Material biológico

Las cepas bacterianas empleadas fueron Bacillus thuringiensis UM96 y Pseudomonas fluorescens UM16, UM240, UM256 y UM270; las cuales fueron aisladas de la rizosfera de plantas y caracterizadas previamente (^{Martínez-Absalón et al., 2012} y ²⁰¹⁴; ^{Hernández-León et al., 2015}; ^{Hernández-Salmerón et al., 2016}). Las semillas de maíz (Zea mays) y de tomate verde (Physalis ixocarpa Brot. ex Horm.) fueron adquiridas en la casa comercial de semillas “Vita” (Morelia, Michoacán, México).

Experimento de antagonismo entre cepas

Antes de realizar experimentos de co-inoculación bacteriana, se determinó si existe antagonismo in vitro entre las cepas analizadas (^{Garbeva, Silby, Raaijmakers, Levy, & de Boer, 2011}). Por lo tanto, se cultivaron B. thuringiensis UM96 y P. fluorescens UM16, UM240, UM256 y UM270 por 24 h, y se midió la densidad óptica (DO); posteriormente, se inocularon 1 x 10⁶ ± 0.1 x 10⁶ unidades formadoras de colonia (UFC) de cada cepa. Esto se hizo en cajas Petri con agar nutritivo (AN) a manera de gota, a 1.5 cm de distancia. Se esperó a que la gota se secara y se incubaron en 28 °C durante 24 h. Se realizaron tres repeticiones por cada tratamiento. En seguida, se recogió el crecimiento de cada caja por separado y se realizaron diluciones para determinar nuevamente las UFC (^{Garbeva et al., 2011}).

Inoculación bacteriana y tratamiento de las semillas

Para determinar la capacidad de colonización de las cepas bacterianas de B. thuringiensis y P. fluorescens, se empleó el método propuesto por ^{Scher et al. (1984)}, con algunas modificaciones. Este método sugiere el análisis de colonización de raíz o rizoplano; sin embargo, en este trabajo se considera a la colonización como parte de la rizosfera. Se inocularon (por tratamiento) de 25 a 30 semillas de Zea mays con cada una de las cepas de Bacillus y Pseudomonas, así como las siguientes combinaciones (consorcios) entre la cepa B. thuringiensis UM96 y cada una de las P. fluorescens (UM96 + UM16, UM96 + UM240, UM96 + UM256 y UM96 + UM270). Cada semilla se inoculó de 10³ a 10⁴ UFC de cada cepa, y de los consorcios se inocularon de 10⁵ a 10⁶ UFC por semilla, en solución con 0.1 M de MgSO₄. Las semillas control fueron inoculadas únicamente con la solución MgSO₄. La desviación estándar en cada inóculo nunca fue mayor al 10 %. La media de las UFC por semilla fue determinada por triplicado después de cultivarse en cajas Petri con AN en 28 °C durante 48 h.

Experimentos de colonización rizosférica

Una vez que las semillas se inocularon, se colocó una por cada tubo de vidrio de 25 x 200 mm, los cuales habían sido previamente llenados con arena (6 cm). Después, se agregó suelo (4 cm) y se sellaron con Parafilm. El suelo se colectó en Zamora, Michoacán, México, cuyas características fisicoquímicas han sido analizadas y publicadas previamente (^{Velázquez-Sepúlveda, Orozco- Mosqueda, Prieto-Barajas, & Santoyo, 2012}). Los tubos se colocaron en una cámara de crecimiento Percival (Percival Scientific, Perry, IA USA), con fotoperiodo de 16 h luz por 8 h obscuridad a 22 °C durante 30 días. Se realizaron tres repeticiones por cada tratamiento.

Después de 30 días de incubación, las plantas se removieron cuidadosamente y las raíces que crecieron en la arena se cortaron y obtuvieron fragmentos de 1 g. Cada fracción se colocó en un vial con 1 mL de 0.1 M de MgSO₄, se realizaron diluciones (por triplicado) y se plaqueó en AN con 100 μg de carbencilina por mL. Para corroborar que las colonias recuperadas pertenecieran a las cepas pre-inoculadas, se llevaron a cabo análisis de amplificación de fragmentos al azar de polimorfismos del ADN (random amplified polymorphic DNA, RAPD por sus siglas en inglés). Para tal objetivo, se aisló el ADN genómico (^{Sambrook, & Russel, 2001}) de colonias elegidas al azar para amplificar , por reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR por sus siglas en inglés), el patrón de bandas de cada cepa con el oligonucleótido OPA-02 (5′-TGCCGAGCTG-3′) (^{Hernández-Salmerón, Prieto-Barajas, Valencia-Cantero, Moreno- Hagelsieb, & Santoyo, 2014}).

Efecto promotor del crecimiento en Physalis ixocarpa Brot. ex Horm.

Para determinar el efecto promotor de las cepas por separado y en consorcio, se empleó el método de ^{Long, Schmidt, y Baldwin (2008)} de inoculación de semillas (vigor de plántulas) en papel, con algunas modificaciones. Posteriormente, semillas de tomate verde se esterilizaron e inocularon con los diferentes tratamientos de cultivos bacterianos (10⁸ UFC∙mL^-1) en agua destilada estéril por 24 h. Las semillas control únicamente se trataron con agua destilada estéril por el mismo tiempo. Subsiguientemente, de 15 a 20 semillas tratadas, y los respectivos controles, se colocaron en papel Whatman inmerso en agua destilada, envuelto en polietileno para evitar desecación, e incubadas en 25 °C por siete días. Se cuantificó el porcentaje de semillas germinadas, la longitud del hipocótilo y raíz, y el peso total de las plántulas. Se realizaron tres repeticiones por cada tratamiento.

Antagonismo in vitro entre cepas

Cuando se pretende realizar experimentos de co-inoculación bacteriana uno de los primeros aspectos a analizar es el del antagonismo entre cepas, en especial si se trata de diferentes especies. Por lo tanto, el panel A (Figura 1) muestra el crecimiento de las cepas de B. thuringiensis y P. fluorescens, las cuales fueron coinoculadas en la misma caja Petri. El resultado evidencia que el desarrollo de ambas cepas no tiene algún tipo de antagonismo, ya que no presenta diferencias significativas en las UFC al final del experimento. En el panel B (Figura 1) se exhibe el crecimiento del experimento de confrontación donde, de igual forma, no se observa antagonismo, lo que indica que no se afecta el crecimiento de alguna cepa de P. fluorescens en presencia de B. thuringiensis, y viceversa.

Figura 1 Interacción competitiva entre Bacillus thuringiensis UM96 y Pseudomonas fluorecens (UM16, UM240, UM256 y UM270). El panel superior (A) muestra el crecimiento de las cepas de forma individual en Unidades Formadoras de Colonias (UFC∙cm^-2), mientras que el panel inferior (B) muestra los valores en UFC∙cm^-2 del experimento de competencia y antagonismo entre cepas. Los valores mostrados son la media de tres réplicas independientes. Las barras muestran la media ± valores de error estándar (n. 15). Las letras diferentes encima de las barras indican diferencias significativas por medio de la prueba de rango múltiple de Duncan (P < 0.05). 

Las RPCV contienen comúnmente un arsenal de metabolitos antimicrobianos. En particular, las bacterias pertenecientes a los géneros Bacillus y Pseudomonas producen compuestos como antibióticos, lipopéptidos, bacteriocinas y compuestos volátiles (^{Glick, 2014}; ^{Santoyo et al., 2012}). Las bacterias analizadas pertenecen a microorganismos gram positivos (Bacillus) y gram negativos (Pseudomonas), por lo que se podría hipotetizar que algún antibiótico que afecte la pared celular podría inhibir su crecimiento.

Otros estudios han mostrado efectos antagónicos entre RPCV, las cuales por separado son excelentes bioinoculantes, pero no cuando se coinoculan (^{Kang et al., 2014}). Sin embargo, en este trabajo no se observó de forma directa algún tipo de antagonismo in vitro entre cepas de Bacillus y Pseudomonas, por lo que se procedió a estudiar si existía algún tipo de efecto sinérgico.

Colonización de la rizosfera

Una vez determinado que no existía antagonismo entre las cepas, se procedió a realizar el experimento de colonización de raíz (o rizosfera) en plantas de maíz. El Cuadro 1 muestra los resultados obtenidos. En el caso de la cepa B. thuringiensis UM96 se inocularon 2.6 x 10³ UFC por semilla y se recuperaron 1.42 x 10⁷ UFC por semilla, registrándose un incremento significativo. Lo mismo se observó en las cuatro cepas de Pseudomonas, en donde aumentó de entre 10₃ y 10⁴ a 10⁶ y 10⁷, respectivamente.

Una vez analizada la capacidad de colonización de las cepas por separado, se estudiaron los consorcios Bacillus-Pseudomonas. Los resultados del experimento mostraron alta capacidad de colonización de la rizosfera en los cuatro consorcios (Cuadro 2). Por ejemplo, UM96 + UM16, UM96 + UM240 y UM96 + UM256 registraron un incremento de dos órdenes de magnitud en las UFC recuperadas por gramo de raíz. En el caso del consorcio UM96 + UM270 se inocularon en semilla 1.0 x 10⁶ y se recuperaron 1.9 x 10⁷ UFC, lo cual muestra un incremento significativo. De esta manera, se observa que las rizobacterias analizadas muestran excelente capacidad de colonizar la raíz de plantas de maíz, ya sea por separado o en consorcio Bacillus- Pseudomonas. Esto confirma que el sistema propuesto por ^{Scher et al. (1984)} es un método excelente para evaluar la capacidad de colonización que puedan tener las rizobacterias. Por lo tanto, se decidió evaluar dicha capacidad en cepas aisladas, ya sea en suelo estéril o donde compitan con otros microorganismos.

La rizosfera es un microecosistema donde se llevan a cabo infinidad de interacciones. Dicha zona del suelo, la cual es influida directamente por los exudados radiculares, puede ser dividida en zonas de mayor interacción, tales como el rizoplano (^{Scher et al., 1984}). El rizoplano es la parte superficial de la raíz donde interaccionan diversas especies microbianas con la planta. Asimismo, pueden llevarse a cabo interacciones patógenas o benéficas; por lo tanto, si los organismos benéficos tienen buena capacidad de colonización de la rizosfera pueden desplazar a los microorganismos potencialmente patógenos (^{Santoyo et al., 2012}). Por ello, una de las características que deben presentar las cepas que se pretenden usar como bioinoculantes es buena capacidad de colonización rizosférica (Scher et al., 1984).

Las especies bacterianas estudiadas han mostrado previamente excelente capacidad de antagonismo y biocontrol hacia diversos fitopatógenos (^{Martínez- Absalón et al., 2012} y ²⁰¹⁴; ^{Hernández-León et al., 2015}), incluyendo a Botrytis cinerea, causante del moho gris en más de 200 especies vegetales (^{Nambeesan et al., 2012}). En el caso de las cepas de Pseudomonas, se ha observado que pueden promover el crecimiento de plantas como Medicago truncatula a través de la excreción de diversos metabolitos difusibles (sideróforos, HCN, 2,4-diacetylphloroglucinol, entre otros) y volátiles, principalmente compuestos azufrados como el dimetilsulfóxido (^{Hernández-León et al., 2015}); mientras que la cepa UM96 es una excelente productora de quitinasas, involucradas en el biocontrol del fitopatógeno B. cinerea (^{Martínez-Absalón et al., 2014}).

Por lo tanto, la síntesis de múltiples compuestos o metabolitos, por parte de las cepas analizadas, podrían ser los responsables de la alta capacidad para colonizar las diversas zonas de la rizosfera, incluyendo el rizoplano. Esto incluye la sobrevivencia y competencia en el suelo donde cohabitan con otros microorganismos para ocupar espacios; lo cual es conocido como un mecanismo de inhibición de fitopatógenos, así como una forma indirecta para inducir la promoción del crecimiento y salud vegetal. Por lo tanto, las bacterias podrán acceder a los exudados radiculares o nutrientes, y así ejercer efectos benéficos sobre la planta a través de la producción de fitoestimulantes (^{Glick, 2014}; ^{Santoyo et al., 2012}).

Efecto promotor en plántulas de Physalis ixocarpa Brot. ex Horm.

Para determinar el efecto promotor de las cepas por separado y en combinaciones, se realizaron experimentos de inoculación en semillas de tomate verde (Physalis ixocarpa Brot. ex Horm.). Los resultados muestran que las cepas no promovieron la germinación (datos no mostrados). Sin embargo, se observó que las cepas de Pseudomonas, por separado, incrementaron la longitud del hipocotilo y raíz, así como el peso fresco total de las plántulas (Figura 2), mientras que B. thuringiensis UM96 únicamente mostró diferencia significativa para longitud de raíz.

Figura 2 Efecto promotor individual de las cepas Bacillus thuringiensis UM96 y Pseudomonas fluorecens (UM16, UM240, UM256 y UM270) sobre el crecimiento de plántulas de Physalis ixocarpa Brot. ex Horm. Se muestran los valores de peso fresco (g) y longitud de raíz e hipocótilo (mm). Los valores mostrados son la media de tres réplicas independientes. Las barras muestran la media ± valores de error estándar (n ≥ 15). Las letras diferentes encima de las barras indican diferencias significativas por medio de la prueba de rango múltiple de Duncan (P < 0.05). 

Con respecto al efecto promotor de las co-inoculaciones, la Figura 3 muestra los resultados donde se observa que las combinaciones UM96 + UM16, UM96 + UM240 y UM96 + 270 no promovieron el desarrollo de las plántulas de tomate verde. El consorcio UM96 + UM256 fue el único que mostró incrementos significativos en la longitud de raíz y del hipocótilo, así como el peso fresco total de las plántulas. Estos resultados exponen que ciertas combinaciones de Bacillus y Pseudomonas pueden ejercer un efecto represor en la promoción del crecimiento de plantas; mientras que algunas pueden mantener dicho efecto por separado o en consorcio, como la mezcla UM96 + UM256.

Figura 3 Efecto promotor de los consorcios entre Bacillus thuringiensis UM96 y cada una de las cepas de Pseudomonas fluorecens (UM16, UM240, UM256 y UM270) sobre el crecimiento de plántulas de Physalis ixocarpa Brot. ex Horm. Se muestran los valores de peso fresco (g) y longitud de raíz e hipocótilo (mm). Los valores mostrados son la media de tres réplicas independientes. Las barras muestran la media ± valores de error estándar (n ≥ 15). Las letras diferentes encima de las barras indican diferencias significativas por medio de la prueba de rango múltiple de Duncan (P < 0.05). 

Hasta donde se sabe, no existe información sobre algún efecto promotor del crecimiento vegetal directo por parte de B. thuringienesis. Por lo tanto, no fue sorpresivo que UM96 no incrementara el crecimiento de las plántulas de tomate. Sin embargo, se sabe que tiene la capacidad de producir quitinasas que pueden restringir el desarrollo de hongos fitopatógenos y tener un efecto benéfico de forma indirecta (^{Martínez- Absalón et al., 2012} y ²⁰¹⁴). Dicha actividad puede complementar aquellos mecanismos por los cuales las cepas de P. fluorescens pueden antagonizar hongos como B. cinerea (^{Hernández-León et al., 2015}); por lo tanto, se podría hipotetizar que la co-inoculación de la cepa UM96 más una de Pseudomonas, en un ambiente rizosférico, podría brindar mejor protección a la planta del ataque de patógenos.

Por otra parte, existen trabajos que proponen el uso de mezclas de bacterias benéficas para mejorar las capacidades promotoras del desarrollo vegetal (^{Raupach & Kloepper, 1998}). Sin embargo, los resultados de este trabajo muestran que no todas las combinaciones Bacillus-Pseudomonas pueden funcionar, ya que tres combinaciones (UM96 + UM16, UM96 + UM240, UM96 + UM270) no promovieron el desarrollo de las plántulas; por el contrario, el efecto promotor de las Pseudomonas se vio inhibido por la presencia de la cepa UM96. La única combinación que resultó exitosa y que mantuvo un efecto promotor fue UM96 + UM256.

^{Kang et al. (2014)}, en plantas de tomate observaron que cepas de Bacillus pumilus WP8 y Erwinia persicinus RA2, por separado, son excelentes promotoras de crecimiento vegetal, y en mezcla no tienen estos efectos, viéndose también afectadas las actividades de biocontrol. Analizando más a detalle dicho efecto antagónico entre las cepas, se observó que la formación de biofilm se perjudicó en ambas cepas. Esta formación es una característica importante para colonizar espacios en la rizosfera; por lo tanto, se ha asociado indirectamente con la capacidad de biocontrol y promoción del crecimiento vegetal (^{Beyeler, Keel, Michaux, & Haas 1999}; ^{Bianco et al., 2006}; ^{Duca, Lorv, Patten, Rose, & Glick, 2014}). En esta investigación, las cepas de P. fluorescens son productoras de biofilm (^{Hernández-León et al., 2015}), por lo que se podría suponer un efecto antagónico similar en las co-inoculaciones en planta. Sin embargo, dicho efecto no se observó en experimentos de confrontación, por lo que las plantas de tomate podrían estar produciendo algún compuesto (exudado radicular) que detone actividades de defensa en las bacterias, como respuesta para competir por espacios. Esta es una hipótesis que merece más trabajo en laboratorio.