Selección de variables informativas

A partir de 62 caracteres morfológicos evaluados, los análisis de covarianza sucesiva lograron reducir la dimensionalidad de la matriz de datos al identificar a 15 con mayor relevancia para discriminar colectas: peso de semilla, longitud de hoja primaria, ancho de hoja primaria, forma de fruto, color de fruto inmaduro, longitud de fruto, ancho de fruto, firmeza de fruto, color de pericarpio, número de lóculos, longitud del sépalo, longitud de pétalo, longitud de estambre, tamaño de la planta y número de nudos. Estos caracteres fueron empleados para realizar los análisis multivariados subsecuentes; el resto no fueron considerados por no tener utilidad para diferenciar colectas, o bien, debido a su alta asociación con las variables seleccionadas.

Los resultados anteriores indican que todas las estructuras de la planta mostraron variabilidad (hojas, frutos, flores y tamaño de planta), lo cual fue de utilidad para la discriminación de colectas.

En el trabajo de ^{Pacheco-Triste, Chávez-Servia, y Carrillo-Rodríguez (2014)}, se obtuvieron resultados similares donde las diferencias entre poblaciones caracterizadas se debieron a la divergencia en características de fruto y planta; por otra parte, ^{Carrillo-Rodríguez y Chávez-Servia (2010)} detectaron que el número de flores por racimo, peso medio de frutos, frutos por racimo y total de frutos al quinto racimo, tuvieron alta variación entre colectas estudiadas bajo invernadero.

Análisis de agrupamiento

El dendrograma de la Figura 1, construido con el algoritmo de mínima varianza de Ward, con altura de corte de 0.1 r² semiparcial, definida a partir del criterio cúbico de agrupamiento, la pseudo F y la pseudo t², determinó que el número de grupos óptimos fueron tres, los cuales incluyeron 16, 31 y 8 colectas, respectivamente. Si bien la mayoría de los trabajos utilizan el método UPGMA, en el presente se considera que al trabajar con colectas de varias regiones del país realizadas con diferentes criterios, el método de Ward es el adecuado para este tipo de análisis, con base en las ventajas mencionadas por ^{Núñez-Colín y Escobedo- López (2011)}: reduce la presencia de individuos atípicos y es de mayor utilidad cuando el objetivo del trabajo es conocer la variabilidad existente en genotipos de una especie o género específico.

Figura 1 Dendrograma jerárquico de caracteres morfológicos, derivado de distancias euclidianas cuadradas y algoritmo de mínima varianza de Ward. C: colecta. 

Análisis discriminante

El análisis discriminante realizado con el fin de corroborar las agrupaciones del análisis anterior y detectar la importancia relativa de los caracteres en la conformación de los tres grupos, consideró como variable categórica a dichas agrupaciones. Al ser tres los grupos incluidos en el análisis, las dos variables discriminantes (VD) generadas explicaron el total de la variabilidad observada. La primer VD representó 80.7 % y la segunda el restante 19.3 %.

La estructura canónica total indicó las asociaciones lineales entre las funciones discriminantes generadas y los 15 caracteres usados en el análisis. La VD1 se asoció en forma positiva con la forma del fruto, ancho del fruto y número de lóculos, y en forma negativa con el número de nudos; lo cual quiere decir que colectas con altos valores de VD1 tuvieron frutos más redondos, color verde intenso antes de la madurez, mayor anchura de fruto y menor número de nudos en un metro lineal de planta y viceversa. En lo que respecta a la VD2 tuvo asociación positiva con longitud y ancho de fruto; y en forma negativa con el tamaño de planta; es decir, colectas con altos valores en VD2 tienen mayor longitud de fruto y tamaño de planta pequeña y viceversa. Con base en lo anterior, en el Cuadro 2 se muestran las características morfológicas de los grupos generados y los genotipos que los conforman.

Resultados similares se encontraron por Vásquez-Ortiz, ^{Carrillo-Rodríguez, y Ramírez-Vallejo (2010)} al discriminar colectas con base en caracteres cualitativos y cuantitativos de fruto, flor y hoja. El estudio de ^{Agudelo-Agudelo, Ceballos-Aguirre, y Orozco (2011)} mostró que el color de la corola, la pubescencia del hipocotilo y el tipo de hoja, no fueron útiles para discriminar colectas, por otra parte el color y su intensidad, la forma del fruto y el tipo de crecimiento de la planta fueron eficientes para diferenciar colectas.

A partir de los valores de VD1 y VD2 asignadas a cada colecta, se generó la Figura 2 en la cual se verifica la conformación de grupos obtenidos en el análisis de agrupamiento.

Figura 2 Representación gráfica de variables discriminantes (VD1 y VD2) de tres grupos de colectas nativas de tomate de acuerdo con sus características morfológicas. 

El grupo 1 estuvo constituido por plantas con frutos tipo riñón, mientras que el grupo 2 mostró colectas con fruto tipo cereza en su mayoría, algunos con forma de riñón y uno cilíndrico, los cuales son similares en el largo y ancho, por lo que se asemejan a frutos redondos. El grupo 3 contiene genotipos con frutos de tamaño grande al tener el mayor diámetro, con forma cilíndrica o riñón. Este mismo patrón de agrupación basado en caracteres de fruto fue encontrado por ^{Carrillo-Rodríguez y Chávez-Servia (2010)}; por ejemplo, en un grupo con predominancia de frutos tipo riñón, encontraron otros tipo pera; en otro donde se congregaron alta frecuencia de frutos con menor tamaño y peso, hubo variaciones en la forma, desde grandes tipo riñón, a redondos muy pequeños con diámetro de 1 cm.

El promedio del diámetro ecuatorial de fruto de las 55 colectas estudiadas fue de 3.81 cm, en tanto que polar fue 3.29 cm y el número de lóculos promedio correspondió a 3.18. La comparación de estos valores con los obtenidos en estudios previos sobre diversidad de tomates (^{Bonilla-Barrientos et al., 2014}; ^{Álvarez-Hernández, Cortés-Madrigal, & García-Ruíz, 2009}) sugiere que, al igual que ^{Lobato-Ortiz et al. (2012)} y ^{Chávez-Servia, Carrillo-Rodríguez, Vera-Guzmán, Rodríguez-Guzmán, y Lobato-Ortiz (2011)}, existe gran variabilidad en poblaciones nativas, lo que es de gran utilidad para programas de mejoramiento genético; razón por la cual toma relevancia su estudio y conservación.

En la prueba de resustitución realizada con las funciones lineales discriminantes (^{Johnson, 1998}), se corroboró que el agrupamiento realizado fue el correcto ya que ninguna colecta evaluada fue colocada en algún grupo diferente al original.

Caracterización molecular

Los 16 iniciadores ISSR utilizados en la caracterización molecular generaron 118 bandas de las cuales sólo 81 fueron polimórficas, con porcentajes de variación entre 10 y 90 % dentro de las colectas estudiadas. Así, se generaron en promedio siete bandas por iniciador, de las cuales cinco fueron polimórficas, lo que representó 68.7 % de polimorfismo total. Con base en los resultados de ^{González-Aguilera et al. (2011)}, se considera que el nivel de polimorfismo obtenido fue adecuado para realizar la caracterización y establecer las diferencias genéticas de los tomates nativos evaluados. El iniciador ISSR1 tuvo el mayor número de bandas polimórficas (12) y 70.6 % de polimorfismo. Los iniciadores con mayor polimorfimo en el presente trabajo fueron los que presentan las secuencia de aminoácidos (GA)₈ o (CA)₈; resultados que coinciden parcialmente con los de ^{González-Aguilera et al. (2011)} y ^{Tikunov, Khrustaleva, y Karlov (2003)}.

La técnica empleada es de gran utilidad para determinar la variabilidad genética en plantas autógamas como tomate, ya que, tanto a partir de los presentes resultados, como los de ^{González-Aguilera et al. (2011)} y ^{Tikunov et al. (2003)}, el polimorfismo detectado permitió clasificar las colectas evaluadas en forma adecuada.

Análisis de agrupamiento

Las distancias genéticas de Jaccard, que promediaron 0.48, junto con el método de Ward, generaron el dendrograma de la Figura 3. La altura de corte (0.04 r² semiparcial), definida mediante los pseudo t² y la pseudo F, determinó que el número óptimo de grupos fue siete.

Figura 3 Dendrograma jerárquico de marcadores moleculares (81 bandas polimórficas), derivado de distancias genéticas de Jaccard y algoritmo de mínima varianza de Ward para 55 colectas de tomate nativo de México. 

Si bien la mayoría de las colectas procedentes de la misma región tienden a agruparse, existe presencia de colectas de zonas diferentes dentro de un grupo específico (Figura 3); por lo que es probable que compartan áreas de adaptación con características edáficas y climáticas semejantes; lo que explica la mayor similitud en su constitución genética, situación mencionada por ^{Benor, Zhang, Wang, y Zhang (2008)}, en líneas de tomate cuyas agrupaciones obedecieron al origen geográfico de los individuos.

Caracterización molecular y morfológica

Al comparar los resultados de los agrupamientos de la caracterización morfológica y de la molecular como se muestra en el Cuadro 3, solo 14 colectas (26.5 %) siguieron el mismo patrón de agrupamiento y se ubicaron dentro de grupos similares en los dos análisis. El resto de colectas (73.5 %) se ubicaron en grupos diferentes debido a que en los caracteres morfológicos se generaron tres grupos, en tanto que el análisis molecular generó siete.

La caracterización morfológica al producir menor número de grupos, indica que los caracteres empleados tuvieron menor variación en las 55 colectas; en tanto que la molecular permitió estimar con mayor precisión la variación genética, atribuido a que los marcadores ISSR, teóricamente, no interaccionan con el medio ambiente. Por otra parte, al no expresarse variaciones genéticas restringidas por el ambiente único de evaluación (^{Boada-Higuera et al., 2010}), las caracterizaciones morfológicas pueden perder precisión en la estimación de la variación al confundir los efectos tanto genéticos como los de la interacción genotipo x ambiente como lo sugiere ^{Sultan (2000)}, quien indica que debido a la plasticidad fenotípica, un genotipo puede alterar su desarrollo y fisiología de acuerdo con las condiciones ambientales en donde crece.

Las coincidencias encontradas en este trabajo ocurrieron sólo en el grupo 2 de morfológicos y el grupo 2 de moleculares, las colectas comparten el tipo de fruto cereza, y aunque no todas son de la misma región del país, son originarias de lugares con condiciones ambientales similares, lo que determina la similitud genética de estas colectas: C12 (Oaxaca, Cereza), C25 (Oaxaca, Cereza), C24 (Chiapas, Cereza), C18 (S.L.P., Riñón), C17 (Oaxaca, Cereza), C2 (Puebla, Cereza), C26 (Veracruz, Cereza), C28 (Chiapas, Cereza), C29 (Oaxaca, Cereza), C27 (Veracruz, Cereza). ^{Benor et al. (2008)} generaron una agrupación inicial basada en las coincidencias moleculares; en un segundo nivel, se conformaron subgrupos de líneas con orígenes similares, lo que asociaron a las similitudes genéticas.

Aunque las colectas fueron ubicadas en grupos morfológicos diferentes a los generados por los grupos moleculares, los resultados sugieren que los marcadores ISSR son de gran ayuda para diferenciar los materiales y determinar las colectas repetidas en un banco de germoplasma, evitando el almacenamiento de materiales con las mismas características que no son expresadas en un mismo ambiente de evaluación (^{González-Aguilera et al., 2011}; ^{Zuriaga et al., 2009}). Por ejemplo, las colectas 19, 20 y 21 tienen el mismo tipo de fruto y son originarias del mismo lugar; así, es posible tomar la decisión sobre la colecta a conservar con base al mayor polimorfismo obtenido.

La caracterización morfológica tuvo una duración de nueve meses en condiciones de invernadero con el registro de 62 variables; en tanto, la molecular se realizó solo en tres meses a partir de material vegetal proveniente de plántulas. Debido a que no siguieron el mismo patrón de agrupación, la realización de ambas representó un incremento de 37.5 % en la eficiencia de la discriminación de genotipos, por lo que deben ser consideradas como complementarias e indispensables. Con ello se mejora la capacidad de detectar diferencias entre genotipos y se incrementa la precisión al generar grupos de conservación con mayor variabilidad genética.

Estrategia de conservación

Los resultados de la caracterización morfológica obedecieron a un conjunto de variables fenotípicas, asociadas principalmente a la forma del fruto, esto permitió discriminar colectas y ubicarlas en tres grupos homogéneos en su interior y heterogéneos entre ellos (Grupo 1 riñones, Grupo 2 Cereza y Grupo 3 cilíndrico o redondo). La elección de genotipos a conservar dentro de cada conjunto puede realizarse mediante otras cualidades como: orígenes, color de fruto, forma de fruto, uso antropocéntrico, etc.

En cambio, cuando solo se cuenta con una caracterización molecular, no es posible ponderar o diferenciar las colectas que componen un grupo, ya que los marcadores son aleatorios y dominantes y es posible perder la precisión de la estimación de la variación genética. Otra consideración en esta discusión es que las colectas generalmente están compuestas por varios genotipos; por lo que al utilizar mezclas de ADN de las plantas evaluadas con el fin de ahorrar recursos, se pierde la posibilidad de identificarlas individualmente; así, la elección de colectas a conservar dentro de cada grupo sería aleatoria.

En el presente estudio la caracterización morfológica detectó menor diversidad que la molecular y generaron diferentes patrones de agrupamiento, corroborando que son estudios complementarios como lo demostraron ^{Demey, Zambrano, Fuenmayor, y Segovia (2003)}.

Cuando se combinaron ambas caracterizaciones, el grupo 1 de la caracterización morfológica, con frutos tipo riñón, fue dividido en siete subgrupos por la caracterización molecular; el grupo 2 con frutos tipo cereza en 6 subgrupos y el grupo 3, frutos cilíndricos, en 3 subgrupos. Esto generó 16 subgrupos (Cuadro 3).

Bajo estas consideraciones, la caracterización molecular mejora en gran medida la eficiencia de la conservación de los recursos genéticos ya que permite estimar dentro de cada grupo obtenido en la caracterización morfológica, variación genética no detectada por la primera; con ello se disminuye el error de clasificación y permite analizar de forma adecuada la variabilidad genética estudiada por ambas caracterizaciones como lo menciona ^{Demey et al. (2003)}.

De acuerdo a ^{Rao et al. (2007)} las muestras de semillas que serán conservadas deben ser genéticamente distintas de cualquier otra accesión ya registrada en un banco de germoplasma. En la presente situación esto se puede garantizar al conservar una colecta de cada uno de los 16 subgrupos identificados en el Cuadro 3; o bien mediante una mezcla de semillas de los genotipos integrantes de cada subgrupo.

Con base en lo anterior, para realizar la conservación eficiente de la variación genética estudiada, la selección de los genotipos de cada subgrupo (Cuadro 3), para su resguardo en el banco de germoplasma, se basará en el mantenimiento de orígenes diferentes y de caracteres diferenciales del fruto como color y forma. En caso de no disminuir el número de colectas con los criterios anteriores, el último criterio de selección será el uso antropocéntrico.

Así, la propuesta de conservación de la variación genética a partir de las 55 colectas evaluadas, y con base en los criterios mencionados anteriormente, consiste en el resguardo de 37 colectas indicadas en el Cuadro 3, lo que representa 67 % del total de colectas evaluadas, con lo cual se elimina la duplicidad de genotipos.

En un caso más drástico, y al basarse en que el ADN caracterizado es una mezcla proveniente de varios individuos que componen una colecta, la recomendación sería el conservar un compuesto balanceado de semilla de las colectas que conforman un subgrupo. Así, en nuestro caso se conservarían 16 muestras.