Introducción

Candidatus Liberibacter es una bacteria filamentosa que se aloja en los tubos cribosos del floema, y puede presentar formas redondas cuando termina su ciclo celular. Se transmite por insectos vectores, donde se encuentra en la hemolinfa y las glándulas salivales (^{Jagoueix, Bové, & Garnier, 1994}). Esta bacteria afecta a distintos cultivos pertenecientes a la familia de las rutáceas, solanáceas y apiáceas (^{Liefting, Pérez- Egusquiza, Clover, & Anderson, 2008}; ^{Aguilar, Segonda, Bextine, McCue, & Munyaneza, 2013}). Una forma de dispersión de Ca. Liberibacter es mediante semilla infectada, que forma parte del inóculo primario en campo e influencia la incidencia inicial de la enfermedad y el comportamiento de la epidemia en campo (^{Camacho-Tapia et al., 2011}).

Estudios filogenéticos de la región 16S rRNA indican que Ca. Liberibacter pertenece a las α-proteobacterias, y que está relacionada con géneros de bacterias del subgrupo α-2 proteobacteria, como: Bartonela, Bradyrhyzobium, Agrobacterium, Brucella y Alfipia (^{Jagoueix et al., 1994}). Observaciones realizadas con microscopia electrónica de transmisión muestran que la bacteria tiene 0.2 a 0.3 μm de diámetro, una membrana característica de las bacterias gram negativas, cuenta con una capa de peptidoglicano, que apenas es visible, y no tiene evidencia de flagelos o pili (^{Jagoueix et al., 1994}).

El aislamiento en medio de cultivo artificial de Ca. Liberibacter es difícil, por lo que se imposibilita su caracterización bioquímica, y solo se mantiene como propuesta a género Liberibacter, de Liber (corteza) y bacter (bacteria). Con base en la comparación de secuencias de nucleótidos de los genes de proteínas ribosomales se propusieron tres especies en rutáceas: Ca. Liberibacter africanus, Ca. Liberibacter asiaticus y Ca. Liberibacter americanus, y una cuarta especie: Ca. Liberibacter solanacearum, detectada en solanáceas (^{Jagoueix et al., 1994}; ^{Liefting et al., 2008}).

El objetivo de esta revisión fue proporcionar una visión general de los aspectos biológicos, ecológicos, epidemiológicos y de manejo de Candidatus Liberibacter; la cual está asociada con enfermedades como: Huanglongbing de los cítricos, Zebra chip y variegado de chile.

Aislamiento de Candidatus Liberibacter

Los primeros intentos para aislar a Liberibacter fueron mediante co-cultivos con actinobacteria, relacionada con Propionibacterium acnes; en éstos, las colonias aparecían después de un largo tiempo y fue difícil tenerlas libres para transferirlas de manera consecutiva a un nuevo medio de cultivo (^{Davis, Mondal, Chen, Rogers, & Brlansky, 2008}). En un segundo estudio, se diseñó y evaluó otro medio llamado Liber A, obteniéndose crecimiento irregular y colonias bacterianas con un rango de 0.1 a 0.3 mm, después de tres a cuatro días a 28 °C; posteriormente las colonias no incrementaron su tamaño, y su viabilidad se perdió después de cuatro a cinco reaislamientos. Por lo tanto, la dificultad para aislarla imposibilita las pruebas para su estudio bioquímico (^{Sechler et al., 2009}).

^{Parker et al. (2014)} indicaron que agregar jugo de toronja (Citrus paradisi Macfad) al medio de cultivo brinda mayor viabilidad a Ca. L. asiaticus; por otro lado, disminuye en forma sinuosa en condiciones tales como pH más bajo, presencia de azúcares y abundancia de elementos minerales y aminoácidos (^{Parker et al., 2014}).

Factores de virulencia

A pesar de que Ca. L. americanus tiene una membrana exterior intacta, la mayoría de los genes necesarios para biosíntesis de lipopolisacarido (LPS), que se encuentran en Ca. L. asiaticus y Ca. L. solanacearum, están ausentes, junto con lpxA, lpxB y lpxC que están involucrados en los primeros pasos de biosíntesis de lípidos. La falta de LPS, en las bacterias gram negativas, se puede compensar con la producción de otras bases de lípidos en la membrana externa (^{Lin & Gudmestad, 2013}).

Ca. L. americanus y Ca. L. solanacearum parecen tener mayor capacidad metabólica para algunos aminoácidos y vitaminas. Ca. L. solanacearum tiene la vía completa para la producción de arginina, glutamina y ornitina. Los genes para la síntesis de glutamina a partir del glutamato están presentes en estas bacterias (^{Wulff et al., 2014}). Los síntomas de amarillamiento genérico y decaimiento, que a menudo se confunden fácilmente con deficiencias nutrimentales, se deben a la acumulación de almidón, que indica una alteración del transporte en el floema (^{Nelson, Munyaneza, McCue, & Bové, 2013}).

En el genoma de Ca. L. asiaticus se encontraron dos bacteriófagos llamados SC1 y SC2; los cuales pertenecen a la familia Podoviridae, que corresponde al orden Caudovirales (^{Zhang et al., 2011a}). El primero parece ser activado cuando la bacteria infecta a los cítricos. El segundo, aparentemente, es una forma degenerada de SC1 que carece de genes de lisis, pero lleva la mayoría de los que pueden ser importantes en la conversión lisogenica; es decir, aquellos que se expresan en la bacteria y alteran su fisiología, incrementando su virulencia y patogenicidad, además de originar la aparición de nuevos haplotipos y formas de la enfermedad. El SC2 se replica como un plásmido de exclusión cuando se hospeda en Ca. L. asiaticus infectivo en plantas y psílidos.

Estudios indican que Bactericera cockerelli, además de portar Ca. L. solanacearum, cuenta con tres bacterias intracelulares procarióticas (simbiontes) asociadas con éste; el primario o simbionte obligado (Carsonella rudii) (^{Thao et al., 2000}) y dos facultativos, un secundario (S) y dos cepas diferentes de Wolbachia (^{Nachappa, Levy, Pierson, & Tamborindeguy, 2011}). Esos simbiontes son heredables y se transmiten de la madre a la progenie (^{Nachappa, Shapiro, & Tamborindeguy, 2012}).

El simbionte primario influye en los procesos biológicos fundamentales del insecto con el hospedante, y es requerido para la sobrevivencia y desarrollo del psílido, además de simbiontes facultativos que lo influencian ecológicamente. Por ejemplo, Wolbachia spp. puede manipular la reproducción en el insecto, y provee de hembras infectadas que tienen ventaja reproductiva en comparación con las hembras que no lo están. Lo anterior incrementa la dispersión de Wolbachia spp., además de incentivar el incremento de insectos y el aumento en el porcentaje de vectores para la transmisión de Liberibacter en solanáceas (^{Nachappa, Levy, Pierson, & Tamborindeguy, 2014}).

Candidatus Liberibacter en distintos hospedantes

Huanglongbing (HLB), conocido también como el “greening” de los cítricos, es una enfermedad en cítricos asociada con la infección de tres especies de α-proteobacteria: Ca. Liberibacter asiaticus, Ca. Liberibacter americanus y Ca. Liberibacter africanus (^{Bové, 2006}). Los síntomas del HLB incluyen manchas moteadas y clorosis, que pueden llegar a confundirse con deficiencias nutrimentales, además de achaparramiento y reducción del follaje conforme progresa la enfermedad, y en casos extremos los árboles mueren por la infección (^{Gottwald, da Graça, & Bassanezi, 2007}).

El rendimiento de los árboles afectados es reducido, y éstos pueden producir frutos pequeños y de mala calidad. Las variedades comerciales son las más susceptibles (^{Wang et al., 2009}). Ca. L. asiaticus y Ca. L. americanus son transmitidas por Diaphorina citri (Kuwayama) (^{Capoor, Rao, & Visnawanath, 1967}; ^{Yamamoto et al., 2006}); mientras que Ca. L. africanus es transferido por Trioza erytrae (Del Guercio) (^{McClean & Oberholzer, 1965}). En Estados Unidos, Ca. L. asiaticus se identificó en Florida en 2005 (^{Halbert, 2005}).

Por otro lado, existen evidencias de que la enfermedad conocida como Zebra chip, en papa (Solanum tuberosum), se originó en el Norte de América y posteriormente se extendió a otros países productores. El patógeno asociado a esta enfermedad es Ca. Liberibacter solanacearum, el cual causa pérdidas económicas a la industria de papa en Estados Unidos. La Zebra chip se detectó en Saltillo, México, en la década de los noventa, y se asoció primeramente con un fitoplasma (^{Secor & Rivera-Varas, 2004}). A principios del 2000 se reportó en campos comerciales de papa en Pearsall y Valle de Río Grande, Texas. Para el 2006, la enfermedad se dispersó a otras áreas productoras, como Arizona, Kansas, Colorado, California, Nevada y Nuevo México (^{Munyaneza, Goolsby, Crosslin, & Upton, 2007b}; ^{Liefting et al., 2008}).

En 2008, en Auckland, Nueva Zelanda se presentaron síntomas como: ápices cloróticos, moteado general en hojas, enrizado de las venas medias, achaparramiento de las plantas, reducción de la producción, decoloración en patrón de rayas en los tubérculos crudos y oscurecimientos de éstos cuando se fríen, y en algunos casos deformación de tubérculos (^{Munyaneza, Crosslin, & Upton, 2007a}; ^{Liefting et al., 2008}).

Candidatus Liberibacter solanacearum se detectó en el psílido de la zanahoria (Trioza apicalis) en Finlandia en plantaciones infectadas por este insecto. Trioza apicalis es una plaga importante en el norte y centro de Europa, donde puede causar hasta 100 % de pérdidas. En 2009, al sur de Sinaloa, se encontró esta bacteria como patógeno en el cultivo de chile; los síntomas de las plantas fueron semejantes al “yellow psilid” que se presenta en papa, aunque también mostraron entrenudos cortos y crecimientos apicales cloróticos (^{Munyaneza, Sengoda, Crosslin, Garzon-Tiznado, & Cárdenas-Valenzuela, 2009}). Por su parte, ^{Camacho- Tapia et al. (2011)} demostraron que esta bacteria es responsable del variegado del chile, observado en plantaciones comerciales de esta solanácea en la región de Yurécuaro, Michoacán, México, y que se puede trasmitir por semilla.

En 2013, en Honduras, se reportó Ca. L. solanacearum en tabaco (^{Aguilar et al., 2013}), y en 2014 se encontró en chile (^{Munyaneza & Segonda, 2014}). Se han documentado nuevas especies de esta bacteria; como el caso de Ca. Liberibacter europaeus que se detectó en Italia como endófito en pera y en el psílido de ésta (Cacopsylla pyri) (^{Raddadi et al., 2010}).

Factores climáticos

La temperatura tiene efecto significativo en el desarrollo de Liberibacter asociada a HLB y a los síntomas de la enfermedad. Ca. L. africanus y Ca. L. americanus se reportan como sensibles al calor; mientras que Ca. L. asiaticus aparentemente lo tolera. La sensibilidad del patógeno al calor puede explicar la distribución geográfica de estas especies de Liberibacter y sus insectos vectores (^{Munyaneza, Sengoda, Buchman, & Fisher, 2012}).

Candidatus L. africanus es influido por el calor, de tal manera que el desarrollo de los síntomas ocurre de 30 a 32 °C. T. erytrae se presenta en climas frescos, y también es sensible a temperaturas altas combinadas con humedad relativa baja. En contraste, Ca. L. asiaticus es tolerante al calor; sus síntomas se desarrollan en condiciones de humedad baja y arriba de 35 °C, que es la temperatura que resiste D. citri (^{Bové, 2006}; ^{Lopes et al., 2009}). ^{Esquivel-Chávez et al. (2012)}, indican que el limón mexicano (Citrus aurantifolia) es más susceptible a Ca. Liberibacter asiaticus que el limón persa (C. latifolia) y la naranja dulce (C. sinensis). ^{Flores-Sánchez et al. (2015)} mencionan que las características organolépticas del limón persa se ven afectadas en presencia de Ca. Liberibacter asiaticus, y la producción se centra en ramas de creciente secundario y la parte externa del dosel del árbol (^{Esquivel-Chávez et al., 2012}).

A 17 °C o menos, Ca. L. solanacearum se ve afectada, pero esto no previene el desarrollo de Liberibacter en la planta; mientras que a 32 °C, o más, se inhibe la bacteria y los síntomas ocasionados por ésta. Por lo tanto, se reporta que el desarrollo óptimo de Ca. L. solanacearum se encuentra de 27 a 32 °C. La sensibilidad al calor puede explicar la incidencia y la severidad en las áreas productoras (^{Munyaneza et al., 2012}).

El desarrollo óptimo del psílido B. cockerelli es en 27 °C; mientras que la oviposición, eclosión, desarrollo y sobrevivencia son retardados o reducidos en 32 °C, y cesan a partir de 35 °C (^{List, 2009}). Una sola generación puede completarse en tres a cinco semanas, según las condiciones de temperatura, mismas que son favorables a Ca. L. solanacearum y al desarrollo de los síntomas de “Zebra Chip”. Por lo anterior, se cree que hay coevolución entre las especies de Liberibacter y su insecto vector, para la sensibilidad a la temperatura y humedad relativa (^{Munyaneza et al., 2012}).

Respuesta del hospedante

Candidatus Liberibacter está restringida a los elementos cribosos del floema del hospedante, y a las glándulas salivales del insecto vector. En el floema de las plantas infectadas por Ca L. solanacearum se encuentran agregaciones de componentes fenólicos, peroxidasas, oxidasas, polifenoles, quitinasas, aminoácidos y azúcares (sacarosa, glucosa y fructuosa) libres (^{Rashed, Wallis, Paetzold, Workneh, & Rush, 2013}). Esas respuestas aparecen entre la tercera y la quinta semana después de la infección (^{Rashed et al., 2013}).

El incremento de la actividad reductiva de azúcares y aminoácidos podría contribuir al aumento del tono café al freír las papas, porque la formación de acrilamida ocurre con el empleo de esos componentes como sustratos a temperatura de freído, mediante la reacción de Maillard (^{Wallis et al., 2014}).

Muestras recolectadas en diferentes regiones productoras de cítricos, con problemas de HLB, revelan que hay deformación anatómica asociada con la enfermedad. La microcopia de luz muestra múltiples abultamientos localizados en el floema necrótico y dispersos a través del sistema vascular; además de acumulación masiva de almidón, aberraciones en la actividad cambial y formación excesiva de floema (^{Schneider, 1967}).

La necrosis del floema podría causar el bloqueo en la corriente y traslocación de nutrimentos, que conducen a cambios anatómicos como: amarillamiento con moteado y amarillamiento de venas. Uno de los cambios más notables en el floema de hojas de árboles infectados es el abultamiento de la lamela media, entre las paredes celulares que rodean los tubos cribosos; además, en hojas sintomáticas viejas se presentan colapsos de las células del floema que se encuentran cerca del xilema (^{Folimonova & Achor, 2010}). Se ha reportado una relación de aumento de incidencia de HLB en huertos de cítricos cuando está presente Phytophthora nicotianae, que afecta a las raíces fibrosas, que cuando solo está Ca. L. asiaticus (^{Ann, Ko, & Su, 2004}; ^{Graham, Irey, & Taylor, 2011}).

La detección de Ca. L. asiaticus en raíces de cítricos indica que es capaz de circular y multiplicarse en el tejido de la raíz; además, causa daños a las raíces, antes de la interrupción del floema de las hojas (^{Graham, Johnson, Gottwald, & Irey, 2013}).

B. cockerelli, portador de Ca. L. solanacearum, puede inocular plantas sanas durante su alimentación; en ésta, el patógeno se multiplica y se extiende sistémicamente a través del hospedante. El conocimiento del mecanismo preciso de inoculación y la eficiencia de transmisión del patógeno por B. cockerelli, pueden usarse para realizar predicciones de la epidemia y desarrollar estrategias de manejo integrado de la enfermedad (^{Rashed, Nash, Paetzold, Workneh, & Rush, 2012}).

Cuando Ca. L. solanacearum se distribuye en toda la planta, la cantidad de bacteria adquirida por B. cockerelli no es influenciada por el sitio de alimentación del insecto; sin embargo, si Ca. L. solanacearum no está completamente distribuida, los insectos muestran tendencia para adquirir altas cantidades de patógeno cuando se alimentan de distintas áreas de las plantas o del tallo (^{Rashed et al., 2012}). El número de insectos vectores puede afectar el tiempo que toma la expresión de los síntomas, debido a la diferencia inicial del inóculo inyectado; aunque después de la multiplicación bacteriana y el movimiento sistémico dentro del hospedante, la enfermedad se incrementa en la misma tasa. El número de vectores es un factor importante para el éxito de la inoculación; sin embargo, la tasa de éxito es independiente de la cantidad de patógeno en B. cockerelli (^{Rashed et al., 2012}).

^{Rashed, Workneh, Paetzold, Gray, y Rush (2014)} indicaron que en papa no hay alguna etapa fisiológica donde sea más susceptible a Ca. L. solanacearum. La incidencia está relacionada al movimiento del insecto vector, y la severidad de los síntomas es independiente del título de la bacteria.

Epidemiología de Candidatus Liberibacter

De acuerdo con estudios epidemiológicos, se observa que las especies de Ca. Liberibacter tienen un ajuste a distribución β _binomial, que indica la presencia de agregaciones de plantas infectadas; a excepción de los casos donde la incidencia es menor a 0.20 %, ya que la tendencia indicaría distribución aleatoria. Este tipo de agregaciones se debe a los diferentes ciclos reinfectivos y a la distribución por parte del insecto vector (^{Madden & Hudges, 1995}; ^{Gottwald et al., 2007}; ^{Henne, Workneh, & Rush, 2012}).

Las poblaciones de insectos, portadores de Ca. L. solanacearum, tienden a disminuir por la cantidad de bacterias ubicadas en su aparato digestivo. También se reporta que existe una correlación negativa de sobrevivencia de ninfas infectadas por este patógeno y que influye en los ciclos reinfectivos: los adultos de B. cockerelli tienen mayor eficiencia de transmisión comparada con los estadios ninfales (^{Nachappa et al., 2014}).

Manejo de Candidatus Liberibacter

Las medidas para el control de Zebra chip dependen de la detección temprana y el control del insecto vector (^{Ravindran, Levy, Pierson, & Gross, 2011}). Debido a la ausencia de resistencia genética, se considera la aplicación de insecticidas para disminuir la presencia del insecto vector, por ejemplo el tiametoxan y abacmetina (^{Gottwald et al., 2007}; ^{Lin & Gudmestad, 2013}). ^{Hoffman et al. (2013)} indicaron que la termoterapia puede controlar HLB. Los primeros reportes de estas prácticas fueron en China, donde se eliminó a Ca. L. asiaticus de varetas y plántulas, después de que el material se expuso en aire caliente de 49 a 50 °C por 50 a 60 min (Lo, Lo, & Tang, 1981; ^{Lo, 1983}). Sumergir las plántulas de cítricos infectadas por Ca. L. asiaticus en agua caliente, de 47 a 50 °C durante 6 min, causa estrés por el calor y puede inducir respuestas de defensa en las plantas que las ayuda a combatir la infección (^{Hoffman et al., 2013}).

El control de Ca. Liberibacter se enfoca en reducir las fuentes de inóculo, como el uso de plantas libres, remoción de árboles sintomáticos y el control químico del insecto para reducir la transmisión de la bacteria. En la década de los setenta se evaluó el uso de tetraciclina mediante inyecciones directas en el tronco de árboles de cítricos que estaban afectados por HLB en el Sur de África, China e Indonesia, que resultó en reducción de los síntomas en las especies tratadas. Esta práctica se descontinuó debido a que la tetraciclina solo tiene efecto bacteriostático, de tal manera que se necesitan aplicaciones cada año; además, después de muchas inyecciones se manifiesta fitotoxicidad en los árboles tratados (^{Lo et al., 1981}).

La combinación de penicilina G y estreptomicia tiene efecto antimicrobial contra Ca. L. asiaticus. La penicilina potasio G se asimila rápidamente por las plantas y es relativamente menos fitotóxica. El principal mecanismo de acción de la estreptomicina está vinculado al ribosoma 30S de la bacteria; cambia su forma e inhibe la síntesis de proteínas y provoca una lectura errónea del RNAm. Según ^{Zhang et al. (2011b)}, ese mismo tratamiento también puede ser viable para el control de Ca. L. solanacearum.

La transformación genética se propone como una herramienta para inducir resistencia al HLB. En otros cultivos, como espinacas, se han usado los péptidos antimicrobianos, que sirven para el control de bacterias gram negativas y positivas. ^{Iftikhar, Rauf, Shahzad, y Zahid (2014)}, transformaron especies de cítricos con genes antimicrobianos (LIMA y ATTE) y se les injertó varetas infectadas con Ca. L. asiaticus; posteriormente, al ser analizadas mediante PCR, la bacteria no se encontró en el portainjerto. ^{Joubert y Stassen (2000}) encontraron que la poda selectiva, mediante la eliminación de ramas dañadas, reduce significativamente la incidencia de la enfermedad; además de que hay un impacto positivo en el tamaño de la fruta y el rendimiento.