Modos de acción de cuatro cepas de levaduras antagónicas contra Penicillium expansum Link en manzana

 

Modes of action four strains of antagonistic yeasts against Penicillium expansum Link in apple

 

Sergio Rivera Avalos; Ramón Álvar Martínez–Peniche*; Lourdes Soto–Muñoz; María del Socorro Chávaro–Ortiz

 

División de Estudios de Posgrado, Facultad de Química, Universidad Autónoma de Querétaro. Centro Universitario s/n, Colonia Las Campanas, C. P. 76000, Querétaro, Querétaro. Correo–e: alvar@uaq.mx (* Autor para correspondencia).

 

Recibido: 11 de agosto, 2010.
Aceptado: 24 de mayo, 2012.

 

Resumen

El uso de levaduras antagónicas para el control de enfermedades de manzanas en poscosecha reduce los daños al ambiente, por lo que resulta fundamental conocer su modo de acción para su posterior uso comercial. Se estudiaron dos modos de acción de cuatro cepas de levaduras contra Penicillium expansum Link. La antibiosis se evaluó mediante cultivos duales y antibiogramas, y la competencia por nutrientes a través de microplacas de cultivo, con filtros semipermeables de politetrafluoroetileno (PTFE). La ausencia de halos de inhibición por los antagonistas en los cultivos duales y antibiogramas muestra su incapacidad para producir antibióticos. La germinación de los conidios de P. expansum en las microplacas fue de alrededor de 95 % en los distintos medios en ausencia de las levaduras, pero se redujo significativamente (entre 10 y 20 %) en presencia de cualquiera de éstas. Cuando las levaduras fueron separadas del hongo por el filtro, el porcentaje de germinación de P. expansum se incrementó significativamente sólo con la cepa 22–111 (Pichia guilliermondii). Se obtuvo un bajo coeficiente de correlación de los índices de germinación del hongo entre los dos tratamientos (r = –0.303), lo que supone una interacción directa del antagonista con el hongo. Por el contrario, con las cepas 38–432, 24^–2_3a y 22^–2_4a el índice de germinación de P expansum resultó muy similar al obtenido cuando éstas se encontraban en contacto directo con los conidios (r = 0.989, r = 0.999 y r = 0.995, respectivamente), lo que sugiere que la competencia por nutrientes es su principal modo de acción.

Palabras clave adicionales: Malus domestica Borkh, antagonismo, control biológico, pudrición azul, antibiosis, competencia por nutrientes.

 

Absract

The use of antagonistic yeasts to control diseases in postharvest apples reduces environmental risks. Knowing the modes of action of the antagonists is essential in order to use them at a commercial level. Two modes of action of four yeast strains against Penicillium expansum Link were studied. Antibiosis was evaluated by means of dual cultures and antibiograms, and nutrient competition using culture microplates containing semipermeable polytetraflourethylene (PTFE) filters. The absence of inhibition haloes in the dual cultures and in antibiograms showed the antagonists' inability to produce antibiotics. Germination of P. expansum conidia was about 95 % in all of the different growing media in the microplates when antagonistic yeasts were absent. However, it significantly declined (anywhere from 10 to 20 %) in the presence of any of the yeasts. When the yeasts were separated from the fungus by means of the filter, germination of P. expansum only increased significantly with the strain 22–111 (Pichia guilliermondii) in all the media, obtaining a low correlation coefficient for the germination index of both treatments (r = –0.303), which assumes a direct interaction between the antagonist and the fungus. In contrast, with strains 38–432, 24^–2_3a and 22^–2_4a conidia germination was very similar to that obtained when the yeasts were directly in contact with conidia (r = 0,999 and r = 0.995, respectively), which suggests that nutrient competition is their main code of action.

Additional keywords: Malus domestica Borkh, antagonism, biological control, blue mold, antibiosis, competition for nutrient.

 

INTRODUCCIÓN

Penicillium expansum Link es el causante de más de 80 % de las pudriciones que se presentan en la manzana en poscosecha y es capaz de desarrollarse por debajo de 0 °C (Spotts et al., 1999). El método más utilizado para el control de este hongo consiste en el empleo de productos químicos que pueden ser tóxicos para la salud del consumidor o provocar la aparición de cepas del hongo resistentes al producto químico utilizado (Campbell, 1989). Por ello, se han desarrollado métodos alternativos como la utilización de microorganismos antagónicos, fundamentalmente levaduras, que tienen la capacidad de desarrollarse a temperaturas de almacenamiento por tiempos prolongados (Viñas et al., 2002).

En México se han aislado, seleccionado e identificado levaduras antagónicas en manzanas y se ha evaluado su efectividad biológica actuando solas (Sánchez et al., 2008) o en combinación con bicarbonato de sodio (Soto y Martínez, 2009), pero no se han estudiado sus posibles modos de acción.

El conocimiento del modo de acción de los microorganismos antagonistas sobre los patógenos es fundamental para la optimización de los métodos y el momento de su aplicación, el desarrollo de formulaciones adecuadas que propicien su utilización, la selección de nuevos antagonistas efectivos y el registro de los agentes de biocontrol para su posterior uso comercial (Droby y Chalutz, 1994).

Los posibles modos por los cuales los antagonistas son capaces de inhibir al patógeno son difíciles de precisar, ya que resulta muy complicado realizar experimentos que puedan excluir a todos los posibles modos distintos del que se quiere analizar. Para la mayoría de organismos se han sugerido varios modos de acción, y no se ha demostrado que un solo modo sea responsable de todo el efecto de biocontrol de un determinado antagonista (Janisiewicz y Korsten, 2002).

Algunos modos de acción señalados para distintos agentes de biocontrol de enfermedades de poscosecha incluyen antibiosis (Gueldner et al., 1988; Janisiewicz et al., 1991; Edwards y Seddon, 2001; Wichitra et al., 2008), competencia por nutrientes (Wilson y Wisniewski, 1989; Mari et al., 1996; Filonow, 1998) o espacio (Andrews et al., 1994; Pasichnyk et al., 2005), interacción directa con el patógeno (Castoria et al., 2001; Bonaterra et al., 2003), inducción de resistencia en el hospedante (El–Ghaouth et al., 2001; Jani–siewicz et al., 2003), o la combinación de algunos de éstos (Zhang et al., 2011; Li et al., 2011).

El objetivo del presente trabajo fue estudiar posibles modos de acción de levaduras antagónicas sobre Penicillium expansum en manzana en poscosecha.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico

Se utilizaron cuatro cepas de levaduras aisladas de manzanas de la región productora de Querétaro, México, que en estudios previos exhibieron los mejores comportamientos como antagonistas. Dos de ellas fueron identificadas a nivel de especie por el método Biolog: 38–432 y 22–111 (Soto y Martínez, 2009) y 24^–2_3a 22^–2_4a (resultados no publicados) (Cuadro 1). Asimismo, como patógeno a inhibir se utilizó la cepa del hongo P. expansum Link CFNL2016, aislada de manzana 'Golden Delicious' y seleccionada por su elevada virulencia (Sánchez et al., 2008).

Preparación de inóculos

La cepa de P. expansum se mantuvo en Papa Dextrosa Agar (PDA) a 4 °C, y cada dos meses se multiplicó en jugo de manzana para mantener su virulencia (Usall et al., 2001). Se preparó una suspensión conidial a partir de cultivos con dos semanas de incubación a 25 °C, agregando 10 ml de diluyente peptona sobre la superficie del medio de cultivo. El conteo de esporas se efectuó con una cámara de Neubauer, ajustando la concentración a 1 x 10⁴ esporas¹ ml^–1 (Viñas et al., 2002).

Los cultivos de levaduras almacenadas a 4 °C en Agar Nutritivo–Dextrosa para Levaduras (NYDA) fueron resembrados en Caldo Nutritivo–Dextrosa para Levaduras (NYDB), e incubados durante 72 h a 26 ± 1 °C y 200 rpm de agitación (Viñas et al., 2002). Después, el medio se centrifugó a 12,000 rpm por 10 min. Se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1 ml de diluyente de peptona. La concentración del inóculo (antagonista) se ajustó a 1 x 10⁷ UFC ·ml^–1 (Sánchez et al., 2008).

Producción de sustancias antimicóticas

Prueba in vitro

Los ensayos realizados correspondieron a cultivos duales in vitro basados en la metodología propuesta por Khamna et al. (2009). A partir de colonias de 48 horas de crecimiento de las levaduras a evaluar, se realizaron resiembras en placas de PDA y de NYDA por medio de dos estrías paralelas realizadas a 2.5 cm de distancia del centro de la placa. Posteriormente el hongo se inoculó en el centro de la placa colocando un segmento de 0.25 cm² de superficie del crecimiento de un cultivo de ocho días. Las placas fueron incubadas a 25 °C durante ocho días con el fin de verificar la presencia o ausencia de halo de inhibición (Poppe et al., 2003). Este ensayo se realizó por triplicado.

Prueba in vivo

La metodología empleada para este ensayo se basó en lo reportado por Basha y Ulaganathan (2002). La primera parte consistió de cinco tratamientos utilizando cinco manzanas por tratamiento. El primero (control negativo) consistió en la inoculación de 20 µl de la suspensión de esporas del patógeno (1 x 10⁴ ml^–1= 200 esporas) en cada una de cuatro heridas cúbicas (3 mm por lado) equidistantes realizadas con ayuda de un punzón en la zona ecuatorial del fruto, mientras que los otros cuatro consistieron en la inoculación en las heridas de 25 µl de una suspensión de cada levadura (25,000 células), seguida de la inoculación del patógeno. Las manzanas inoculadas se incubaron durante seis días a 25 °C, después de lo cual se tomaron muestras de aproximadamente 1 cm³ de las heridas con un escalpelo y se trituraron en un tubo Eppendorf que contenía 100 µl de agua estéril. El tubo Eppendorf se centrifugó a 13,000 rpm y 20 °C durante 20 min. Se obtuvo el sobrenadante, el cual se esterilizó mediante filtración (Millipore, 0.45µ.).

Para la segunda parte del ensayo se realizaron antibiogramas in vitro, vertiendo por separado 5 µl de cada uno de los extractos obtenidos en cada uno de tres discos de papel filtro Whatman estériles de 1 cm de diámetro colocados sobre placas de PDA. En el centro de cada placa se inoculó P. expansum (200 esporas), y las placas se incubaron a 25 °C durante 10 días. Además, se utilizó el fungicida Captán® (ingrediente activo: N–(triclorometiltio) ciclohex–4–ene–1,2–dicarboximida) a 1 % como control positivo. Así, se evaluaron seis tratamientos (Cuadro 2). La variable evaluada fue la longitud del halo de inhibición. Se realizó un análisis de varianza cuando éste se presentó.

Competencia por nutrientes

Se realizaron tres tratamientos para cada antagonista (Janisiewicz et al., 2000): 1) Testigo P. expansum (patógeno) sin levadura; 2) El patógeno y el antagonista separados por un filtro semipermeable hidrofílico de politetrafluoroetileno (PTFE), y 3) El patógeno y el antagonista sin filtro. Para cada tratamiento se utilizaron pozos de 1 ml incluidos en microplacas de poliestireno, que contenían distintos medios: agua, NYDA 20 y 40 % y jugo de manzana 1, 5 y 10 % (Figura 1). Las concentraciones del inóculo en el medio se ajustaron a 1 x 10⁴ ml^–1 para el patógeno (200 esporas) y de 1 x 10⁷ ml^–1 para el antagonista (25,000 células).

Las microplacas se incubaron a 25 °C durante 24 horas. Se evaluó el índice de germinación desde 0 (espora no germinada) hasta 4 (tubo germinativo ≥ cuatro veces el diámetro de la espora) (Figura 2). Se consideraron 100 esporas por tratamiento en tres diferentes campos del microscopio. Se llevaron a cabo análisis de correlación simple por pares entre las frecuencias de clase de los índices de germinación del hongo, obtenidos cuando éste se encontraba en contacto directo con la levadura y cuando se encontraba separado por la membrana, así como de éstos con el testigo. Además, se llevó a cabo un análisis de varianza para cada antagonista, tomando como variable la suma ponderada de los índices de germinación de las esporas en un diseño experimental de bloques al azar y considerando como bloques los cinco medios empleados. Se utilizó el Programa estadístico STATGRAPHICS Centurion XVI.I (Statpoint Technologies, Inc. 2010) (Castaño y Domínguez, 2010).

 

RESULTADOS

Producción de sustancias antimicóticas (antibiosis)

Ensayos in vitro

En ninguna de las placas se formaron halos de inhibición, lo que indica, bajo las condiciones de este estudio, una ausencia de producción de sustancias antimicóticas, o bien una producción insuficiente capaz de inhibir el crecimiento del patógeno (Figura 3). La ausencia de producción de sustancias antimicóticas contra P. expansum y otros hongos ha sido determinada para diversas cepas de levaduras a través de ensayos con cultivos duales en diferentes medios de crecimiento. Janisiewicz et al. (2000) reportan que Aureobasidium pullulans no es capaz de generar antibiosis contra P. expansum en distintos medios estudiados. Resultados similares fueron obtenidos por Janisiewicz et al. (1991) y Edwards y Seddon (2001). Por el contrario, Campbell (1989) reporta que Agrobacterium radiobacter produce sustancias antimicóticas capaces de inhibir el desarrollo de P. expansum y B. cinerea en peras. Asimismo, Adebayo y Aderiye (2011) reportan la producción de la bacteriocina Brevecin SG1 por Lactobacillus brevis CG1, la cual presenta efecto antimicótico sobre Candida albicans y Penicillium citrinum.

Ensayos in vivo

En el caso del control negativo, el patógeno se desarrolló en prácticamente toda la placa de cultivo, mientras que el patógeno en contacto con el Captán^® (control positivo) manifiesta en todos los puntos un halo de inhibición evidente (Figura 4). Finalmente, en los antibiogramas correspondientes a los extractos obtenidos de manzanas que habían sido inoculadas con las levaduras 38–432, 22–111, 24^–2_3a y 22^–2_4a que estuvieron en contacto con el patógeno en heridas realizadas en manzanas, no se observa inhibición alguna del hongo, lo que hace inútil el análisis estadístico de los datos e indica la ausencia de producción de sustancias antimicóticas de estas cuatro cepas contra P. expansum, al menos en concentraciones suficientes para inhibir al hongo. Los resultados obtenidos con un sistema que trata de emular las condiciones in vivo coinciden sensiblemente con las pruebas realizadas con cultivos duales.

Competencia por nutrientes

Para el caso del testigo, las esporas de P. expansum no germinaron cuando se incubaron en agua destilada, pero su tasa de germinación resultó muy elevada en todos los medios de cultivo. Para jugo a 5 % y NYDB a 40 %, los porcentajes de germinación observados bajo el microscopio biológico a 40x fueron de 98 y 100 %, respectivamente, y los tubos germinativos fueron notablemente superiores (todos con un índice de germinación = 4) al de NYDB 20 % (14, 24 y 57 % en los índices 2, 3 y 4, respectivamente), lo que puede deberse a la menor disponibilidad de nutrientes en este último (Cuadro 3).

Al incubar las esporas del patógeno en contacto directo con la cepa de levadura 38 – 432 (Debaromyces han–senii), su germinación se redujo considerablemente (a 6, 8 y 10 % en jugo a 10, 5 y 1 %, respectivamente, y a 13 y 14 % en medio NYDB a 20 y 40 %, respectivamente), por lo que se obtuvo un bajo y negativo coeficiente de correlación con el testigo (r = –0.280). Un comportamiento similar al anterior se observó cuando el antagonista fue separado del patógeno por un filtro semipermeable, donde la germinación de los conidios contenidos en NYDB 20 % se inhibió en más de 71 %; en NYDB 40 %, en más del 74 %, y en jugo de manzana, en más de 80 % (Cuadro 4). El coeficiente de correlación obtenido entre las frecuencias de clase de los índices de germinación para ambos tratamientos (con filtro y sin filtro) fue muy elevado (r = 0.989). La presencia del filtro no impide la inhibición de la germinación de las esporas, lo que implica un modo de acción de la levadura por competencia por nutrientes.

En el caso de la levadura 22^–2_4a, debido a que estuvo en contacto célula–célula con el patógeno, la germinación de este último se inhibió en 95 % y en 71 % en NYDB 20 % y NYDB 40 %, respectivamente, y en 91, 82 y 89 % en jugo de manzana a 1, 5 y 10 %, respectivamente (r = – 0.298, con relación al testigo). Al ser separada del hongo por el filtro, la germinación del hongo continuó inhibiéndose significativamente. Así, los conidios en NYDB 20 y 40 % se inhibieron en 91 y 90 %, respectivamente, y en jugo de manzana a 1, 5 y 10 %, en 75, 79 y 80 %, respectivamente (Cuadro 5). El coeficiente de correlación (r = 0.995) entre ambos tratamientos (con y sin filtro) es muy similar al obtenido con la cepa 38–432, y también resultan compatibles con el modo de acción por competencia por nutrientes con esta levadura.

En la cepa 24^–2_3a se obtuvieron resultados análogos a los de las dos levaduras precedentes, ya que cuando ésta se encuentra en contacto directo con el patógeno, más de 88 % de las esporas no germinan en jugo de manzana, y más de 82 % no germinan en NYDB (r = – 0.284, con relación al testigo). Cuando la levadura fue separada del patógeno por el filtro, la germinación de los conidios contenidos en jugo de manzana se inhibe en 79 % o más, y en el caso NYDB a 20 y 40 %, la germinación se inhibe en 75 y 77 %, respectivamente (Cuadro 6). La similitud entre las frecuencias de clase obtenidas para los dos tratamientos (con y sin filtro) es aún mayor que en las dos levaduras anteriores (r = 0.999).

Resultados similares a los observados en este trabajo para estas tres levaduras, donde la competencia por nutrientes parece desempeñar un papel importante en el efecto antagónico, se reportan en P. digitatum por Debaryomyces hansenii (Droby et al., 1998) y en B. cinerea por Cryptococcus spp. (Filonow et al., 1996). La exclusión preventiva de los sitios de infección fúngicos por el antagonista fue observada en Candida oleophila y Cryptoccocus laurentii empleadas para el control de B. cinerea (Roberts, 1990; Mercier y Wilson, 1994).

Además, Zhou et al. (2011) obtuvieron una reducción de 100 a 20 % en la tasa de germinación y una reducción del tubo germinativo de 50.0 µ. a 10.25 µ. de esporas de Rhizopus stolonifer incubadas en PDB (caldo papa dextrosa) en presencia de Bacillus subtilis fmbj a 10⁸ ml^–1. Por su parte, Zhang et al. (2011) observaron una reducción en la germinación de esporas de Botrytis cinerea de 91.7 a 12.3 % cocultivadas con Pichia guilliermoundii M8 a 1 x 107 ml^–1, y concluyeron que uno de los modos de acción de este antagonismo es la competencia por nutrientes, particularmente azúcares y nitrógeno. Por otro lado, Li et al. (2011) reportan una reducción en la germinación de esporas de P. expansum y B. cinerea incubadas en PDB en presencia de Rhodotorula mucilaginosa de 81.9 y 82.8 %, respectivamente.

La cepa de levadura 22–111 también redujo significativamente la germinación de los conidios en NYDB (más de 89 %) y en jugo (más de 82 %) (r = –0.280, con relación al testigo), pero, a diferencia de las otras tres levaduras, cuando estuvo separada por el filtro los conidios del patógeno en NYDB 40 % germinaron en 100 %, y el máximo porcentaje de inhibición fue de 23 y 27 % en jugo a 5 % y 10 %, respectivamente (Cuadro 7). La distribución de los índices de germinación es totalmente distinta cuando el hongo se encuentra en contacto con el antagonista que cuando se separa por la membrana, con un coeficiente de correlación negativo y muy pequeño r = –0.303, totalmente diferente al de las otras tres levaduras. Puesto que no se apreció la producción de sustancias antimicóticas para esta levadura, los resultados obtenidos son compatibles con la interacción directa entre el antagonista y el patógeno. Esto coincide con lo reportado por Bonaterra et al. (2003), quienes observaron una reducción de 95.7 a 2.0 % y de 98.0 a 1.3 % de la germinación conidial de Rhizopus stolonifer y Monilinia laxa, respectivamente, cuando fueron cocultivadas con células de P. agglomerans (1 x 10⁸ ml^–1) en jugo de nectarina a 5 %, efecto que no fue detectado cuando el antagonista y los patógenos fueron separados por un filtro de membranas que admitía físicamente el cruce de nutrientes y de metabolitos, ya que la germinación fue de 92.0 y 96.0 %, respectivamente.

Finalmente, el análisis de las sumas de los índices de germinación (Cuadro 8) confirma los resultados arriba expuestos. Para las levaduras 38–432, 22^–2_4a y 24^–2_3a el índice de germinación de P. expansum obtenido en presencia de la levadura (con y sin filtro) es significativamente inferior (P ≤ 0.05) al que se obtiene incubando solas las esporas del patógeno, lo que es compatible con un modo de acción por competencia por nutrientes y/o espacio. En el caso de la levadura 22–111, cuando se separa del patógeno por medio del filtro, se obtiene un índice de germinación estadísticamente igual al observado en el patógeno sin el antagonista, lo cual es compatible con una interacción directa entre éstos. En el mismo cuadro, la no significancia entre bloques en todas las levaduras muestra que el medio de cultivo no afectó la germinación de las esporas.

 

CONCLUSIONES

Las levaduras antagónicas 38–432, 24^–2_3a y 22^–2_4a mostraron, en el bioensayo realizado, un comportamiento compatible con un modo de acción por competencia por nutrientes con el patógeno. Por el contrario, la cepa 22111 manifestó un modo de acción basado en la interacción directa con el patógeno. Bajo las condiciones de este estudio, ninguna de las cuatro levaduras evaluadas mostró un modo de acción por antibiosis.

 

LITERATURA CITADA

ADEBAYO, C.; ADERIYE B. 2011. Suspected mode of antimycotic action of brevicin SG1 against Candida albicans and Penicillium citrinum. Food Control 22: 1814–1820.         [ Links ]

ANDREWS, J. H., HARRIS, R. F., SPEAR, R. N., LAU, G. W., NORDHEIM, E. V. 1994. Morphogenesis and adhesion of Aureobasidium pullulans. Canadian Journal of Microbiology 40: 6–17.         [ Links ]

BASHA, S.; ULAGANATHAN, K. 2002. Antagonism of Bacillus species (strain BC121) towards Curvularia lunata. Current Science 82(12): 1457–1463.         [ Links ]

BONATERRA, A.; MARI, M.; CASALINI, L.; MONTESINOS, E. 2003. Biological control of Monilinia laxa and Rhizopus stolonifer in postharvest of stone fruits by Pantotea agglomerans EPS125 and putative mechanisms of antagonism. International Journal of Food Microbiology 84: 93–104.         [ Links ]

CAMPBELL, R. 1989. Biological Control of Microbial Plant Pathogens. Cambridge University Press. Cambridge, England. 218 p.         [ Links ]

CASTAÑO, T. E.; DOMÍNGUEZ, D. J. 2010. Diseño de Experimentos: Estrategias y Análisis en Ciencia y Tecnología. Universidad Autónoma de Querétaro. Qro. México. 418 p.         [ Links ]

CASTORIA, R.; DE CURTIS, F.; LIMA, G.; CAPUTO, L.; PACIFICO, S.; DE CICCO, V. 2001. Aerobasidium pullulans (LS–30) an antagonist of postharvest pathogens of fruits: study on its modes of action. Postharvest Biology and Technology 22(1): 7–17.         [ Links ]

DROBY, S.; CHALUTZ, E. 1994. Mode of Action of Biocontrol Agents of Postharvest Diseases, pp: 63–75. In: Biological Control of Postharvest Diseases: Theory and Practice. WILSON, C. L.; WISNIEWSKI, M. E. (eds.). CRC Press Inc., Boca Raton, EE.UU.         [ Links ]

DROBY, S.; COHEN, A.; WEISS, B.; HOREV, B.; CHALUTZ, E.; KATZ, H.; KEREN, M.; SHACHNAI, A. 1998. Commercial testing of Aspire: a yeast preparation for the biological control of postharvest decay of citrus. Biological Control 12: 97–100.         [ Links ]

EDWARDS, S. G.; SEDDON, B. 2001. Mode of antagonism of Brevibacillus brevis against Botrytis cinerea in vitro. Journal of Applied Microbiology 91(4): 652–659.         [ Links ]

EL–GHAOUTH, A.; SMILANICK, J. L.; BROWN, G. E.; IPPOLITO, A.; WILSON, C. L. 2001. Control of decay of apple and citrus fruits in semicommercial tests with Candida saitoana and 2–Deoxy–glucose. Biological Control 20(2): 96–101        [ Links ]

FILONOW, A. 1998. Role of competition for sugars by yeasts in the biocontrol of gray mold of apple. Biocontrol Science and Technology 8: 243–256.         [ Links ]

FILONOW, A. B.; VISHNIAC, H. S.; ANDERSON, J. A.; JANISIEWICZ, W. J. 1996. Biological control of Botrytis cinerea in apple by yeasts from various habitats and their putative mechanisms of antagonism. Biological Control 7: 212–220.         [ Links ]

GUELDNER, R. C.; REILLY, C.; PUSEY, P. L.; COSTELLO, C. E.; ARRENDALE, R. F.; COX, R. H.; HIMMELSBACH, D. S.; CRUMLEY, F. G.; CUTLER, H. G. 1988. Isolation and identification of iturins as antifungal peptides in biological control of peach brown rot with Bacillus subtilis. Journal of Agricultural and Food Chemistry 36(2): 366–370.         [ Links ]

JANISIEWICZ, W. J.; KORSTEN, L. 2002. Biological control of postharvest diseases of fruits. Annual Review of Phytopathology 40: 411–441.         [ Links ]

JANISIEWICZ, W. J.; LEVERENTZ, B.; CONWAY, W. S.; SAFT–NER, R. A.; REED, A. N.; CAMP, M. J. 2003. Control of bitter rot and blue mold of apples by integrating heat and antagonist treatments on 1–MCP treated fruits stored under controlled atmosphere conditions. Postharvest Biology and Technology 29: 129–143.         [ Links ]

JANISIEWICZ, W. J.; TWORKOSKI, T. J.; SHARER, C. 2000. Characterizing the mechanism of biological control of post–harvest diseases on fruits with a simple method to study competition for nutrients. Phytopathology 90: 1196–1200.         [ Links ]

JANISIEWICZ, W. J.; YOURMAN, L.; ROITMANN, H. J.; MA–HONEY, N. 1991. Postharvest control of blue mold and gray mold of apples and pears by dip treatment with pyrrolnitrin, a metabolite of Pseudomonas cepacia. Plant Disease 75: 490–494.         [ Links ]

KHAMNA, S.; YOKOTA, A.; PEBERTY, J. F.; LUMYONG, S. 2009. Antifungal activity of Streptomyces spp. Isolated from rhizosphere of Thai medicinal plants. International Journal of Integrative Biology 6: 143–147.         [ Links ]

LI, R.; ZHANG, H.; LIU, W.; ZHENG, X. 2011 Biocontrol of post–harvest gray and blue mold decay of apples with Rhodo–torula mucilaginosa and possible mechanisms of action. International Journal of Food Microbiology 146(2): 151–156.         [ Links ]

MARI, N., GUIZZARDI, M., PRATELLA, G. C. 1996. Biological control of gray mold in pears by antagonistic bacteria. Biological Control 7: 30–37.         [ Links ]

MERCIER, J.; WILSON, C. L. 1994. Colonization of apple wounds by naturally occurring microflora and introduced Candida oleophila and their effect on infection by Botrytis cinerea during storage. Biological Control 4: 138–144.         [ Links ]

PASICHNYK, L. A., HVOZDIAK, R. I., KHODOS, S. F. 2005. Physical linkage of Tn3 and part of Tn1721 in tetracycline and ampicillin resistance plasmid from Salmonella thyphimuri–um. Journal of Antimicrobial Chermotherapy 55: 562–565.         [ Links ]

POPPE L.; VANHOUTTE, S.; HÕFTE, M. 2003. Modes of action of Pantoea agglomerans CPA–2, an antagonist of posthar–vest pathogens on fruits. European Journal of Plant Pathology 109: 963–973.         [ Links ]

ROBERTS, R. G. 1990. Postharvest biological control of gray mold of apple by Cryptococcus laurentti. Phytopathology 80: 526–530.         [ Links ]

SÁNCHEZ V., S. E.; MARTÍNEZ P., R. Á.; CASTILLO T., J.; FERNÁNDEZ E., E. 2008. Antagonismo de levaduras nativas contra la pudrición azul (Penicillium expansum LINK) en manzanas en poscosecha. Revista Fitotecnia Mexicana 31(4): 359–366.         [ Links ]

SOTO, M. L.; MARTÍNEZ P., R. Á. 2009. Efecto de levaduras antagónicas y bicarbonato de sodio sobre Penicillium expan–sum Link en dos variedades de manzana. Revista Chapingo Serie Horticultura 15(2): 211–215.         [ Links ]

SPOTTS R. A.; CERVANTES, L. A.; MIELKE, E. A. 1999. Variability in postharvest decay among apple cultivars. Plant Disease 83: 1051–1054.         [ Links ]

USALL, J.; NÚÑEZ, C.; TEIXIDÓ, N.; MIRÓ, M.; VIÑAS, I. 2001. Nutritional enhancement of biocontrol activity of Candida sake (CPA–1) against Penicillium expansum on apples and pears. European Journal of Plant Pathology 107: 543–551.         [ Links ]

VIÑAS, I.; TEIXIDÓ, N.; ABADIAS, M.; COSTA, J.; USALL, J. 2002. Producción, formulación y mejora de bacterias y levaduras para su aplicación en el control biológico de enfermedades. Phytoma 144: 107–113.         [ Links ]

WICHITRA, L.; PUNPEN, H.; SAMERCHAI, C. 2008. Growth inhibitory properties of Bacillus subtilis strainsand their metabolites against the green mold pathogen (Penicillium digitatum Sacc.) of citrus fruit. Postharvest Biology and Technology 48: 113–21.         [ Links ]

WILSON, C. L.; WISNIEWSKI, M. E. 1989. Postharvest biological control of Penicillium rots of citrus with antagonistic yeast and bacteria. Science Horticulturae 40: 105–112.         [ Links ]

ZHANG, D.; SPADARO, D.; GARIBALDI, A.; GULLINO, M. L. 2011. Potential biocontrol activity of a strain of Pichia guilliermondii against grey mold of apples and its possible modes of action. Biological Control 57: 193–201.         [ Links ]

ZHOU, X.; LU, Z.; LV, F.; ZHAO, H.; WANG, Y.; BIE, X. 2011. Antagonistic Action of Bacillus subtilis strain fmbj on the post–harvest pathogen Rhizopus stolonifer. Journal of Food Science 76(5): M254–M259.         [ Links ]