000, 2,000 y 5,000 μM de I^-, y 500, 1,000 y 2,000 μM de IO₃^- , encontrando que la biomasa de las plantas no se vio disminuida respecto de los testigos salvo con las aplicaciones de 5,000 μM de I^-.

Otras especies de cultivo, como la lechuga, muestran mayor susceptibilidad a la presencia de yodo, reportándose disminución de la biomasa en concentraciones iguales o mayores a 40 μM de I^- en hidroponía, pero sin mostrar afectación hasta con 240 μM de IO₃^- (^{Blasco et al., 2008}).

Superóxido dismutasa

La actividad enzimática de SOD presentó disminución en la mitad de los tratamientos, comparados con las plantas testigo. Los tratamientos que mostraron tal comportamiento fueron: I^- foliar y I^- al sustrato aplicados cada quince días, así como en IO₃^- y I^- foliar aplicado diariamente (Cuadro 1). Estos resultados son similares a los reportados por ^{Blasco et al. (2011)} para el caso de los tratamientos con I^- a 20, 40 y 80 μM, los cuales evidenciaron reducción en la actividad de SOD respecto de las plantas testigo de lechuga. No obstante, los mismos autores encontraron que el IO₃^- , a concentraciones mayores de 40 μM, presentó aumento en dicha actividad. ^{Leyva et al. (2011)} obtuvieron incremento en la actividad de esta enzima tras la aplicación de IO₃^- a 80 μM. Por otro lado, ^{Gupta et al. (2015)} encontraron que esta misma actividad aumentó en los tratamientos con IO₃^- a 40 μM, pero no con 20 ni 80 μM.

El anión superóxido es usualmente el primer radical libre formado de manera natural en la fotosíntesis y respiración; por lo tanto, la SOD representa la línea primaria de control del estrés oxidativo (^{Gill & Tuteja, 2010}). A pesar de ello, en este experimento se encontró disminución en la actividad de esta enzima. Aunque en plantas terrestres existen pocos reportes al respecto, en plantas marinas se ha encontrado que el yoduro es capaz de reaccionar de manera rápida y directa con radicales libres provenientes de los sistemas bioquímicos energéticos, tales como el superóxido, el oxígeno singlete e incluso sobre el hidroxilo, a tasas de 12 a 500 veces más altas que el ascorbato o el glutatión (^{Küpper et al., 2008}; ^{Luther, Wu, & Cullen, 1995}). Es posible que eso mismo pueda ocurrir en el caso de plantas de jitomate, dando lugar a una neutralización directa de dichos radicales libres formados y originando, por ello, una disminución en la actividad de SOD.

Catalasa

En lo que respecta a la actividad de la catalasa, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las plantas tratadas y las testigo. Este resultado es contrario a lo obtenido por otros autores, como ^{Blasco et al. (2011)}, quienes observaron incremento en la actividad de esta enzima a concentraciones mayores de 80 μM, tanto de I^- como IO₃^- , encontrando, además, graves daños de toxicidad y reducción de biomasa. ^{Gupta et al. (2015)} también reportaron aumento en la actividad de catalasa en tratamientos con IO₃^- a 40 μM, pero en combinación con CdCl₂ a 100 μM; lo cual posiblemente sea debido al estrés inducido por el metal pesado. La función de la catalasa es reducir el peróxido a oxígeno y agua para impedir la formación del radical OH^- (^{Asada, 1999}). Es probable que al disminuir la actividad de SOD la formación de H₂O₂ también se redujera, manteniendo la actividad de la CAT en un nivel basal; lo que podría explicar la ausencia de diferencias.

Ascorbato peroxidasa

Al igual que para la CAT, la APX no mostró diferencias significativas en comparación con las plantas testigo. Resultado contrario a lo obtenido en plantas de lechuga por ^{Blasco et al. (2011)}, quienes observaron incremento en la actividad de APX tras la aplicación de yodo en forma de IO₃^- con todas las concentraciones (20, 40 y 80 μM), sin observar reducción de biomasa.

Por su parte, ^{Gupta et al. (2015)} evidenciaron aumento en la actividad de APX tras la aplicación de IO₃^- a 20 y 40 μM en plantas tratadas con CdCl₂ a 100 μM. Se sabe que la APX está involucrada en la destoxificación del H₂O₂, usando como donador de electrones al ascorbato (AA). En este trabajo los tratamientos con yodo, aparentemente, no modificaron el estatus basal de esta enzima, posiblemente por el efecto antes explicado de la disminución de la SOD y por ende menor producción de H₂O₂.

Glutatión peroxidasa

De modo similar a lo descrito anteriormente para APX y catalasa, la actividad de GPX no mostró diferencias entre tratamientos. Dado que esta enzima también degrada H₂O₂, probablemente la ausencia de diferencias entre tratamientos también pueda explicarse como consecuencia de la menor actividad de SOD.

Glutatión

En los resultados obtenidos de GSH, se encontró incremento en dos de los cuatro tratamientos con aplicación quincenal de IO₃^- y I^- al sustrato. Mientras que, el efecto fue notable en el tratamiento de aplicación diaria de I^- foliar; el cuál coincide con la disminución de la actividad de la SOD.

Si bien no se encontró información acerca de la relación entre el yodo y el glutatión en tomate, en plantas de lechuga cultivadas en hidroponía, ^{Leyva et al. (2011)} obtuvieron aumento en la concentración de glutatión tras la aplicación de IO₃^- a 20 μM. La respuesta, sin embargo, fue diferente en el estudio de ^{Blasco et al. (2011)} quienes encontraron, también en la lechuga, disminución en la concentración del glutatión con IO₃^- a 80 μM. Lo anterior pone en evidencia que la influencia del yodo varía de acuerdo con la especie vegetal, formas químicas y concentraciones aplicadas, entre otros factores.

Ascorbato

La concentración del ascorbato incrementó tras la aplicación diaria de I^- foliar. Mismo tratamiento en el cual se evidenció disminución de la actividad de SOD e incremento en la concentración de GSH (Cuadro 1). Por su parte, ^{Weng et al. (2008b)} reportaron aumento en la concentración del ascorbato en espinacas cultivadas en hidroponía al añadir I^- a 0.33 y 0.66 μM, pero no ocurrió lo mismo con IO₃^- . Por otro lado, ^{Blasco et al. (2011)} presentaron la mayor concentración de ascorbato en lechuga con los tratamientos de I^- a 80 μM; misma concentración en la cual las plantas presentaron severa disminución en la biomasa. Asimismo, ^{Leyva et al. (2011)} encontraron incremento de ascorbato en plantas de lechuga al aplicar IO₃^- a concentraciones menores de 40 μM. La discrepancia en los resultados quizá pudiera explicarse por el uso de diferentes especies vegetales y formas químicas de yodo.

Fenoles totales

Los fenoles totales no presentaron diferencias estadisticas significativas entre los tratamientos y el testigo. Además, no se encontraron trabajos en los cuales cuantificaran estos compuestos tras la aplicación de yodo. Sin embargo, parte de la explicación del por qué el yodo no modificó el estatus basal de estos compuestos pudiera relacionarse con el hecho de que la acumulación de fenoles es inducida en respuesta a la mayor cantidad de H₂O₂ resultante del estrés oxidativo (^{Sakihama, Cohen, Grace, & Yamasaki, 2002}). De nuevo, la menor actividad de SOD, posiblemente derivada de un efecto antioxidante del yodo, pudo ser la causal de la ausencia de diferencias entre tratamientos.